[word格式] β基因对人膀胱移行细胞癌系253JB-V^R体外增殖及凋亡的影响

[word格式] β基因对人膀胱移行细胞癌系253JB-V^R体外增殖及凋亡的影响 [标签:标题] 山东医药2008年第48卷第8期 干扰素一13基因对人膀胱移行细胞癌系 253JB-VR体外增殖及凋亡的影响 ,刘丙乾,程川宇 张辉,武玉东,马军 (1郑州大学第一附属医院,河南郑州450052;2郑州大学第二附属医院) [摘要]目的为膀胱癌的基因治疗提供理论依据.方法以重组腺病毒AdhlFN.13转染人膀胱移行细胞癌 细胞(TCC)系253JB—V,应用RT.PCR检测hIFN.B基因在253JB.V中的表达,应用细胞生长抑制试验,集落形成 能力试验检测hIFN.B基因对253JB.V细胞体外增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期改变情况.结果 转染病毒量为40MOI时即可获得>95%的转染效率.夕源性hIFN.B基因可在253JB?V细胞中表达;转染hIFN?p 基因后253JB.V细胞凋亡率升高.结论Ad介导的hIFN.B基因能诱导膀胱癌细胞在体外发生凋亡,此为膀胱 癌的基因治疗提供了理论依据. [关键词]腺病毒载体;干扰素.B;膀胱癌;基因疗法;细胞凋亡 [中图分类号]R737.14[文献标识码]A[文章编 号]1002-266X(2008)08-0006-03 Effectsofadenovirus-mediatedhlFN-Bgenetherapyofhumanbladdercarcinomacellsinvitro ZHANGHui,WUYu一如,,MAJun,LIUBing-qian,CHENGChuan-yu (1TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,尸.R.China) Abstract:ObjectiveTostudytheeffectsofadenovims?mediatedhumanIFN—Bgeneinducinghumanbladdercarci? nomacellline253JB.Vapoptosisinvitro.MethodshlFN—Bgenewastransdu cedinto253JB—V”censmediatedbya recombinantadenovimsandthenthehIFN—Bexpressionwasdetectedbyim munocytochemicalmethod.Theeffectsofre— combinantAdhlFN?Bgeneinducing253JB?Vcensapoptosisweredetectedbyflowcytometry.ResultsThetitersof AdhIFN.Breached2X10”pfu/mlandmorethan95%of253JB?VceHscouldbeinfectedby40MOI(multiplicityofin? fection)AdhlFN.B.TheresultsofimmunocytochemicalmethodshowedobvioushIFN.pproteinin253JB-Vcellsafter transfection.Theapoptosisof253JB—Vcellswaseasilyobservedafterbeing transfectedwithrecombinantAdhlFN—B. Flowcytometrywasusedtocomparetheresultswiththatofthecontrolcells.ConclusionAdenovirus?mediatedinterferon? betagenecaninducehumanbladdercarcinomacellline253JB—Vapoptosisinvitro.Thisexperimentprovidesanelemen. tar,/basisforthegenetherapyofbladdercarcinomabyusingthehlFN?Bgene. Keywords:adenovimsvector;IFN—Bgene;bladdercarcinoma;genetherap y;transfection 膀胱癌发病率在全球范围内居恶性肿瘤第9 位,2002年年龄标准化发病率男性为10.1/10 万….