鱼塘生态体系中大肠埃希菌和沙门菌的耐药性研究

鱼塘生态体系中大肠埃希菌和沙门菌的耐药性研究 鱼塘生态体系中大肠埃希菌和沙门菌的耐 药性研究 动物医学进展,201I,32(6):96—100 ProgressinVeterinaryMedicine 鱼塘生态体系中大肠埃希菌和沙门菌的耐药性研究 丛莉,李琚峤,吴希阳?,于辉,林立超 (1.暨南大学食品科学与 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 系,广东广州510632;2.佛山科学技术学院,广东南海528231) 摘要:为了解鱼塘生态体系大肠埃希茵和沙门菌的耐药情况,从广东省佛山某鱼塘随机采集草鱼及生 活圈的水土样品中(包括鱼肠内容物,鱼塘底泥,鱼塘水)分离出47株大肠埃希茵和23株沙门茵.采用纸片 扩散法(Kirby-bauer,KB)对分离菌株进行了15种抗生素的敏感性试验,结果显示100的菌株均耐1种及 1种以上的抗生素多表现出对氨苄西林,萘啶酮酸,青霉素,四环素共同耐药,而对头孢类及呋喃妥因的耐药 率较低.总体上大肠埃希茵的多重耐药程度比沙门茵要高,而且耐药谱也比沙门茵广;鱼塘水土中的大肠埃 希茵和沙门菌的多重耐药程度比鱼肠中的要高很多,其耐药谱却比较窄.结果表明此鱼塘生态体系中大肠 埃希菌和沙门茵的多重耐药现象严重,需合理指导抗生素的使用. 关键词:鱼塘;草鱼;大肠埃希菌;沙门菌;耐药性 中图分类号:$852.612文献标识码:A文章编 号:1007—5038(2011)06—0096—05 大肠埃希菌(Escherichiacoli)和沙门菌 (Salmonella)同为革兰阴性肠杆菌,既是食源性又 是水源性病原菌,并且大肠埃希菌还作为人和动物 肠道主要共生菌[1],两者有可能携带相似的耐药基 因,通过遗传因子(质粒,整合子等)可以实现耐药基 因的相互转移[2].目前由于养殖水体环境被污染, 加上在水产养殖中过度使用抗菌药物[3],造成抗生 素在鱼体及环境中不断累积,导致病原耐药菌在水 产品中大量存在,其携带的耐药基因可能会传递给 周围其它水生生物,甚至可能会通过食物链传播给 人类[4],造成人体内耐药基因的累积,威胁到人类的 健康,同时也给临床治疗带来困难.2010年”超级 细菌”的出现正是细菌长期受到抗生素选择性压力 筛选导致的多重耐药的结果,细菌耐药性已然成为 一 个全球性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 _5]. 为了预防和控制耐药菌的出现,要对细菌耐药 性的产生和播散进行溯源,食物链肯定是一个不可 忽视的环节[6].目前在发达国家和发展中国家,已 经建立了许多行之有效的细菌监测体系.这些体系 通常检验的细菌大多来源于临床动物病料和食品加 工品,但是很少将健康畜禽和养殖鱼类作为研究对 象,尤其对于整个养殖体系细菌监测的研究更少. 本文对鱼塘生态体系中养殖草鱼及生活圈水土 的大肠埃希菌和沙门菌的耐药性进行了研究,以确 定在此微生态体系中菌株的耐药情况及其关联性. 这些信息将为鱼类养殖中用于治疗和非治疗用途的 抗生素的使用提供理性指导,并有助于评估人类接 触大肠埃希菌和沙门菌的风险,以及在例行的细菌 监测中是否应包括养殖鱼类的大肠埃希菌和沙门菌 耐药性监测提供参考依据[7]. 1材料与方法 1.1材料 I.1.1样品采集本实验的草鱼及鱼塘水土来源 于广东省佛山市南海丹灶镇的某鱼塘,采集时间为 2010年4月,随机选取5条1kg左右的鲜活草鱼. 在常规无菌操作下收集鱼肠道内容物,用于后续细 菌分离.采集的鱼塘水为鱼塘边5个不同位置距离 水面15cm深处的水体,各取5OmL;采集的鱼塘土 为鱼塘近岸及塘内5个不同位置距离地面5em深 的土壤各取50g,在无菌条件下研磨土粒,并按1:9 比例加入无菌生理盐水,混匀后静置2min,上清液 用于后续试验. 1.1.2培养基及试剂营养肉汤培养基,麦康凯琼 脂,木糖赖氨酸脱氧胆盐(xyloselysinedesoxy— cholate,XLD)琼脂购自广东环凯生物科技有限公 司,水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH).肉汤培养 基,琼脂粉购自青岛海博生物技术有限公司.生化 鉴定用培养基,试剂均购自北京陆桥技术有限公司. TaqDNA聚合酶,DNAMarker均购自宝生物工程 收稿日期:2011-03—03 作者简介:丛莉(1985一),女,山东烟台人,硕士研究生,主要从事病原微生物多重耐药机理研究.*通讯作者 丛莉等:鱼塘生态体系中大肠埃希菌和沙门菌的耐药性研究97 (大连)有限公司,溴化乙锭,琼脂糖购自北京鼎国生 物技术有限公司. 