胶滴肿瘤药敏检测技术(cd-dst)的建立及临床应用研究doc

胶滴肿瘤药敏 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 技术(cd-dst)的建立及临床应用研究doc 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 论文题目 胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立 及临床应用研究 研 究 生: 梁智 导 师: 张伟 研究员 学科专业: 细胞生物学 研究方向: 药敏检测技术 所在所院: 肿瘤医院 肿瘤研究所 入学时间: 2003年9月 二零零六年五月 - 1 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 目录 缩略语表-----------------------------------------------------------1 中文摘要-----------------------------------------------------------2 英文摘要-----------------------------------------------------------4 前言---------------------------------------------------------------6 ---------9 材料与方法------------------------------------------------实验材料 1. 实验细胞系 2. 主要实验仪器 3. 主要试剂和耗材 4. 病人资料及肿瘤标本 实验方法 1. 主要试剂的配制 2. 细胞的复苏与冻存 3. 不同培养条件对肿瘤细胞生长支持度的测定 3.1. 所用培养基对肿瘤细胞系生长支持度的测定 3.2. 所用培养基对原代肿瘤细胞系生长支持度的观察 3.3. I型胶原蛋白包被对肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞生长支持度的观察 - 2 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 4. 胶滴肿瘤药敏检测(CD-DST)的建立 4.1. 利用肿瘤细胞系建立胶滴培养技术 4.2. 胶滴培养药敏技术的药物测试浓度 4.3. 原代肿瘤细胞的体外胶滴肿瘤药敏检测 5. ATP-TCA法药敏检测 结果--------------------------------------------------------------23 1.胶原包被对肿瘤细胞生长状态的影响 2.所用培养基对肿瘤细胞生长支持度的动态观察 3.肿瘤细胞在胶滴培养中生长状态的观察 4.药物体外的杀伤作用 5.图像的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 6.CD-DST法与ATP-TCA二种技术的相关性比较 7.CD-DST法的标本可评价率 8.肿瘤标本对化疗药物的体外敏感性 讨论--------------------------------------------------------------35 结论--------------------------------------------------------------45 参考文献----------------------------------------------------------45 文献综述----------------------------------------------------------45 致谢--------------------------------------------------------------23 - 3 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 缩略语表 缩略语 英文名 中文名 Collagen gel droplet culture CD-DST 胶滴肿瘤体外药敏检测技术 drug-sensitivity test ATP bioluminescence ex vivo ATP生物荧光肿瘤体外药物ATP-TCA tumor chemosensitivity assay敏感性检测 MTT Methylthiazoletetrazolium 四唑蓝 HTCA Human tumor clonogenic assay 软琼脂克隆形成实验 Differential staining DiSC 差异染色细胞毒检测 cytotoxicity assay IC Inhibition concentration 50%杀伤 50%肿瘤细胞所需药物浓度 50 FBSFetal bovine serum 胎牛血清 ODOp tical density 光密度值 - 4 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立 及临床应用研究 中文摘要 目的:建立胶滴肿瘤体外药敏检测技术，探讨其在肿瘤个体化治疗中应用的可行性。 方法:用人类肿瘤细胞系建立胶滴肿瘤体外药敏检测技术;并用该技术对50例不同肿瘤类型的原代肿瘤标本进行药敏检测实验研究，其中包括妇科恶性肿瘤18例，胃肠道恶性肿瘤15例，白血病/淋巴瘤8例，肺癌 5例，肝癌4例。每种肿瘤标本分别进行了4-5种包括阿霉素 (ADM)、 5-氟脲嘧啶 (5-FU)、顺铂 (DDP)、丝裂霉素 (MMC)、紫杉醇(PTX)、草酸铂(L-OHP)和健择(GEM)等抗肿瘤药物的敏感性测定。 结果:在体外成功建立了胶滴肿瘤药敏检测技术，并确定了胶滴肿瘤体外药敏检测技术的最佳条件;该技术与ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)相 3比具有较好的相关性;该技术检测所需标本量小(3×10个细胞/滴)可扩大其应用范围;实验证实该技术可反映病人对不同抗肿瘤药物敏感性的差异;标本整体评价率为82.0%(41/50);检测结果与临床经验有效率间有较好的符合性。 结论:CD-DST法体外肿瘤药敏检测技术是一种较好的药敏检测方法，标本可评价率为82.0%(41/50)，所需标本量小的特点使其扩大了在临床上的应用范围。该技术可反映病人对不同抗肿瘤药物敏感性的差异，检测结果与临床经验有效率有较好的符合性。因此该药敏检测方法对抗肿瘤药物筛选和对个体化治疗具有实际应用价值。该技术的建立填补了国内该领域的空白。 关键词:肿瘤 药敏检测 胶滴肿瘤药敏检测技术 - 5 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 The Establishment of Collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST) Techniques and Its Clinical Application Abstract OBJECTIVE: To establish Collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST) technique and explore its clinical feasibility of application. METHODS: The human tumor cell lines were used to find out the best culture conditions of collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST). The chemosensitivity of 4 or 5 anticancer drugs (ADM, DDP,MMC,PTX,L-OHP, GEM, 5-FU,etc.)was assessed by the CD-DST in the ovarian and uterine cancer(n=18), gastrointestinal cancer(n=15),lymphoma and leukaemia(n=8), lung cancer(n=5),liver cancer(n=4)。 