不同种族的膀胱癌组织类型不同,大多数国 家以移行细胞癌(TCC)为主(?90%).约10%的 确诊患者最终发展为肌层浸润性膀胱癌或转移性膀 胱癌J.2007年l2月,我们观察了腺病毒介导的 干扰素(IVN)一13基因对人膀胱癌TCC系253JB—V 体外增殖及凋亡的影响,旨在为膀胱癌的基因治疗 提供理论依据. 1材料 光学显微镜,倒置显微镜(日本Olympus公 司),腺病毒纯化试剂盒(TAKARA公司),HEK293 细胞(人胚肾细胞),253JB.V人膀胱TCC细胞 (中国医学科学院提供),Hochest染料(上海华舜生 6 物工程有限公司),山羊抗人IFN.13(hlFN.13)多克隆 抗体(SantaCruz公司);hlFN一13基因重组腺病毒载 体(取自郑州大学第二附属医院消化疾病研究所, 方法详见文献),对照空载体病毒AdGFP(汪保灿 博士赠送). 2方法 2.1肿瘤细胞培养253JB—V人TCC肿瘤细胞 行单层培养,培养液(CMEM)为MEM+10%胎牛血 清+2mML一谷氨酰胺+丙酮酸钠+非必需氨基酸 +100u/Hd青霉素+100g/ml链霉素+维生素. 通过肉瘤病毒40(SV40)转化使鼠肺上皮细胞 (MLECs)保存在CMEM中.253JB.V用0.025% 胰蛋白酶,0.01%依地酸(EDTA)溶液采集.培养 瓶轻敲分离细胞.细胞CMEM洗涤,再次在Hanks 山东医药2008年第48卷第8期 平衡盐液(HBSS)中悬浮. 2.2重组腺病毒扩增,纯化及滴度测定以1O MOI(multiplisityofinfection)的AdhIFN—B感染9O% 汇合的HEK293细胞,3—5d收集细胞,PBS重悬, 于一2O?和37?中反复冻融3次,然后于4?以6 000r/min(离心半径为13cm)离心5min,保留上 清.如此反复进行2轮扩增,按腺病毒纯化试剂盒 说明书纯化病毒.空斑计数法测定病毒滴度.培养 10d后计数空斑数量,病毒滴度(pfu/m1):空斑数 量×病毒稀释度.将病毒上清于一8O?中保存. 2.3病毒和转染细胞的鉴定采用RT—PCR法测 定AdhIFN—B在253JB—V细胞中的表达.?细胞 总RNA抽提:收集感染AdIFN—B48h的253细胞 和AdGFP感染的253细胞以及未感染的253细胞, 吸去细胞培养液,分别以1mlTrizol用移液器上下 抽吸直到细胞充分裂解.收集于15ml离心管,室 温下置5min,加入氯仿0.2ml,充分震荡,室温下置 2—3min,于4?中以12000r/min离心15rain,取 上层透明带,加入异丙醇0.5ml,充分震荡,室温下 置10min,于4?中以12000r/min离心10min,弃 上清,加75%乙醇0.7rnl重悬RNA沉淀后,于4? 中以7500r/min离心5min,弃上清,DEPC水3Ol 溶解干燥后的RNA,使用分光光度计测定OD:印值, 配成工作浓度(1g/tzl及0.1g/tz1).通过1%琼 脂糖凝胶电泳检测RNA完整性.?逆转录反应: 取oligodT1tzl,RNA0.5g,dNTP1tzl和ddH2O 6tzl于65?中置5min,0oC中置5min,加入5× first—s~andBuffer4tzl和D33”2tzl混匀后,于42? 中置2min,再加入SuperscriptlI1lrl,于42?中 孵育50min,70oC中置15min后得到逆转录产物, 使用分光光度计测定OD印值,配成工作浓度(0.1 g/lr1).?PCR反应:以逆转录产物2为模板,同 时以GAPDH在相同反应条件下进行PCR反应作为 内参照.按试剂盒说明进行RT—PCR反应.hIFN—B 基因PCR引物由上海生工公司合成:上游:5一 CGGGGTACCATGAC—CAACAAGTGTCTC一3,下游:5一 GCCCAAGCTrrCAGTFrCGGAGG一3.从人基因 组DNA扩增hIFN.B基因作为阳性对照.?