1.1.3药敏纸片按美国临床实验室标准化研究 所(Clinicalandlaboratorystandardsinstitute, CLSI)推荐的肠杆菌药敏试验抗生素选择原则,结 合我国临床,畜牧业抗生素使用特点,选择使用的 15种抗生素和相应的浓度如下[8]:氨苄西林(ampi- cillin,10gg),头孢他啶(ceftazidime,30big),氯霉素 (chloromycetin,30/lg),红霉素(erythromycin, 15g),四环素(tetracycline,30g),氟苯尼考(flor— fenicol,30g),头孢噻肟(cefotaxime,30g),复方 新诺明(trimethoprim-sulfamethoxazole,25tLg),萘 啶酮酸(nalidixicacid,30g),新霉素(neomycin, 30gg),呋喃妥因(nitrofurantoin,300肛g),链霉素 (streptomycin,10g),复方磺胺(compoundsulfa— diazine,300g),甲氧苄啶(trimethoprim,5tzg),青 霉素(penicillin,10/xg).药敏纸片均购自广州市迪 景微生物科技有限公司.药敏质控菌株ATCC 25922,ATCC25923,大肠埃希菌标准菌株和沙门菌 标准菌株为本实验室保存菌株. 1.2方法 1.2.1细菌分离计数常规无菌条件下,采用1O 倍稀释法对采集的各样品进行系列稀释,初步估计 各样品中大肠埃希菌,沙门菌总数,选择3个适宜稀 释度,分别涂布于麦康凯琼脂平板,XLD琼脂平板, 37?培养24h,计数典型特征菌落数.随机挑取可 疑菌落进行纯培养,用于后续生化,PCR鉴定和药 敏试验.菌种于--80?保存. 1.2.2生化鉴定根据大肠埃希菌和沙门菌在不 同培养基上的不同特征,通过生化方法判断细菌的 代谢特性,从而初步鉴定大肠埃希菌和沙门菌,生化 试验包括三糖铁琼脂,赖氨酸铁琼脂,尿素酶琼脂基 础和吲哚试验. 1.2.3PCR鉴定参照相关文献[8..,采用煮沸法 提取细菌基因组DNA,大肠埃希菌鉴定引物uspA 和沙门菌鉴定引物Sal-kw由上海生工生物工程技 术服务有限公司合成.对已初步鉴定为大肠埃希菌 和沙门菌的菌株通过PCR扩增来进行确证. 在5O肚LPCR反应体系中,10×PCRbflffer (Mg0free)5.0L,10mmol/LdNTPs0.5L, 25mmol/LMgC123L,10/~mol/L的上,下游引 物各0.5L,5U//~L的TaqDNA聚合酶0.2L, 模板2.0L,ddHO补足至50肛L.PCR扩增条件 为初始变性94?5min,然后94?30S,Tm? 30S,72?1min,30个循环;最后72?10min.程 序结束后,用15g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产 物. 1.2.4药敏试验采用纸片扩散法[1,挑取单菌 落接种于5mL营养肉汤培养基中,置37?摇床培 养14h,18h,用生理盐水校正浊度至0.5个麦氏 单位(约1.5×10.cfu/mL);将MH琼脂培养基倾注 平皿制成厚约4mm的琼脂平板,用无菌棉签蘸取 菌液,均匀涂布于整个平板表面;待平板上水分被琼 脂吸干后贴药敏纸片.纸片一旦贴在某一位置上, 不应变动位置,每两个纸片间距不少于24mm,于平 皿边缘不少于15ram;37?培养24h后测量抑菌环 直径,记录结果.同时使用大肠埃希菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌 株,用于检测药敏试验的可靠性. 表1用于PCR鉴定的相关引物及引物序列 Table1PCRPrimersusedforPCRtestsandthesequenceofprimersinthisstud y 2结果 2.1细菌分离及鉴定结果 典型大肠埃希菌在麦康凯平板上呈粉红色的单 个菌落,革兰染色阴性,三糖铁琼脂斜面及底层产 酸,赖氨酸铁琼脂内部呈碱性,产HS阴性,尿素酶 阴性和吲哚阳性.典型沙门菌在XLD平板上呈粉 色,带或不带黑色中心的单个菌落,革兰染色阴性, 三糖铁琼脂斜面表层呈碱性,内部呈酸性并伴有H: S生成,赖氨酸铁琼脂内部呈碱性并生成HS,尿素 酶阴性和吲哚阴性. 