RESULTS: We established the collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST) by using the human tumor cell lines. The CD-DST can evaluate the efficacy of anticancer drugs in diverse kinds of tumor specimen, and has good correlation with other chemosensitivity assay methods. Furthermore, the CD-DST has the advantage of using a 3 comparatively small number of cells(3×10cell/30μl), which can solve the issue of minor specimen source.The CD-DST can reflect the differences of anticancer drugs sensitivity in different patients with the good clinical correlation and an overall predicting value of 82.0%(41/50). CONCLUSION: There were considerable differences in - 6 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 chemosensitivitybetween individuals. The CD-DST is a good chemosensitivity assay methods with the advantage of high overall predicting value and a comparatively small number of cells, so that it solve the issue of minor specimen source. There was a statistically can correlation between clinically reported response rates and the response rates obtained by CD-DST. It appears to be useful in exploring the possible combination plots and principles, evaluating the efficacy of existing chemotherapy, and optimize chemotherapy on an individual basis. Our research also filled the blank in this field of our country. Key Words: Tumor Chemosensitivity assay CD-DST - 7 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立 及临床应用研究 前言 恶性肿瘤是一大类严重威胁人类生命和健康的疾病。化学治疗在恶性肿瘤综合治疗中占有越来越重要的地位，但目前化疗的疗效仍不理想。肿瘤本身存在着异质性，即便同一组织学类型，分化程度相同的肿瘤对同一药物的敏感性不同。例如胃癌患者的单药有效率仅为15%-30%，丝裂霉素(MMC)有效率为30%，氟尿嘧啶(5-FU)有效率为21%，表阿霉素(EDI)有效率为19%，联合化疗的有效率 [1]也仅为30%-50%。由于化疗药物一般都具有较强的毒性，不当的化疗既给患者造成痛苦，又不能缓解病情，更重要的是有可能诱发多重耐药，导致治疗失败。因此如何更有效地筛选应用抗癌药，预测个体肿瘤对药物的敏感性，指导临床治疗以提高疗效早已成为临床化疗界瞩目的问题。 近年来肿瘤药敏试验指导的个体化治疗的研究，受到国内外肿瘤界的重视。国际上相继建立了一系列体内、外药物敏感性试验技术。大量国外临床研究表明肿瘤体外药敏检测与临床疗效存在一定的相关性，体外药敏检测能够较好的指导 [2-7]临床用药，提高临床疗效以及延长病人的生存期。因此为了提高疗效，减少不必要的毒副作用，防止多重耐药性的产生，有必要对肿瘤患者个体的药物敏感性进行测试,特别在目前抗癌药物日趋增多的形式下，帮助患者选择其中敏感药物，显得尤为重要。临床上迫切需要切实可行的检测方法进行药敏试验，以期制定最佳化疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，提高化疗疗效。 理想的肿瘤原代细胞药敏体系的目标在技术层面上应该满足如下条件:(1)需要的肿瘤组织较少，不影响其他病理检查对肿瘤标本的需求。(2)实验结果成 - 8 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 功评价率高;(3)具有较好的结果重复性;(4)体外实验结果与药物体内疗效有较 [8]好的符合率。为了建立上述理想的药敏体系，人们对此进行了长期的实验探讨。 目前，体外检测肿瘤对化疗药物敏感性的方法主要有软琼脂克隆形成实验(HTCA)〔9〕〔10〕〔11〕〔12〕〔13〕〔14〕、四唑蓝比色法 (MTT) 、差别染色细胞毒检测法(DiSC)和三磷 〔15〕〔16〕酸腺苷生物发光法(ATP-TCA)等体外药敏试验，均取得了一定的效果。但 )，限制了它们在临床上的应用前景。同时大部是这些方法又有各自的不足(表1 分体外药敏检测技术均存在所需细胞数量多，不能解决小量标本进行药敏检测的问题。 表1 各种常用体外药敏检测方法的特点 优点 缺点 软琼脂克隆形成实验(HTCA) 费用较低 需要活细胞的数量较大 技术要求高 标本可评价率较低 实验周期长(4-6 周) 集落计数费时费力，主观性强 四唑蓝比色法 (MTT) 标本可评价率较高需要活细胞的数量较大 费用较低 无法直接测定吸光度值 操作繁琐 灵敏度低 差别染色细胞毒检测法(DiSC) 不需要单细胞悬液 标本 评价成功率较低 不依赖细胞的分裂 易受人为因素影响， 仅应用于血液系统标本 三磷酸腺苷生物发光法标本可评价率较高 间质细胞干扰较大 (ATP-TCA) 检测效率高 体内体外符合率较高 自动化程度较高 - 9 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 [17] 1979年，Yang J等建立了一种新型体外细胞培养技术，将乳腺癌上皮细胞种植到胶原中形成三维立体结构，从而达到使其生长环境类似于体内的状态。 [18]1997年Kobayashi H等采用此种细胞培养技术，结合其它体外药敏试验优点，报道了胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)这种新的体外药敏检测技术。至今为止，该技术在肿瘤体外药敏检测中的应用研究已经有十余年的历史。CD-DST技术，具 3×10个细胞/滴)、敏感性高及临床相关性好等突出技术特有所需细胞数量少(3 [19]点。作为一种前途广阔的新的体外药敏检测技术，其在临床治疗研究和有效药物筛选中的应用已得到肯定。 由于该技术的建立存在一定的技术难度，故国内尚无用胶滴肿瘤药物敏感性检测技术进行肿瘤药敏试验的报道。因此本研究拟建立胶滴肿瘤药物敏感性检测技术，并对肿瘤组织进行了体外药物敏感性检测，为临床肿瘤用药方案选择提供 依据。 了实验 - 10 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 材料与方法 ——实验材料 1. 实验细胞系 人乳腺癌细胞系MCF-7 人肺腺癌细胞系A549 人结肠腺癌细胞系HCT-116 小鼠黑色素瘤细胞系B16 均为本室保存。 2. 主要实验仪器 51H二氧化碳细胞培养箱(Fisher Scientific) MPL1生物荧光测定仪(Berthold) IMT-2型倒置显微镜 (Olympus) Dh-cg300图像分析系统 (中国大恒集团有限公司) 3. 主要试剂和耗材 I型胶原蛋白 购自Fulka 公司 RPMI 1640培养基 购自Hyclone 公司 IMDM培养基 购自Hyclone 公司 F12培养基 购自Hyclone 公司 胎牛血清 购自Hyclone 公司 胶原酶I型 购自SIGMA公司 透明质酸酶 购自SIGMA公司 阿霉素 (ADM) 深圳万乐药业 5-氟脲嘧啶 (5-FU) 齐鲁制药厂 顺铂 (DDP) 齐鲁制药厂 依托泊苷(VP-16) 齐鲁制药厂 - 11 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 诺维本(NVB) 江苏连云港豪森制药有限公司 丝裂霉素 (MMC) 协和发酵工业株式会社 紫杉醇(PTX) 协和制药厂 草酸铂(L-OHP) 江苏恒瑞医药股份有限公司 健择(GEM) 礼来公司 购自Costar 公司 细胞培养板(24孔) 细胞培养板(96孔) 购自Costar 公司 ATP-TCA试剂盒 北京金紫晶生物医药技术有限公司 4. 