[doc格式] 益气养阴方抗肿瘤诱导鸡胚尿囊膜血管生成的研究

[doc格式] 益气养阴方抗肿瘤诱导鸡胚尿囊膜血管生成的研究 益气养阴方抗肿瘤诱导鸡胚尿囊膜血管生 成的研究 中西医结合心脑血管病杂志2OO9年5月第7卷第5期?557? 沈皓,蔡德培,陈伯英.补肾中药对下丘脑一垂体促性腺机能的影 响FJ].中西医结合,2004,2(1):53—57. 钱风雷,曾繁辉,冯炜权.补肾中药对运动大鼠下丘脑一垂体一性腺 轴功能的调节作用[J].中国运动医学杂志,2005,24(5):571— 575. 娄艳,陈志良,王春霞.齐墩果酸对更年期大鼠作用的实验研究 [J].中药材,2005,28(7):584—587. 李作洲,徐艳琴.王瑛.等.淫羊藿属药用植物的研究现状与展望 EJ].中草药,2005,36(2):289—295. BahhazartJ,BallGF.Topographyinthepreoptieregion:Differen— tialregulationofappetitiveandconsummatorymalesexualbehaviors [J].FrontNeuroendocrinol,2007.28(4):161—178. [163CesenaTI.CuiTX.Piwien—PilipukG.Multiplemechanismsof growthhormone—regulatedgenetranscriptionEJ].MolGenet Metab,2007.90(2):126—133. 作者简介:田允(1982一),女,现为福建中医学院2007级硕士研究生(邮 编:350108);蔡晶(通讯作者),工作于福建中医学院,福建中西医结合研 究院(邮编:350108). (收稿日期:2008—10—28) (本文编辑王雅洁) 益气养阴方抗肿瘤诱导鸡胚尿囊膜血管生成的研究 张栋,孙静 摘要:目的研究益气养阴方抗肿瘤细胞诱导鸡胚尿囊膜(cAM)血管生成的效应.方法制备接种肿瘤细胞的CAM模型,采 用血清药理学方法制备含药血清.观察含药血清对肿瘤细胞诱导CAM血管生成的影响,并与生理盐水血清组对照.结果益气 养阴方含药血清可抑制肿瘤细胞诱导CAM血管生成,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论益气养阴方对肿瘤 细胞诱导的CAM血管生成有明显抑制作用. 关键词:益气养阴方;鸡胚尿囊膜移植瘤#血管生成 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1672—1349(2009)05—0557一O2 新生毛细血管的形成对原发肿瘤细胞本身的增殖和生长是 必不可少的,同时也是肿瘤侵袭转移的必需条件.笔者对益气 养阴方抗肿瘤机制的研究从1994年即开展,前期实验已证实本 方具有促分化,诱导肿瘤细胞凋亡,调节肿瘤相关基因表达等作 用.近年来发现本方具有抑制鸡胚尿囊膜(chickchori0allantoic membrane,CAM)血管生长的作用[J]现进一步研究对肿瘤诱 导CAM血管生成的影响,探究抗肿瘤途径及作用机制. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1动物及瘤株8周龄雄性Wistar大鼠4O只,体重(200? 20)g,SPF级,由山东大学实验动物中心提供(动物合格证号: 鲁动质字200301003).HO8910PM高转移人卵巢癌细胞株,购 自浙江省肿瘤研究所. 1.2药品及试剂益气养阴方(黄芪,白花蛇舌草,小蓟,太子 参,半枝莲,蒲公英各3og,生地黄,黄精,女贞子各24g,旱莲草 18g,天冬,麦冬各15g,白术,茯苓各12g,甘草5g)购自建联 中药店,经山东中医药大学中药专家鉴定质量符合实验要求;明 胶海绵(广西荔浦明胶药业有限公司,批号:3640872);灭菌胎牛 血清(杭州四季青生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 材料研究所);RPMI一1640培养液 (Hyclone);胰蛋白酶(Difco公司,上海化学试剂采购站分装). 