疑似菌株经生化鉴定和PCR鉴定(图1,图2) 后,共分离出47株大肠埃希菌菌株和23株沙门菌 菌株用于药敏试验,其中从鱼肠内容物中分离出2O 98动物医学进展2011年第32卷第6期(总第216期) 株大肠埃希菌和14株沙门菌,从鱼塘水中分离出15 株大肠埃希菌和5株沙门菌,而从鱼塘土中分离出 1500bp 1000bp 800bp 的菌株最少,分别为12株大肠埃希菌和4株沙门 菌. 500bp 400bp 300bp 200bp 图1部分大肠埃希菌菌株的PCR检测结果图2部分沙门菌菌株的PCR检测结果 Fig.1PCRproductsofE~cherichiacoliisolatesFig.2PCRproductsofSalmon ellaisolates M.DNA标准DL1500;E.大肠埃希菌标准菌株;s.沙门菌标准菌株;E1,E9.待鉴定的部分大肠埃希菌菌株;S1,S11.待鉴定的部分沙门菌 菌株 M.DNAMarkerDL1500;E.Escherichiacolistrain~S:Salmonellastrain}E1 一E9.ThedoubtfulEscherichiacolistrains}$1-$11.Thedoubt— fulSalmonellnstrains 2.2药敏试验结果 按国际规定把耐药和中介耐药相加计算耐药 率,结果表明(表2)养殖草鱼及生活圈水土的耐药现 象严重.100的分离菌株对1种及1种以上抗生 素耐药,多表现出对氨苄西林,萘啶酮酸,青霉素,四 环素共同耐药.与大肠埃希菌相比,沙门菌对青霉 素,红霉素和新霉素的耐药率高出20以上,而对氨 苄西林,萘啶酮酸,头孢类,呋喃妥因等的耐药率差 别不大.大肠埃希菌对氨苄西林耐药率最高为 87.2,其次为青霉素,甲氧苄啶,奈啶酮酸,新霉素 和四环素等,耐药率均高于50;沙门菌对青霉素和 新霉素的耐药率最高为100,其次为氨苄西林,红 霉素,四环素,奈啶酮酸和甲氧苄啶,耐药率均高于 6O9/6;大肠埃希菌和沙门菌对头孢他啶,头孢噻肟, 呋喃妥因的耐药率较低. 表247株大肠埃希菌菌株和23株沙门菌菌株对15种抗生素的RIS 分布 Table2Resistant,intermediate,andsusceptibledistributionsoftheEscherich iacoliandSalmonellaisolatesforthe15antibiotics 抗生素 Antibiotics 暨堡量堕兰:型 耐药率/0A中介率/敏感率/ RIS 沙门菌Salmonella 耐药率/中介率/敏感率/ RIS 总耐药率/R+I 大肠埃希菌沙门菌 EcoliSalmonella 注:”R”表示耐药率,”I”表示中介率,”s”表示敏感率. Note:”R”standsforresistantrate,”I”standsforintermediaterate,”S”standsf orsensitiverate. 2.3耐药谱 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 在47株大肠埃希菌和23株沙门菌试验菌株 中,细菌多重耐药现象严重.由图3可以看出,大肠 埃希菌的多重耐药程度比沙门菌要高,而且耐药谱 丛莉等:鱼塘生态体系中大肠埃希菌和沙门菌的耐药性研究99 也比沙门菌广.大肠埃希菌对1种及1种以上抗生 素耐药率为100,甚至有6株菌株的耐药种类高达 l3种,其中2重耐药和13重耐药的菌株数最多,共 占大肠埃希菌菌株的25.5(12/47).沙门菌对两 种以上抗生素耐药率高达100,47.7的菌株显示 9重以上耐药,5重耐药和儿重耐药的菌株数最多, 占沙门菌菌株的43.5(10/23). 由图4,图5可以看出,鱼塘土,鱼塘水源大肠埃 希菌和沙门菌多重耐药程度均比鱼肠源的要高,其 中鱼塘土源大肠埃希菌多为9重及9重以上耐药, 菌株比例为19.1(8/47),鱼塘水源大肠埃希菌中 \o - , xJ 蜷 {蹑 萑 ?大肠埃希菌E.coli口沙门菌Salmonella 蜷 }匾 糯 萑 耐药数量Drugresistancenumber 图5不同来源沙门菌菌株对15种抗生素的耐药谱 Fig.5AntibioticresistanceprofileoftheSalmonellaisolatesfrom differentsamplasforthe15antibiotics 3讨论 近年来,我国水产养殖业发展迅速,同时养殖环 境也在不断恶化,使得养殖对象免疫力,抗病力有所 下降,发病率显着升高,而抗生素在预防和治疗过程 中的广泛使用,已造成养殖对象及环境的细菌耐药 性日趋严重.本试验从养殖草鱼及水土环境中共分 离出47株大肠埃希菌和23株沙门菌,分别研究了 对l5种抗生素的耐药情况,结果表明,所有试验菌 13重耐药菌株所占比例最高,为12.8(6/47),而 且有1株表现为15重耐药;鱼塘土源沙门菌中11 重耐药的菌株比例最高,为13.0(3/23),有1株表 现为14重耐药,鱼塘水源沙门菌多为9重以上耐 药,菌株比例为17.4(4/23). 