病人资料及肿瘤标本 新鲜肿瘤组织、腹水或采集2005年7月至2006年4月我院和外院的50例 淋巴结，所有病例均经病理或细胞学证实。其中妇科恶性肿瘤18例，消化道恶性肿瘤19例，淋巴瘤8例，肺癌 5例，病人资料和临床分期见表2。 - 12 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 表2 病人资料和临床分期 临床分期 性别 标本来源 例肿瘤类型 病理分型 平均年龄 数 ?,?,女 实体瘤 胸腹水 男?? 卵巢癌 1111例卵巢上皮性癌 3 8 49.2(22, 65) 0 11 8 3 妇科 恶性6例子宫内膜样腺癌 子宫内肿瘤 7 1 646.3(27, 70) 0 7 6 1 膜癌 1例浆液性腺癌 8例结肠腺癌大肠癌12 3 958.2(39, 68) 6 6 12 0 消化4例直肠腺癌 道恶 性肿胃癌 3 3例胃腺癌 03 56.3 (52,63) 30 3 0 瘤 肝癌 4 肝细胞癌 13 50.8 (51,65) 3 1 4 0 2例急性髓性白血病 M2型 2例B淋巴细胞,急 性淋巴细胞白血病 白血病/淋巴瘤8 2例 T淋巴细胞,急545.0 (35, 73) 5 3 2 6 3 性淋巴细胞白血病 1例弥漫性大B细胞 淋巴瘤 1例非霍杰金淋巴瘤 4例中分化鳞癌 肺癌 5 3 2 57.3(46,70) 4 1 4 1 1例大细胞肺癌 总计 50 14 36 51.9(22,73) 2129 39 11 - 13 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 材料与方法 ——实验材料 1. 主要试剂的配制 1.1. 胶原蛋白溶液: 1.1.1. 胶滴中胶原蛋白溶液:无菌条件下称取I型胶原蛋白9mg溶解于0.1% 的乙酸溶液至3ml，终浓度为3mg/ml，-20?保存。 1.1.2. 胶原蛋白包被溶液:I型胶原蛋白配制为浓度3mg/ml的储存液,使用 2PBS溶液稀释，包被时胶原蛋白浓度为10μg/cm。 1.2. 培养基: 1.2.1. RPMI 1640 培养基:10.4g 1640 粉剂加去离子水至1000ml，加入青霉 素和链霉素终浓度分别为100U/ml和100μg /ml，NaHCO调节 PH 值3 到 7.1，无菌过滤后分装4?保存。 1.2.2. 含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养基: 用前将10ml FBS加入 90ml RPMI 1640培养基中，4?保存可使用一周。 1.2.3. IMDM 培养基:17.7g IMDM粉剂加去离子水至1000ml，加入青霉素和 链霉素终浓度分别为100U/ml和100μg /ml，NaHCO调节 PH 值到 7.1，3 无菌过滤后分装4?保存。 1.2.4. 含 10% FBS 的IMDM 培养基: 10 ml FBS加入 90mlIMDM培养基中以 及表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松等多种添加剂成分，4?保存可 使用一周。 1.2.5. 10×F12培养基:10.2g F12粉剂加去离子水至100ml，加入青霉素和 链霉素终浓度为1000U/ml和1000μg /ml，无菌过滤后分装4?保存。 2. 3(缓冲液: HEPES 4.8g - 14 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 NaOH 0.2g NaHCO 33.0g 3 加去离子水至100ml，高压蒸汽灭菌(10磅，20分钟)，4?保存。 4. 消化液: 500mg 胰蛋白酶粉剂加入D-PBS溶液至200ml，终浓度为0.25%，调 节 PH 值至 8.0 左右，无菌过滤后分装4?保存。 5. 组织消化酶: I型胶原酶和透明质酸酶加入100ml的RPMI 1640培养基中，终 浓度分别为200U/ml和100U/ml，-20?保存。 6. 化疗药物: ADM 储存液(1.6mg/ml)、5-FU 储存液(30.0mg/ml)、DDP 储存液 (0.8mg/ml)、PTX储存液(2.0mg/ml)、GEM储存液(5.0mg/ml)、L-OHP 储存液 (1.0mg/ml)、VP-16 储存液(3.2mg/ml)、NVB 储存液(1.6mg/ml)、4-HC(环膦 酰胺体内活化物)(25μg/ml)、MMC 储存液(0.08mg/ml),以上储存液均由无菌 生理盐水配制而成，避光-80?冻存保藏。 7.中性红储存液: 1)5g中性红加去离子水至500ml 2)加入20ml的醋酸盐缓冲液 无水乙酸钠 1.53 g 乙酸(冰醋酸) 0.60 ml 加去离子水至500ml，调节 PH 值到4.8 3)无菌过滤后分装4?保存 8. Hanks’平衡盐溶液 NaCl 8.00 g KCl 0.40 g CaCl 0.14 g 2 MgSO•7HO 0.20 g 42 NaHPO•HO 0.06 g 242 - 15 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 KHPO 0.06 g 24 NaHCO 0.35 g 3 葡萄糖 1.00 g 酚红 0.02 g 加去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌(10磅，20分钟)，用无菌NaHCO溶液3 调节Hanks’平衡盐溶液pH值至7.2,7.4后分装4?保存。 9. PBS溶液 NaCl 8.00g KCl 0.20g KHPO 0.20g 24 NaHPO•HO 1.56g 242 加去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌(10磅，20分钟)，分装4?保存。 二、细胞的复苏与冻存 1.细胞的复苏与传代 人乳腺癌细胞系MCF-7 、人肺腺癌细胞系A549、人结肠腺癌细胞系HCT-116和小鼠黑色素瘤细胞系B16均在液氮中保存。进行实验时，将保存细胞的冻存管从液氮中取出，直接投入 37? 温水中，融化后，从水浴中取出冻存管，1000 转/分 离心 5分，弃上清，重复用培养基洗一次，用含 10,FBS 的 RPMI 1640培养基适当稀释后，接种于培养瓶中，在37? 5% CO培养箱静置培养，次日更换一次2 培养基，待细胞生长至贴壁细胞铺满瓶壁 80,时，弃去培养基，加 2ml 消化液进行消化传代。消化 2,3分钟后，弃去消化液，加入 5,6 ml 含 10, FBS 的RPMI 1640 培养基,吹打分散细胞，置5% CO、37?细胞培养箱内培养，3天传代1次。 2 2.细胞的冻存 实验结束后，要将细胞再次冻存于液氮中，以备以后使用。步骤如下:待细胞生长良好，处于对数生长期，细胞活性>95%时冻存。前一天换一次培养基，冻存时， - 16 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 用 0.25%胰酶将贴壁生长的细胞消化下来，收集于离心管中并计数，离心(1000 转/分，5 分钟)，弃上清，加入配制好的冻存培养基[含 10%二甲基亚砜(DMSO)和 650%FBS的培养基]，冻存培养基中细胞的最终浓度为 5×10/ml 左右，将细胞悬液分装入无菌冻存管中，每管加液 1ml。将存有细胞的冻存管放入-70 ?冰箱过夜，取出后移入液氮容器内，标记好并装入支架，液氮中保存。 三、不同培养条件对肿瘤细胞生长支持度的测定 1.所用培养基对肿瘤细胞系生长支持度的测定 取对数生长期的人乳腺癌细胞系MCF-7和肺腺癌细胞系A549，经消化液消化后，用RPMI 1640培养基洗2遍，然后计数，用待测培养基和10, FBS 的RPMI 41640 培养基分别调整细胞浓度为1.5或2×10个/ml，接种于96孔培养板，接种量MCF-7为1500个/孔，A549为2000个/孔。置5% CO、37?细胞培养箱内培2 养,每天提取ATP。