1.3仪器恒温孵育箱(山东潍坊医疗器械厂);医用图像 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪(Image—ProPlus,美国);照相机(KODAKDC290ZOOM,日 本);冷光源,解剖显微镜(美国光学仪器公司). 1.4方法 1.4.1药物血清的制备常规方法制备益气养阴方水煎液,浓 缩至相当于原生药材2.97g/mL药液,冷却装入灭菌药瓶,置4 ?冰箱备用.实验大鼠随机分为两组,每组10只,即对照血清 组和含药血清组.含药血清组按人鼠等效剂量换算给药,按 29.7g/(kg?d)灌胃中药,0.5mL/100g,每天2次.连续灌胃 5d,最后1d改为1次给予1mI/100g.对照血清组灌胃相同 体积生理盐水.大鼠最后1次给药2h后用1O水合氯醛0.3 mL/lO0g麻醉,下腔静脉无菌采血5mL,3000r/rain,25min 离心,取血清,密封置一2O?冰箱保存备用. 1.4.2瘤细胞的培养和传代参考文献[2]方法将 HO8910PM高转移人卵巢癌细胞株培养于含lO新生小牛血 清和青霉素,链霉素的RPMI一1640培养液中,放人37?,5% CO:浓度的培养箱中培养,按1:3的比例传代(O.25胰蛋白 酶,37?,5min). 1.4.3肿瘤诱导CAM血管生长 1.4.3.1鸡胚的制备选择白皮海兰种蛋,孵育于恒温孵育箱 中,温度(37.8土0.5)?,湿度65,7O.选用7d鸡胚参考 文献[33方法加以改进进行假气室的制备,用无菌透明胶带纸封 闭假气室. 1.4.3.2瘤细胞接种参考文献[43方法取对数生长期肿瘤细 胞,0.25胰酶消化.用RPMI21640培养液调整细胞浓度至 1XlOs/o.1mL,用微量进样器取0.1nlL的细胞悬液接种至8d的 CAM相对无血管区,无菌透明胶带纸封闭,继续孵育2d. 1.4.3.3给药方法建立好假气室之后,将无菌明胶海绵小块 (4mmX4minx4ram)置于近胚头1em处两条前卵黄静脉之 间的相对无血管区,然后以微量进样器向明胶海绵加入100”L 对照血清和含药血清,用无菌透明胶带纸封闭卵壳口. 1.4.3.4观察方法从瘤细胞接种后第2天,第4天,第6天, 第8天,第10天分别观察肿瘤细胞诱导血管生成情况,并选择 继续孵育8d后的鸡胚,撕开窗口,剥离假气室周围的蛋壳,使 CAM充分暴露,置于解剖显微镜下以明胶海绵为中心观察 CAM血管并照相,并取肿瘤组织进行组织学观察. 1_4.3.5检测指标及方法将拍摄好的图像调入软件,参考田 叼幻妇 n口口I=In ?558?CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARDI O一/CEREBROVASCULARDISEASEMay2009Vo1.7’No.5 氏计数法],计数血管数目和血管的面积,并且光镜下观察 CAM移植瘤组织生长情况. 1.5统计学处理计量资料用均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(i?s)表示,用单 因素方差分析(one—WayAN0VA)进行比较,用SPSS14.0软 件进行统计分析,以P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1肿瘤细胞诱导的CAM血管生成情况解剖显微镜下观 察到接种瘤细胞的CAM第2天出现较弱的血管反应,部分鸡 胚可见少量较细的血管向接种区生长,但未形成肉眼可见移植 瘤;从瘤细胞接种后第3天开始,CAM上出现肉眼可见微小的 白色肿瘤结节,并观察到部分CAM本身大血管向接种区弯曲 集中并相应扩张,出现接种区周围血管增多并向接种区呈放射 状集中,并且有从瘤体上爬行的现象;4d,6d血管及瘤细胞生 长旺盛,血管长人或跨越接种区,出现血管化现象,可见CAM 上小血管向结节处辐辏集中现象;7d--8d后血管及瘤细胞生 长速度减慢;9d,10d接种区出现中心性出血坏死,含药血清 组CAM血管呈树枝状走行,无明显”血管辐辏现象”,血管密度 低于对照血清组. 2.2CAM移植瘤的形态学观察光学显微镜下观察可见 CAM移植瘤分化较差,瘤细胞多呈圆形或椭圆形,有的形态不 规则,体积大,可见瘤巨细胞,胞浆少,核大深染,异型性明显,核 分裂象多见;瘤结节周围有增生的纤维结缔组织包绕,在间质内 成巢状或条索状分布,个别瘤细胞可在问质中分散存在;瘤体周 围可见新生血管,并且肿瘤浸润边缘血管明显多于瘤体内血管; 血管多呈窦状扩张,管壁结构不完整;部分血管腔内可见瘤细胞 聚集形成瘤栓;瘤体周围有较多炎细胞浸润. 