同为鱼肠源菌株,沙门菌的多重耐药程度则高 于大肠埃希菌,耐药菌株多集中在5重和7重耐药 之间,占沙门菌菌株的43.5(10/23),而大肠埃希 菌耐药菌株多为2重和4重耐药之间,占大肠埃希 菌菌株的31.9(15/47). 卷 {匾 窿 0 l2345678910ll121314l5 耐药数量Drugresistancenumber 图4不同来源大肠埃希菌菌株对15种抗生素的耐药谱 Fig.4AntibioticresistanceprofileoftheEscherichiacoli isolatesfromdifferentsamplesforthe15antibiotics 株均表现出耐药,并且多重耐药现象严重,其中对于 常用的抗生素如青霉素类,四环素类以及喹诺酮类, 试验菌株表现出较高的耐药率(高于6O),而对于 使用时间短的头孢菌素类以及呋喃妥因,耐药率也 达到13.0,21.3,值得注意的是,虽然2002年 我国养殖业已禁用氯霉素,但试验菌株对其耐药率 仍高于40.0,这可能是与过去药物的残留有关. 氟苯尼考属于氯霉素的同类物,在水产养殖业已广 泛应用,其耐药率也达到36.2以上. BroughtonEI等[7]研究了从广东省水产批发 市场的淡水养殖鱼(鲶鱼,罗非鱼,鲈鱼,鲤鱼)中分 离的5株沙门菌对16种抗生素的耐药性检测,发现 沙门菌对青霉素和红霉素的耐药率达100,而对新 霉素,头孢他啶和头孢噻肟表现敏感,有1株表现为 9重耐药.杨玲丽等[1]研究了养殖场动物,环境及 饲养员中分离的86株大肠埃希菌对13种抗生素的 耐药性,结果显示,所有菌株都对氨苄西林,链霉素, 四环素,复方新诺明等表现出耐药性,并且证实多重 耐药大肠埃希菌会在三者间克隆传播.本试验从鱼 肠共分离出2O株大肠埃希菌和14株沙门菌,药敏 试验结果显示沙门菌的多重耐药程度要高于大肠埃 0一矗.I对一.I1_时otI时1_一曲_I0l1靠.I对一.1_譬ouII霄ls一?_I 己3 1OO动物医学进展2011年第32卷第6期(总第216期) 希菌,9重以上耐药沙门菌占13.0,甚至有1株表 现为12重耐药,耐药程度高于BroughtonEI等[7] 的研究. 水产养殖中抗生素的普遍使用,造成药物在鱼 体及环境中的残留,将导致或加速细菌耐药性的产 生,甚至造成多重耐药菌的出现,耐药菌所携带的耐 药基因可以互相转移传递,造成耐药基因的散播. 李爱华[2指出目前鱼类病原菌(沙门菌,嗜水气单胞 菌等)的耐药程度较高,并且耐药的病原菌还能够与 鱼体内的共生菌(如大肠埃希菌)互相传递耐药基 因,也有传递给人类细菌的可能性.本研究显示养 殖环境中试验菌的多重耐药现象严重,多为10重以 上耐药,因此在药物选择时应加以重视,避免使用耐 药程度高的抗生素,在药敏试验的基础上有针对性 的选择药物,最大限度的减少耐药菌在此生态体系 中蔓延. 本研究以后将会对耐药菌的耐药基因以及整合 子开展深入研究,以探寻其耐药机制,了解病原耐药 菌在鱼类及环境中的传播情况,并通过制定或采取 预防 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ,为指导抗生素合理使用,控制耐药菌的散 播提供参考依据.我们建议在对水产品细菌监测的 同时,还有必要对细菌耐药性进行监测,控制鱼类产 品中耐药菌株的产生及播散,虽然细菌耐药性监测 不能直接遏制耐药性的传播和蔓延,但却是采取控 制措施的依据和检验措施效果的凭证,将对防治细 菌感染起到积极的作用[4]. 参考文献: [1]崔晓文.动物源大肠杆菌耐药性与I型整合酶基因的研究[D]. 黑龙江哈尔滨:东北农业大学动物医学院,2005. [23李爱华.水产养殖中使用的抗菌药物及细菌耐药性[J].中国水 产科学,2002,9(1):88-89. [3]贾爱卿.猪沙门氏菌的临床分离鉴定及耐药性消除研究[D]. 湖北武汉.华中农业大学动物医学院,2006. [4]吴蜀豫.食品中沙门氏菌污染的主动监测及其耐药基因播散新 机制的研究[D].四川成都:四川大学华西公共卫生学院, 2004. [53陈希文,王雄清,代敏,等.绵阳地区猪源致病性大肠杆菌的 耐药性监测口].江苏农业科学,2007(1):131-132. [63李灶平.食品中大肠埃希氏,沙门氏菌耐药性与整合子的关系 研究[D].