各孔加入ATP提取液50μl，孵育5分钟后，各吸取50 μl加入荧光测定板中，加入50 μl ATP检测液，置荧光测定仪上测定各孔在560nm波长处荧光强度，连续测定7天。 2.所用培养基对原代肿瘤细胞系生长支持度的观察 首先在无菌条件下去除肿瘤标本的脂肪、坏死及血污组织，生理盐水冲洗， 3用眼科剪刀将肿瘤组织块剪成0.5,1mm碎块，置于50ml离心管中，加入10ml组织消化酶，于37?培养箱中，每隔15,30分钟混合一次，消化2,3小时。消化完毕后，通过160目的筛网过滤，移去未被消化的组织碎块，获得单细胞悬液。1000转/分，离心10分钟，吸除上清液，用RPMI 1640培养基洗涤一次，台盼兰 5排斥染色法计数。用含10,FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为2,4×10 4个细胞/ml，接种于96孔培养板，2,4×10个细胞/孔，培养6天，每天观察细胞的状态。 3. I型胶原蛋白包被对肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞生长支持度的观察 根据培养瓶的表面积，将I型胶原蛋白储存液用PBS溶液稀释至胶原蛋白浓度 2为10μg/cm。将配好的胶原蛋白包被液加入到培养瓶中，将培养瓶水平放置在4? - 17 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 过夜。第二天将培养瓶内的胶原蛋白包被液贴壁尽量吸出，放入超净台内干燥后备用。 肿瘤细胞系及来源于肿瘤标本的单细胞悬液分别接种在已包被和未包被的培养瓶(板)，每天观察细胞的状态。 四、胶滴肿瘤药敏检测(CD-DST)的建立 人体肿瘤组织是由肿瘤细胞、正常细胞和细胞外基质共同组成的细胞群体，肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细胞生长具有重要影响。利用I型胶原蛋白凝胶在37?时能够形成三维立体结构的特点，在体外模仿了体内肿瘤细胞生长的微环境，使肿瘤细胞能够在与体内环境相似的条件下生长，生长的肿瘤细胞具有与体内相似的细胞形态特点。 如图1所示，CD-DST技术利用胶原酶消化细胞外基质，将肿瘤单细胞包埋于?型胶原中，形成胶原凝胶，肿瘤细胞在三维立体环境中生长，然后在近似于体 [18]内环境的条件下评定药物对细胞的作用。 图1 CD-DST技术原理 1. 利用肿瘤细胞系建立胶滴培养技术 肿瘤细胞系生长至贴壁细胞铺满瓶壁 80,时，加 2ml 消化液进行消化，获得单细胞悬液，台盼兰排斥染色法计数。在冰浴的条件下，将I型胶原蛋白溶液、10×F12培养基和缓冲溶液按体积比8:1:1混合制成胶原蛋白混合溶液。将准 5备的肿瘤细胞悬液加入胶原蛋白混合溶液，调整到细胞浓度为1×10个/ml。在冰浴的条件下，将胶原蛋白-细胞混合溶液接种于6孔细胞培养板，每孔均接种3 - 18 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 滴(30μl/滴)，接种量为3000个细胞/滴，将培养板置于5% CO、37?细胞培2养箱内1小时以形成胶滴，再加入含10% FBS的IMDM 培养基，进行培养。 2. 胶滴培养药敏技术的药物测试浓度 [20-24]国外研究报道表明，只有在合适的抗肿瘤药物测定浓度的条件下(表3)， 具有较好的相关性。 测定的体外抗肿瘤药物敏感性与体内治疗结果才 表3 药物的测试浓度 药物 药物浓度(μg/ml) 药物作用时间(小 时) MMC 0. 0324 DDP 1. 00 24 NVB 0. 05 24 5-FU 0(02 24 ADM 0. 02 24 VP-16 0. 10 24 PTX 0(50 24 L-OHP 1(00 24 GEM 2. 50 24 3. 原代肿瘤细胞的体外胶滴肿瘤药敏检测 3.1胶滴内肿瘤细胞培养 图2为CD-DST的原代肿瘤组织标本体外药敏的操作流程。来源于肿瘤标 4本的单细胞悬液，细胞浓度为3×10个/ml，接种于I型胶原蛋白包被的培养 瓶中置于5% CO、37?细胞培养箱内培养24小时。弃去未贴壁的死细胞，加2 2 ml消化液进行消化，获得单细胞悬液，台盼兰排斥染色法计数。在冰浴的 条件下，将I型胶原蛋白溶液、10×F12培养基和缓冲溶液按体积比8:1:1 混合制成胶原蛋白混合溶液，将准备的肿瘤细胞悬液加入胶原蛋白混合溶液， - 19 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 5调整到细胞浓度为1×10个/ml。在冰浴的条件下，将胶原蛋白-细胞混合溶 液接种于6孔细胞培养板，每孔均接种3滴(30μl/滴)，接种量为3000个 细胞/滴，将培养板置于5% CO、37?细胞培养箱内1小时以形成胶滴。加入2 含10%FBS的IMDM 培养基，进行培养。 新鲜标本组织 Day 1酶消化 胶原包被的培养瓶中培养 Day 2 胶滴中培养 Day 3 加入抗肿瘤药物 Day 4 清洗除去抗肿瘤药物后继续培养 Day 5,9 中性红染色固定 图像分析处理 图2 CD-DST方法流程图 3.2 药物敏感性测试 细胞培养板置于5% CO、37?细胞培养箱内培养24h后，在培养板中加2 入抗癌药物，同时设不加药阴性对照孔。置5% CO、37?细胞培养箱内培养。2 - 20 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 在药物作用下培养24小时，加入3ml Hanks’平衡盐溶液清洗并除去抗癌药物，加入4ml 10% FBS的IMDM培养基， 继续培养7天。 药物敏感性测试:在培养板中加入中性红溶液，终浓度为50μg/ml。将培养板置于5% CO、37?细胞培养箱内2小时进行染色。弃去培养板内液体，2 加入10%的甲醛溶液进行固定，15分钟后用去离子水洗去甲醛溶液。 -cg300图像分析系统通过倒置显微通过中性红染色固定干燥后，利用Dh 镜对胶滴中细胞的染色情况进行扫描，结果传输计算机。通过图像软件，对图像进行分析。该图像软件是肿瘤生物检测中心和北京大学计算机研究所合作，利用Visul C + +进行该图像软件程序研发。图像分析处理原理如图3所示。由于肿瘤细胞克隆性生长，而正常的成纤维细胞贴壁伸展性生长，通过设定亮度值128为阈值，可以排除染色较浅的成纤维细胞，直接计算肿瘤细胞形成的克隆进行光密度(OD)。结果传输到计算机，计算出药物的抑制率。 D=?(投射光总量/透射光总量) 10 胶滴中生长消除成纤维细胞 输 入 生长形态差别的利用 的形态图像 (光密度比阈值低) 评价形成克隆的图像肿瘤 密度(肿瘤细胞) 成纤维细胞 强 强 肿瘤 染 色 阈值 阈值 强 成纤维细胞 度 弱 弱 - 21 - 图3 图像分析处理步骤 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 3.3 体外药敏检测结果的判定标准 药物体外敏感性用T/C的百分比值表示，其中T为加药处理组的光密度 值，C为空白对照组光密度值。如果T/C的百分比值?50%则认为药物在体外 敏感。 根据体外药敏检测结果，将药物对肿瘤的作用分为敏感(S)和耐药(R)。 体外有效,敏感(S) 体外无效,耐药(R)。 五、ATP-TCA法药敏检测 ATP-TCA药敏检测技术的原理为:细胞内ATP是活体细胞最基本的能量来源。细胞死亡时，ATP迅速水解。因此测定细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞数量。荧光酶在有氧条件下,可以和荧光素结合后催化ATP转变成AMP,并且释放出荧光(波长为562nm)，通过测定所产生的荧光强度,可以推测活细胞的数量。肿瘤细胞经体外给药培养后，计算出化疗药物各个系列浓度下对培养细 [25]胞的不同抑制率，从而评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。 人肿瘤细胞系或来源于肿瘤组织的单细胞悬液，接种于96孔培养板，2, 44×10个细胞/孔。加抗肿瘤药物，每组药物设6个测试浓度，3个平行孔，并设一组不加药物的癌细胞悬液为对照组。检测浓度按各单药血浆峰值浓度配比。各单药血浆峰值浓度如下:阿霉素(ADM)0.5μg/ml;诺维本(NVB)1μg/ml;依托泊苷(VP16)20μg/ml;环磷酰胺 (CTX) *2.75μg /ml。因CTX在体外无活性，实验中所采用的是CTX的体内活化物4-HC。 37?、5% CO饱和湿度培养62天后，各孔 加ATP提取液50μl，孵育5分钟后，各吸取50 μl加入荧光测定板中，加入50 μl ATP检测液，置荧光测定仪上测定各孔在560nm波长处荧光强度。