电泳:各 组RT—PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定. 2.4重组腺病毒对253JB—V细胞的转染及其转 染率测定取处于对数生长期,生长状态良好的 253JB—V细胞1×10个接种至12孔板,待贴壁生 长至80%左右,每孔分别加入1O,2O,3O,4O,50MOI 的AdhlFN—B和AdGFP,加入少许培养基,每隔15 min震荡培养基1次,使病毒与细胞充分接触,9O min后加入完全培养基3ml继续在37oC,5%CO 孵箱中培养.48h后荧光显微镜下观察细胞的 AdGFP表达.随机选取3个视野计数细胞,发绿色 荧光的细胞占全部细胞的百分率即为转染率. 2.5hlFN—B基因转染后253JB—V细胞凋亡率测 定取各组转染后细胞各1瓶,无菌条件下收集培 养液并离心,加入1×BindingBuffer,调整细胞浓度 为1×10./ml,取100tzl细胞液至5?d管中,加入5 tzlAnnexmV—FITC,10tzlPI混匀,室温下避光孵育 15min,每管中加入1×BindingBuffer400tzl,1h内 流式细胞仪检测,同时设空载体转染细胞组和未转 染细胞组作为对照. 2.6hlF’NB基因在253JB—V细胞中的表达检测 采用免疫组化法,备各组细胞爬片,常规接种,培 养,感染细胞,3d后用4%多聚甲醛固定30min,按 照试剂盒说明进行操作. 2.7肿瘤细胞集落形成能力(克隆形成率)用3O MOI的AdhlFNB和AdGFP分别感染253JB—V细 胞,24h后消化细胞并计数,调节浓度为2×10/ ml,取感染组及空白对照组细胞各0.1ml,分别接种 于6孔板中,每样本设3个复孔.2周后倒置相差 显微镜下观察克隆形成情况.克隆形成率=各孔平 均克隆数/接种细胞数×100%. 2.8统计学方法采用SPSS10.0软件.数据分别 行配对t检验和检验,检验水准=0.05. 3结果 3.1重组AdhIFN—B基因的扩增及滴度测定 AdhIFN—B对253细胞的转染率随MOI值升高而提 高,48h后1O,2O,30MOI的AdhIFN—B对253细胞 的转染率分别为35%,64%,96%.确定以下实验 的感染剂量为30MOI.空斑计数法测定重组 AdhIFN—B滴度为2×10”pfu/ml. 3.2病毒和转染细胞鉴定AdhIFN—B感染253细 胞后,抽提细胞总RNA,分光光度计测定OD60/ OD280值介于1.8—2.0,说明RNA未被污染;1%琼 脂糖凝胶电泳显示28S和18S及5S三条带,与预 计长度一致.RT—PCR法检测显示IFN—B在253细 胞中表达明显增强(696bp),对照组未见表达. 3.3hIFN—B基因转染后253JB—V细胞凋亡率 凋亡率AdhIFN组为32.65%,空白对照组为 1.68%,空白载体组为2.32%,AdhlFN组显着高于 其他两组,P均<0.01. 3.4肿瘤细胞集落形成能力对照组细胞平均形 成125个集落,克隆形成率为(62.74-3.51)%;而 AdhIFN—B感染后的253细胞无克隆形成,与对照组 7 比较差异有显着性(t=31.3,P<0.O1);AdGFP感 染后的253细胞平均形成117个集落,克隆形成率 为(58.74-4.32)%,与对照组比较差异无显着性(t =1.49,P>0.05). 4讨论 70%一80%的膀胱癌为低度恶性的局限于黏 膜层内的非侵袭性肿瘤,此类患者可行膀胱镜电切 术治疗HJ,但其中60%一70%的浅表肿瘤易复发, 约30%的肿瘤恶性程度加重或者转移.至少10% 的浅表膀胱癌患者须接受膀胱切除术,其中30%死 于转移性膀胱癌.膀胱内基因治疗为顽固性浅表膀 胱癌患者提供了新的治疗途径.从实际应用角度 看,膀胱癌的基因治疗策略可分为三类J:?直接 抑制肿瘤生长或杀伤肿瘤细胞,包括肿瘤抑制基因 治疗,反义基因治疗和药物前体基因治疗;?依靠 增强机体免疫系统间接杀伤肿瘤细胞,即免疫基因 治疗;?提高其他肿瘤治疗方法的疗效和机体的耐 受力,包括药物增敏基因治疗和保护性基因治疗. TCC是评价基因治疗的理想标靶,因为载体能相对 容易地被直接地导人膀胱,潜在地产生靶器官的转 基因表达.