2.3肿瘤诱导cAM血管生成情况比较含药血清组血管数 目与血管面积较对照血清组均减少(P<O.05).详见表1. 表1益气养阴方对肿瘤诱导CAM血管生成的影响(?s) 与对照血清组比较,1)P<0.05 3讨论 自20世纪7O年代Folkman首先提出抗血管生成(anti— angiogenesis)理论至今,人们对血管形成的机制等方面的研究 已取得较大进展,发现抗新生血管生成战略在抗肿瘤中相对常 规化疗方法具有更大的优势.抑制肿瘤血管生成,就可阻断肿 瘤营养供应,达到”饿死”肿瘤的目的,切断肿瘤组织获得营养途 径已经成为新的肿瘤治疗靶点].原发肿瘤血管形成是肿瘤转 移的开始,继发转移瘤血管形成则是转移瘤灶真正形成的落实, 抑制肿瘤新生血管的形成一方面能遏制原发肿瘤侵袭进入脉管 系统,使之不发生转移.另一方面对已经形成微小转移瘤灶也 起到抑制增殖发展的作用.由于肿瘤血管的形成对肿瘤的生 长,浸润,转移整个反复连锁过程中具有明显的影响,因此,切断 其生长和转移所依赖的”命脉”成为抗肿瘤转移的重要战略. 益气养阴方是着名中西医结合专家顾振东教授数十年临床 治疗肿瘤的经验方,该方从中医整体观点出发,辨证论治,针对 肿瘤转移的病变特点注重标本兼顾,功邪而不伤正,扶正而不留 邪,从而取得了临床治疗肿瘤较好的疗效.本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组前期的动 物实验研究证实,该方具有抑制肿瘤生长和转移的作用,其作用 机制与提高机体免疫功能,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制血管生成等 有关. CAM模型常用于血管新生促进或抑制的研究,具有周期 短,成本低,易于大样本重复等特点,且观察结果客观可靠[8],是 目前研究血管新生常用的活体模型之一,也是研究血管生成的 经典方法,被广泛地应用到血管生成实验的各领域.但近年来 人们也逐渐认识到,肿瘤组织新生血管内皮细胞与正常组织血 管内皮细胞存在差异,长期以来由于缺乏肿瘤源性微血管内皮 细胞分离培养体系和此类细胞系,体外研究肿瘤血管生成时一 直都使用源于正常血管内皮细胞甚至内皮细胞样细胞系.因 此,分离和培养肿瘤源性微血管内皮细胞在研究肿瘤血管生成 机制和抗血管生成药物筛选具有重要意义;另外,目前研究血管 生成抑制剂的筛选实验多经体外实验观察对血管内皮细胞增殖 能力的影响,缺乏体内实验的深入研究.因为许多药物虽然在 体外实验中具有良好的抗血管生成能力,但体内实验时对肿瘤 的血管依赖性生长则无明显影响.应用CAM模型是把鸡胚本 身的正常血管作为研究对象,这样在研究血管生成机制或筛选 抗血管生成药时缺乏肿瘤血管特异性.为探究本方抗肿瘤途径 及作用机制,进一步深入研究,观察研究益气养阴方抗肿瘤诱导 CAM血管生成的效应.结果显示益气养阴方含药血清可抑制 肿瘤诱导CAM血管生成,与对照血清组比较差异具有统计学 意义(P<O.05).因此进一步深入了解肿瘤血管生成的分子机 制,直接针对肿瘤血管生成的各个环节(如血管内皮细胞,基底 膜,基质水解酶,胞外基质分子,血管生长因子及其受体等)选择 合适的靶部位将为从抗血管生成途径治疗肿瘤提供新的思路. 参考文献: [1]孙静.益气养阴方对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响EJ]. 中华中医药学刊,2008,26(7):1526—1528. 82]司徒镇强.是军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司,2004: 128. [3]付生法.检测血管生长因子作用的鸡胚尿囊膜技术[J].军事医学 科学院院刊,I993,17(4):294—297. [4]杨丽华,王凯峰,周轶平,等.人卵巢癌鸡胚尿囊膜血管生成模型的 建立[J].现代妇产科进展,2003,12(6):407—409. [5]田牛.微循环[M].北京:科学出版社,1980:342. 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