用荧光测定仪自带分析软件计算各测试浓度抑制率及各种药物IC50和 - 22 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 IC90。 [26]体外药敏检测结果的判定标准参考Kurbacher等人标准(1998)，将药物对肿瘤的作用分为四个等级，分别为:强敏感(SS)，中度敏感(IS)，轻度敏感(MS)和耐药(R)。 强敏感(SS):IC50?25%PPC及IC90<100%PPC; 中度敏感(IS):IC50?25%PPC及IC90?100%PPC; 轻度敏感(MS):IC50>25%PPC及IC90<100%PPC; 耐 药 (R):IC50>25%PPC及IC90>100%PPC。 体外有效,强敏感(SS)+中度敏感(IS) ; 体外无效,轻度敏感(MS)+耐药(R)。 - 23 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 结果 一、胶原包被对肿瘤细胞生长状态的影响 1.培养板胶原包被前后肿瘤细胞生长状态的影响 在培养的第7天提取细胞ATP，进行荧光强度的测定，结果显示包被板的细胞荧光强度为未包被板对照组的1.7倍。表明肿瘤细胞在胶原包被的条件下生长状况更好。 2.原代肿瘤组织在胶原包被的条件下生长状态的观察 比较原代肿瘤细胞在胶原包被和未包被的培养瓶中的生长状态，结果如图6所示，原代肿瘤细胞在胶原包被培养瓶中的生长状态明显好于在未包被的培养瓶中的生长状态。 图6 原代肝癌细胞在包被和未包被条件下体外培养24小时 二、所用培养基对肿瘤细胞生长支持度的动态观察 原代肿瘤细胞培养6天，细胞增殖成团，表明我们选取的肿瘤细胞培养基对卵巢癌组织具有较好的生长支持能力(图4)。 - 24 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 图4 卵巢癌组织原代培养效果图第1天和第6天 2种肿瘤细胞系在我们选取的肿瘤细胞培养基生长良好，表明其对MCF-7、A549具有较好的生长支持能力(图5)。 2.5 MCF-7实验组 A549实验组2MCF-7对照组 A549对照组 1.5 1 荧光强度(10E+05 RLU)0.5 0 1234567 培养天数(天) 图5 2种肿瘤细胞系的生长曲线 三、肿瘤细胞在胶滴培养中生长状态的观察 肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞在胶滴培养环境中生长状态良好，能够增殖性生长，形成细胞克隆(图7)。 - 25 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 图7 肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞胶滴培养 A.HCT-116胶滴培养第2天 B.HCT-116胶滴培养第8天 C.原代卵巢癌细胞胶滴中形成克隆 D.原代肾癌细胞在胶滴中形成克隆 四、药物体外的杀伤作用 不同的药物对肿瘤细胞的抑制作用不同。图8、图9表明，通过胶滴肿瘤体外药敏测试，可以较准确的反映不同药物体外的杀伤作用。 - 26 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 图8 HCT-116胶滴培养图片 A.无药对照培养9天 B.加入5-Fu培养9天 C.加入L-OHP培养9天 D.加入CPT-11培养9天 - 27 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 图9 原代子宫内膜癌胶滴培养图片 A. 无药对照培养9天 B.加入VP16培养9天 C.加入NVB培养9天 D.加入ADM培养9天 五、图像的分析 利用图像软件，对图像进行分析。由于肿瘤细胞克隆性生长，而正常的成纤维细胞贴壁伸展性生长，通过设定亮度值128为阈值，排除染色较浅的成纤维细胞，如图9所示，直接对肿瘤细胞形成的克隆进行光密度(D)的计算，结果传输到计算机，计算出药物的抑制率。 图9 图像处理前和处理后 六、CD-DST法与ATP-TCA二种技术的相关性比较 在国外研究报道，ATP生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性 [27]度的方法，与集落形成法具有较好的相关性(相关系数为0.76);1993年，Rhedin等人证实该方法与差别染色细胞毒检测法(DiSC)检测结果亦有较高的一 [28]致性(相关系数为0.83);1998年Taylor等人研究ATP-TCA与MTT法后得出 [29]了同样的结论(相关系数为0.81)。 对6份淋巴瘤标本进行了4种单药的药敏检测，同时分别利用CD-DST法与ATP-TCA方法进行测定比较。CD-DST法测定结果为敏感性的药物，通过ATP-TCA方法测定结果均为敏感性的药物;CD-DST法测定结果为耐药的药物，通过ATP-TCA - 28 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 方法测定结果只有1例药物为敏感性的药物，其余均为耐药的药物。可见两组结果具有较好的相关性(表4)。 表4 CD-DST法与ATP-TCA二种技术的相关性比较 标NVB CTX VP16 ADM 本 序CD-DST ATP -TCA CD -DST ATP -TCA CD- DST ATP -TCA CD -DST ATP -TCA 号 1, , , , ，， ， ， 2 , , , ,， ，, , 3 ,, ,, ,, ，， 4 ,, ,, , , ， ， 5 ,, , , ,, , , 6, , ,， , ,, , 七、CD-DST法的标本可评价率 CD-DST技术标本可评价率较高，通过50例肿瘤标本进行CD-DST检测，肿瘤标本的总体评价率为82.0%，结果如表5所示，药敏检测结果与国外临床试验报 [30] [31]道基本相符。 表5 不同肿瘤类型CD-DST标本可评价率 肺癌 胃肠癌 卵巢癌子宫内膜癌 淋巴瘤肝癌 标本数量 5 15 11 7 8 4 可评价标本 4 12 10 6 6 3 评价率(%) 8080 90.985.7 75.0 75.0 标本总评价率=82.0% - 29 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 八、肿瘤标本对化疗药物的体外敏感性 针对12份妇科肿瘤标本进行了4种单药的药敏检测，可见标本的药物敏感性个体差异较大，结果如表6所示。12例妇科肿瘤标本标本对GEM、 DDP、ADM 和PTX的单药敏感率分别为25.0,、16.7,、25,和33.3%，药敏检测结果与国外 [1] [32] [33]临床试验报道基本相符 (表7)。 表6 12份妇科肿瘤标本对化疗药物的敏感谱 标本序号 GEM DDP ADM PTX 1 ， , , , 2 , , , ， 3 ， , , ， 4 , ， , , 5 , , ， , 6 , , , ， 7 , , , , 8 , , , , 9 , , ， , 10 , , , ， 11 ， , , , 12 , ， , , - 30 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 表7 化疗药物对卵巢癌、子宫内膜癌的体外有效率 药物名称 体外有效率(S)% 临床试验报道 DDP 16.7% 10.0,30.0% PTX 33.3% 29.8,35.0% GEM 25.0% 15.0,30.0% ADM 25.0% 20.0,35.0% 12份胃肠道肿瘤标本进行了5种单药的药敏检测，可见标本的药物敏感性个 体差异较大，结果如表8所示。12例胃肠道肿瘤标本对5-FU、 DDP、MMC、ADM 和 L-OHP的单药敏感率分别为16.7,、16.7,、16.7,、8.3%和25.0,，药敏检测 [34]结果与国外临床试验报道基本相符(表9)。 表8 12份胃肠道肿瘤标本对化疗药物的敏感谱 标本序号 5-FUDDP MMC ADM L-OHP 1 ， , , , , 2 , , ， , , 3 , ， , , , 4 , , ， ， , 5 , , , , , 6 , , , , ， 7 ， , , , , 8 , , , , , 9 , ， , , , 10 , , , , ， 11 , , , , , 12 , , , , ， - 31 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 表9 化疗药物对胃肠道肿瘤的体外有效率 药物名称 体外有效率(S)% 临床试验报道 DDP 16.7% 17.65% 5-FU 16.7% 17% MMC 16.7% 18% L-OHP 25.0% 27% ADM 8.3% 19% 6份淋巴瘤标本进行了4种单药的药敏检测，可见标本的药物敏感性个体差 异较大，结果如表10所示。 