由AdIFN—B产生的广泛的旁观者效应 使其成为基因治疗的一个靶点. IFN是一个通过调节天然糖蛋白而调整细胞生 长和分化的家族,可抑制癌基因表达,上调细胞凋 亡,激活淋巴细胞,巨噬细胞,NK细胞.IFN—B或 IFN一能下调许多在诱导和维持脉管系统中起关键 作用的前血管形成因子的表达,从而通过内皮细胞 凋亡导致血管退化.长期应用IFN能抑制体外人 TCC的bFGF,IL-8和MMP-9的表达,继而抑制肿瘤 诱导的新生血管形成和肿瘤生长.目前,IFN已在 临床被有效用于对抗某些造血的赘生物,长期全身 ? 临床札记? 山东医药2008年第48卷第8期 低剂量应用可使一些血管瘤出现退行性变.药物代 谢动力学研究证实,IFN在人血液循环中的半衰期 仅几分钟.因为IFN有种属特殊性,有必要对肿瘤 细胞使用AdhlFN—p来激活应答,如AdhlFN—B转染 253JB—V可引发以细胞增殖减少为特征的宿主反 应,导致肿瘤细胞凋亡. 细胞凋亡是形态学上对细胞程序性死亡的描 述.Tomoda等用脂质体将hIFN—B目的基因导人子 宫颈癌细胞,结果发现转染hIFN—B后宫颈癌细胞能 以旁分泌形式分泌大量的hIFN—B,明显抑制官颈癌 细胞的生长,并诱导其发生凋亡.本研究证实,经 Ad转染后hlFN—B基因在人膀胱癌细胞253JB-V 中得到表达,并且细胞转染率随MOI值增大而升 高,病毒量为40MOI时转染率最高(>95%);膀胱 癌253JB—V细胞胞质中检测到目的基因的蛋白表 达产物;转染组凋亡峰值明显高于对照组. 本研究证实,Ad介导的hIFN—B基因在体外可 诱导膀胱癌细胞发生凋亡,此为膀胱癌的基因治疗 提供了理论依据. [参考文献] [1]ParkinMD,BrayF,FerlayJ,eta1.GlobalCancerStatistics[J]. CACancerjClin,2005,55(2):74—108. [2]UozumiJ,FujiyamaC,MeiriH,eta1.Hand?assistedretroperitone— oseopienephroureterectomyforupperurinary?tractumthelialtumors [J].JEndourol,2OO2,16(io):743-747. [3]陈小华,李印,马军,等.MFN?B基因重组腺病毒载体的构建 [J].胃肠病学和肝病学杂志,2006,15(2):106?108. [4]顾方六.尿路上皮肿瘤的诊断和治疗[M].济南:山东科学技术 出版社,2004:961-980. [5]WilliamsSG,SteinJP.Molecularpathwaysinbladdercancer[J]. UmlRes,2004,32(6):373-385. (收稿日期:2007.10-29) 克林霉素在菌痢治疗中的应用体会 姜燕飞.杜文娟.张韧闻 (胶州市人民中医医院,山东胶州266300) 近年来,我们应用克林霉素治疗菌痢30例,疗效满意. 现 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 体会. 临床资料:30例肠道门诊急性腹泻就诊患者,男16例, 女14例;年龄20—66岁.发病1—3d就诊.腹泻3—5次/ d者14例,6次/d者16例;脱水为轻度14例,中度13冽,重 度3例.体温37.5—39.5?.大便检查确诊为菌痢.30例 患者均静滴克林霉素磷酸酯氯化钠注射液100ml,2次/d. 8 并根据脱水程度静滴液体.结果治疗1d症状消失18例, 治疗2d症状消失12例. 讨论:菌痢是由痢疾杆菌(革兰阴性菌)引起的肠道传染 病,以结肠的化脓性,溃疡性炎症为基本病理改变.细菌经口 进入体内后先附着于肠黏膜上皮细胞表面,继而侵入细胞内 增殖,且有大量黏液及纤维蛋白渗出,形成假膜,导致黏膜上 皮坏死,形成小而表浅的溃疡.克林霉索属林可酰胺类抗生 索,对需氧革兰阳性球菌,厌氧革兰阴性杆菌属,厌氧革兰阳 性不产芽孢杆菌属,厌氧和微需氧的革兰阳性杆菌属均有活 性作用.可通过抑制痢疾杆菌的活性达到缓急止痛之功,尽 早使用可尽快控制病情.该药用氯化钠液配制,尤适宜于糖 尿病性腹泻患者,但应注意相对浓度.浓度低于0.9%症状消 失缓慢,需静滴3—5d.痢疾杆菌一般在体内潜伏7—14d. 我们体会,临床症状消失后尚应继续口服对痢疾杆菌有活性 的抗生素及胃肠黏膜修复剂,维持用药1周.