四川成都:四川大学华西公共卫生学院,2004. [7]BroughtonEI,WalkerDG.Prevalenceofantibiotic-resistant SalmonellainfishinGuangdong,China[J].FoodbornePathog Dis,2009,6(4):519-521. [8]ChenJ,GriffithsMW.PCRdifferentiationofEscherichiacoli fromotherGram-negativebacteriausingprimersderivedfrom thenucleotidesequencesflankingthegeneencodingtheuniver— salstressprotein[J].SociApplMicrobiol,1998,27;369—371. [93JenkinsMB,EndaleDM,FisherDS.Mostprobablenumber methodologyforquantifyingdiluteconcentrationsandfluxesof Salmonellainsurfacewaters[J].JAppMicrobiol,2007,1398: 1-7. [1O]羊云飞.多重PCR检测沙门氏菌,大肠杆菌对磺胺类,氯霉素 类药物耐药基因的研究[D].四川雅安:四川I农业大学动物科 技学院,2004. [11]刘维红.猪沙门氏菌耐药基因检测方法的建立及其应用[D]. 湖北武汉:华中农业大学动物医学院,2006. 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StudyontheAntibioticResistanceofEscherichiacoliand SalmonellafromFishPondEcosystem chao CONGLi,LIJun-qiao,WUXi—yang,YUHui,LINLi— (1.DepartmentofFoodScienceandEngineering,Ji~anUniversity,Guangzhou,Guangdong,510632,China; 2.CollegeofScienceandTechnologeofFoshan,Nanhai,Guangdong,Guangdong,528231,China) Abstract:ToknowtheantibioticresistanceofEscherichiacoliandSalmonellafromfishpondecosystem, forty—sevenE.colistrainsandtwenty—threeSalmonellastrainswereisolat edfromgrasscarps”intestinecon— tents,pondecosystemsuchaswaterandsoi1fromFoshan,Guangdong.Thenallisolatesweretestedfor theirsensitivitiesto15antibioticsbyKirby—Bauer(KB)method.Resultssho wthatal1isolateswereresist- anttooneormoreantibiotics,whichappearedthedrugresistancetoampicillin,nalidixicacid,penicillin andtetracyclineatthesametime,andtheantibioticresistanceratestoceftazidime,cefotaximeandnitro- furantoinwerelowerthanthattoothers.Theresistanceprofileshowedthatthedegreeofmulti-drugre- sistantofE.coliwashigherthanthatofSalmonella,andtheantibioticresistanceprofilewaswiderthanof drugresistancethatisolatedfromwaterand Salmonella;thedegreeofmulti— soilwashigherthanthatfrom theintestinalcontents,buttheantibioticresistanceprofilewasnarrowerthanthatfromtheintestinalcon— tents.Theresultsindicatedmulti—drugresistantE.coliandSalmonellaweres evereinthefishpondecosys— tern.Therefore,thereasonableuseofantibioticsisnecessary. Keywords:fishpond;grasscarp;Escherichiacoli;Salmonella;antibioticresistance