6份淋巴瘤标本对化疗药物的敏感谱 表10 标本序号 NVB CTX VP16 ADM 1 , , ， ， 2 , , ， , 3 , , , ， 4 , , , ， 5 , , , , 6 , , , , - 32 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 讨论 近半世纪以来，肿瘤的发病率逐年升高，严重威胁人民的健康。治疗肿瘤常用的方法是外科手术，化疗和放疗与现今以肿瘤免疫治疗为基础发展起来的生物治疗。同类型肿瘤不同的细胞系对抗癌药物的敏感性不同,同病种肿瘤病人的肿瘤细胞对各抗癌药物的敏感性也不同。而目前临床根据经验选择药物进行肿瘤化疗，有效率往往很低。同时肿瘤细胞会产生抗药性，最终导致化疗的失败。如何提高肿瘤患者化疗成功率的问题，已成为当前癌症研究的主要课题之一。 目前，体外检测肿瘤对化疗药物的敏感性的方法主要有软琼脂克隆形成实验(HTCA)、四唑蓝比色法 (MTT) 、差别染色细胞毒检测法(DiSC)和三磷酸腺苷生物发光法(ATP-TCA)等体外药敏试验，对提高用药的针对性均取得了一定的效果。但是这些方法又有各自的不足。在此种研究背景下，人们建立了新的胶滴肿瘤药敏检测技术(collagen gel droplet culture drug-sensitivity test，CD-DST )。 3CD-DST技术具有其它方法不具备的优点，具有所需细胞数量少(3×10个细胞/滴)、敏感及临床相关性好的等突出技术特点。 本研究初步研究结果表明，我们建立的CD-DST技术标本评价率较高为82%(41/50)，与国外临床试验报道基本相符，可以针对多种类型的肿瘤标本进行药物敏感性检测，例如卵巢癌、子宫内膜癌、消化道恶性肿瘤，淋巴瘤和肺癌等实体瘤标本。同时还可以针对肿瘤病人的胸水、腹水进行药物敏感性检测，由于检测所需肿瘤细胞数量较少，解决了小标本进行药敏检测的问题。由于肿瘤细胞在胶原凝胶所形成的三维立体培养环境中，培养成功率高，细胞具有与体内细胞相似的生长形态。经过CD-DST检测可以反映不同病人对各抗肿瘤药物敏感性的个体差别，初步研究结果可以发现药物体外敏感性结果和实际临床经验单药治疗有效率有较高的符合率。 据国外临床研究报道，胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST )是一种较为可靠的 [30]体外药敏检测技术。Kobayashi H等人研究表明，CD-DST技术标本针对不同肿瘤类型标本的总体评价率为82%，对小量标本(针吸和活检标本)进行药敏实验，标本总体评价率为78.6%。同时对145例包括胃肠道肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌等多种肿瘤类型进行了临床相关性研究，研究资料统计结果表明 - 33 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 CD-DST体外药敏测定结果与临床疗效间具有较好的相关性，其中阳性预测值为 [35]79.8%)阴性预测值为88.8%)特异性为80.6%。Kobayashi H等研究了CD-DST技术在非小细胞肺癌化疗中的应用，结果表明，在CD-DST技术指导下的化疗，25例病人中11例按CD-DST技术用药的患者，2例达到完全缓解，6例达到部分缓解，3例稳定。其余14例病人按经验化疗，只有1例达到部分缓解，有效程度明显高于常规化疗。目前该技术在日本已得到广泛应用，日本Nitta Gelatin 公司已将该技术产业化。因此，胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST )在肿瘤药物敏感性检测方面的应用具有特有的优势和应用前景。 初步结果表明，我们建立的胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST ) 能够检测到不同原代肿瘤细胞间的药效差异;并对体外抗癌药物的特异性杀伤作用做出客观评 3价，同时其所需标本量小(3×10个细胞/孔)和能排除成纤维细胞干扰的特点扩大了该技术的应用范围，弥补了目前其它药敏技术的不足。CD-DST技术作为一种新的先进体外肿瘤药敏检测技术，对化疗药物杀伤肿瘤细胞有效性的评价、化疗方案的筛选，肿瘤化疗个体化治疗的推广和提高临床化疗用药科学性等方面均具有实际意义。 - 34 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 结论 本研究建立了CD-DST药敏检测技术，并表明胶滴肿瘤体外药敏检测技术(CD-DST)是一种敏感性高、特异性强的体外药敏检测技术。该技术具有标本的 3可评价率高(82%)、所需标本量小(3×10个细胞/孔)的特点，扩大了该技术的 应用范围，弥补了目前其它药敏技术的不足。 该方法可以针对多种类型的肿瘤实体瘤标本和液体标本(胸水、腹水)进行药物敏感性检测，还可以对淋巴结组织以及细针穿刺标本进行检测，解决了小标本进行药敏检测的问题，在未来有临床推广应用的可行性。 该胶滴肿瘤体外药敏检测技术(CD-DST)的建立，填补了目前国内在该领域的空白。 - 35 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 参考文献 1. 韩锐主编，肿瘤化学预防及药物治疗.北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社.1991，417-418. 2. 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Methods Mol Med. 2005，110:59-67. 20.Nakagawa H, Kobayashi H, Koezuka M, et al: Chemotherapy for metastatic - 37 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 brain tumors with CDDP and other agents: correlation between chemotherapeutic effects and the results of in vitro chemosensitivity tests using collagen gel-embedded culture combined with computerized image analysis in metastatic brain tumors.No Shinkei Geka. 1994， 22:517-23. 21.Inaba M, Tashiro T, Sato S, et al: In vitro-in vivo correlation in anticancer drug sensitivity test using AUC-based concentrations and collagen gel droplet-embedded culture.Oncology. 1996，53:250-7. 22.Ochiai T, Nishimura K, Noguchi H,et al: Evaluation of 5-fluorouracil applicability by multi-point collagen gel droplet embedded drug sensitivity test. Oncol Rep .2005，14:201-5 23.Takamura Y, Kobayashi H, Taguchi T, et al: Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers. Int J Cancer. 2002，98:450-5. 24.Yabushita H, Ohnishi M, Komiyama M, et al: Usefulness of collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity testing in ovarian cancer. Oncol Rep. 2004，12:307-11 25.Kuzmits R, Aiginger P, Muller MM, Steurer G, Linkesch W. Assessment of the sensitivity of leukaemic cells to cytotoxic drugs by bioluminescence measurement of ATP in cultured cells.Clin Sci (Lond). 1986，71: 81-8. 26.Kurbacher CM, Cree IA, Bruckner HW, et al. Use of an ex vivo ATP luminescence assay to direct chemotherapy for recurrent ovarian cancer. Anticancer Drugs. 1998，9: 51-7. 27.Cree IA, Pazzagli M, Mini E, et al. Methotrexate chemosensitivity by ATP luminescence in human leukemia cell lines and in breast cancer primary cultures: comparison of the TCA-100 assay with a clonogenic assay. Anticancer Drugs.1995，6: 398-404. - 38 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 28.Rhedin AS, Tidefelt U, Jensson K, Lundin A, Paul C. 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Oncology. 2002，16:73-81 34.周际昌,主编.实用肿瘤内科学.第2版.北京.人民卫生出版社. 2003， 589—608 35.Kobayashi H,Higashiyama M, Kodama K , et al: Predictive value of in vitro chemosensitivity test using the 3-dimentional collagen gel droplet culture method in recurrent non small cell lung cancers. Chemotherapy. 2000，29:86 - 39 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 文献综述 胶滴肿瘤药敏检测技术的临床应用研究 引论 恶性肿瘤是一类严重威胁人民生命和健康的疾病。近年来，某些恶性肿瘤的化疗效果有了明显提高，但多数肿瘤尤其是实体瘤疗效仍不理想。由于肿瘤异质性的存在，使不同的肿瘤类型或同一肿瘤类型的不同病人对药物的敏感性不同，治疗效果差异很大。例如胃癌患者的单药有效率仅为15%-30%，MMC有效率为30%， [1]5-Fu有效率为21%，EDI有效率为19%，联合化疗的有效率也仅为30%-50%，可以看出目前肿瘤的临床化学治疗具有一定的盲目性。此外由于化疗药物多具有细胞毒性, 不当的治疗不仅会贻误治疗，还会产生严重的毒副作用和联合耐药，最终导致治疗失败。因此，如何提高化疗用药的针对性和准确性，科学的使用化学药物是肿瘤化疗中需要解决的实际问题。 自20世纪50年代有人提出对肿瘤病人进行个体化治疗以来，国际上相继建立了一系列体内、外药物敏感性试验技术。目前具有代表性的有以下几种体外药 [2][3][4][5]敏实验:琥珀酸脱氢酶抑制实验(SDI) 、四唑蓝比色法 (MTT) 、ATP [6] [7]生物荧光体外药敏检测法(ATP-TCA)及立体组织培养药物测定实验(HDRA)[8] [9]。这些方法不同程度的部分解决肿瘤个体化治疗的问题，但均存在所需细胞数量多，不能解决小量标本进行药敏检测的问题。 在此种研究背景下，人们建立了胶滴肿瘤药敏检测技术(collagen gel droplet culture drug-sensitivity test，CD-DST )。CD-DST技术克服了其它 [10]方法的缺点，具有所需细胞数量少、敏感临床相关性好等突出特点，是一种先进的体外药敏检测技术，在临床应用中具有广阔发展前景。 - 40 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 CD-DST技术原理和特点 一、技术原理 人体肿瘤组织是由肿瘤细胞、正常细胞和细胞外基质共同组成的细胞群体，肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细胞生长具有重要影响。CD-DST技术是利用胶原凝胶在37?时形成三维立体结构的特点，在体外模仿了体内肿瘤细胞生长的微环境，使肿瘤细胞能够在与体内环境相似的条件下生长，生长的肿瘤细胞具有与体内相似的细胞形态特点。经过7天的培养后，经干胶、染色、扫描等程序最终对化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用程度做出客观评价。 如图1所示，CD-DST技术利用胶原酶消化细胞外基质，将肿瘤单细胞包埋于?型胶原中，形成胶原凝胶，肿瘤细胞在三维立体环境中生长，然后在近似于体 [11]内环境的条件下中评定药物对细胞的作用。 CD-DST技术原理 图1 二、技术特点 [12]1979年，Yang J等提出了一种新型体外细胞培养技术，将乳腺癌上皮细胞种植到胶原中以形成三维立体结构，从而达到使其生长类似于体内细胞生长状 [13] [14]态。随后Miller BE及Nakagawa H等人证实了肿瘤细胞在胶原中培养具有克隆形成率高、与体内细胞形态相似的特点，将此技术应用体外药敏实验。 1997 [15]年Kobayashi H等采用此种细胞培养技术，结合其他体外药敏试验优点，报道 [16-18]了CD-DST这种新的体外药敏检测技术。CD-DST技术具有以下特点: - 41 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 3?细胞用量少(3×10个细胞/孔) 由于所需标本细胞数量少，不仅可对小量的组织标本进行药物敏感性测定，而且可以对胸腹水等液体标本进行检测。从而使乳腺针吸活检标本、胸水标本、组织活检标本可以进行体外药敏检测，扩大了肿瘤药敏技术的检测范围。 ?标本培养成功率高 肿瘤细胞在胶原凝胶所形成的三维立体培养环境中，培养成功率高，细胞具有与体内细胞相似的生长形态。如图2所示，肿瘤细胞在胶原凝滴培养与SDI培养相比较具有较高的生长率。 图2 肿瘤细胞在胶原凝滴培养和SDI培养细胞生长率比较 ?采用图像软件系统分析结果，客观准确 通过图像软件系统进行分析，排除成纤维细胞对实验的干扰，可对抗癌药物对肿瘤细胞的特异性杀伤作用在体外做出客观评价。研究报道肺癌细胞和成纤维细胞经过中性红染色，具有明显不同的特点，结果如图3。 - 42 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 图3 肺癌细胞和成纤维细胞的生长形态 A.肺癌细胞克隆B.比较肺癌细胞和成纤维细胞经过中性红染色的区别 ? 结果测定快速(3秒/滴) 结果利用计算机进行结果分析，测定6种药物的时间只需1分钟。 三、技术流程 [19-22]CD-DST肿瘤体外药敏检测操作流程主要为以下流程(图4): 图4 CD-DST技术实验流程 - 43 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 1. 肿瘤细胞悬液制备:将新鲜瘤组织剪碎成0.5-1mm碎块，加入消化酶(胰酶、 胶原酶)消化2,3小时，待细胞分散后,通过80um的筛网过筛，得到细胞悬 液。 2. 肿瘤细胞的原代单层培养:将上述细胞悬液加入到I型胶原蛋白包被的细胞 培养瓶中培养24小时,弃上清中未贴壁的死细胞。 3. 胶原蛋白凝胶内培养:将细胞用胶原酶消化后，收集活细胞并计数，将活细 胞滴入胶原凝胶液中。将胶原和细胞混合物接种于六孔板37?培养，1小时 后加入培养基，培养过夜。 4. 待测药物的添加:在六孔板中加入抗癌药物，在不同药物浓度作用下培养24 小时。清洗并除去抗癌药物后，无血清培养7天。 5. 结果测定:中性红染色固定、扫描，结果传输计算机。利用图像软件分析药 物的抑制率，评估药物体外杀伤作用。 6. 结果评价: 通过图像软件，对图像进行分析。通过设定亮度值128为阈值，排除成纤维细胞，直接对肿瘤细胞形成的克隆进行光密度(D)的计算，结果传输到计算机，计算出分析药物的抑制率。 D=?(投射光总量/透射光总量) 10 药物体外敏感性用T/C的百分比值表示，其中T为加药处理组的光密度值，C为空白对照组光密度值。如果T/C的百分比值?50%则认为药物在体外敏感。 CD-DST临床相关性研究 一、标本可评价率研究 [23]Kobayashi H等人研究表明，CD-DST技术标本可评价率较高，不同肿瘤类型标本的总体评价率为82%，结果如表1所示。经过统计学分析可发现不同类型的肿瘤标本的可评价率均无显著差异。同时通过对小量标本(针吸和活检标本)进行药敏实验，标本总体评价率为78.6%，结果如表2所示。因此CD-DST技术对小量标本的检测同样具有标本可评价率高的特点，可以弥补目前其它体外药敏技术无法对小量标本进行检测的不足。 - 44 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 表1 不同肿瘤类型CD-DST标本可评价率 肺癌 乳腺癌 胃癌 结肠癌 食管癌 胰腺癌 胆管癌脑部肿瘤 标本数量 659 163 92107 13 178 32 可评价标本 543132 78 8911 178 28 评价率(%) 82 81 8583 85 100100 88 标本总评价率=83% 表2 活检标本可评价率 乳腺针吸活检标本 胸水标本 胃组织活检标本 食管组织活检标本 标本数量 58 7 25 13 可评价标本 49 5 18 9 评价率(%) 85 71 72 69 标本总评价率=78.6% 二、药物体外敏感性和临床单药治疗有效率的比较研究 [23] [24]药物体外敏感性和临床单药治疗有效率的比较结果如表3所示，经过统计学分析，可以发现药物体外敏感性结果和实际临床单药治疗有效率有较高的符合率。 - 45 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 表3 药物体外敏感性和临床单药治疗有效率 抗癌药物 肿瘤类型 体外敏感率(%) 临床反应率 (%) 23.4 25 顺铂(CDDP) 肺癌 13.8 8 乳腺癌 25 14.3 胃癌 40(0 36(0 卵巢癌 36(4 35(0 子宫颈癌 26(9 28(0 子宫内膜癌 23.9 19 丝裂霉素(MMC) 肺癌 14.8 20 乳腺癌 26.8 31 胃癌 氟尿嘧啶(5-FU) 肺癌 , , 27.9 26 乳腺癌 35.3 23 胃癌 卡铂(CBP) 卵巢癌 25(0 24(0 子宫颈癌 36(4 26(0 子宫内膜癌 23(1 28(0 紫杉醇(PTX) 卵巢癌 30(0 36(0 子宫颈癌 45(5 30(0 子宫内膜癌 30(8 30(0 多西紫杉醇(DTY) 卵巢癌20(0 36(0 子宫颈癌 31(8 30(0 子宫内膜癌 23(1 30(0 三、CD-DST体外药敏测定结果与临床疗效的相关性研究 [25]1996年，Inaba M等首先证实此方法在体外进行药物敏感性检测的可行性， [26-29]随后进行了临床相关性研究。体外药敏检测的肿瘤标本包括胃肠道肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌，食管癌等多种肿瘤类型。研究资料统计结果表明CD-DST体 [23]外药敏测定结果与临床疗效具有较好的相关性，其中阳性预测值为 79.8%)阴 - 46 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 性预测值为88.8%)特异性为80.6%。 [23]表4 CD-DST测定结果与临床疗效相关性研究结果 CD-DST/临床反应 S/S S/R R/SR/R 总计 非小细胞肺癌 44 13 5 46 108乳腺癌 3 4 26 57 24 胃癌 4 3 0 3 10 食管癌 2 0 1 1 4 脑部肿瘤 1 0 0 3 4 总计 7519 10 79 183 S:敏感性 R: 抗药性 预测精确值 84.1%(154/183) 阳性预测值 79.8%(75/94) 阴性预测值 88.8%(79/89) 敏感性 88.2%(75/85) 特异性 80.6%(79/98) CD-DST在临床治疗中的应用 CD-DST体外药敏检测方法在临床治疗中主要应用于以下三个方面: 一、 指导临床化疗用药， 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 个体化治疗方案 建立可靠的体外肿瘤药敏检测方法，可以帮助临床医师选择有效的化疗药物，有的放矢的设计个体化治疗方案，提高临床治疗效果。国外研究结果表明，CD-DST辅助临床进行化疗方案的确定，取得了较好的临床效果。 [30]Yabushita等报道了CD-DST指导下的化疗在卵巢癌治疗中应用，4名患者在CD-DST指导下进行辅助化疗，24到36个月之间均未复发。5例患者进行在CD-DST指导下进行诱导缓解化疗，3例达到完全缓解，1例达到部分缓解,有效程度明显高于常规化疗。 [27]Takamura Y等以CD-DST指导70例乳腺癌患者的临床治疗,其中59例标本可评价，标本评价率为84.3%。根据CD-DST检测结果，32例对药物敏感的患者，临床治疗有效的为28例;27例对药物抵抗的患者，临床治疗有效的仅为1例。另外在20例可评价的乳腺癌复发的患者中，药物敏感组患者的中位缓解期为15.9 - 47 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 个月，体外抗药患者的中位缓解期为2.5个月。结果表明，CD-DST辅助化疗的应用能够提高临床疗效。 因此，该技术在临床恶性肿瘤的个体化治疗应用中具有实际意义。 二、为非常规化疗肿瘤设计化疗方案 CD-DST技术在一些非常规化疗肿瘤设计治疗方案中得到了应用。Kobayashi H[31]等研究了CD-DST技术在非小细胞肺癌化疗中的应用，结果表明，在CD-DST技术指导下的化疗，25例病人中11例按CD-DST技术用药的患者，2例达到完全缓解，6例达到部分缓解，3例稳定。其余14例病人按经验化疗，只有1例达到部分缓解，结果具有明显差异。 [32]目前非小细胞肺癌?A期的病人3年生存率在30%以下。Gika M等报道了1例非小细胞肺癌?A期的病人，在CD-DST技术指导下进行辅助化疗，经过CD-DST技术选药常规剂量化疗，病人生存期达3年以上，目前未发现病情进展。 食管癌、非小细胞肺癌、消化道肿瘤等均为高发的非常规化疗癌种，同时所得到的标本细胞数量较少。通过CD-DST技术的应用，可以对小量的标本进行检测，从众多药物的中筛选出对肿瘤患者有效的药物，指导临床化疗的应用，提高医生科学用药的水平。 三、与肿瘤相关的基础研究 [33]Inoue Y等人利用CD-DST技术研究了多西紫杉醇(DTY)和顺铂(CDDP)在肺癌体外的药物敏感性与Bcl-2蛋白 和 P-gp表达的关系。结果显示，Bcl-2高表达能够提高非小细胞肺癌细胞对DTY的敏感性。P-gp高表达能够提高肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。Bcl-2 和 P-gp是否可作为一种肺癌细胞药物敏感性的分子标记需进一步研究。 因此作为一种先进的技术，CD-DST技术在肿瘤相关基因基础研究领域中可能会有进一步的应用。 结论 CD-DST技术在肿瘤体外药敏检测的应用已有十年的历史，作为一种先进的体外药敏检测方法，在临床治疗和肿瘤相关基础研究中应用已有成功的报道。目前， - 48 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 日本Nitta Gelatin 公司已将该技术产业化，该产品已在日本应用于肿瘤患者临床个体化治疗。 大量国外研究结果表明CD-DST技术检测的标本可评价率高，检测结果与临床研究相关性好，该技术的应用可能提高恶性肿瘤患者的治疗效果和医生科学用药的水平，从而使肿瘤患者的个体化治疗成为现实。 CD-DST技术具有标本用量小)特异性高的特点，弥补了目前其它药敏因此， 技术的不足，使细胞数量较少的肿瘤标本可以顺利完成药敏检测，扩大了药敏检测技术的临床应用范围，在临床应用中具有广阔的发展前景。 - 49 - 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 参考文献 1. 周际昌,主编.实用肿瘤内科学.第2版.北京.人民卫生出社,2003.591-593. 2. 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