中国红豆杉悬浮细胞培养的发酵动力学模型

中国红豆杉悬浮细胞培养的发酵动力学模型 中国红豆杉悬浮细胞培养的发酵动力学模 型 - l6-广州化工2001年第29卷第1期 中国红豆杉悬浮细胞培养的发酵动力学模型 汤志群梅兴国余斐 (华中理工大学生物工程系,武汉430074) 摘要通过对10L发酵罐中中国红豆杉细胞培养的代谢动力学分析,建立了细胞生 长,底物消耗,紫杉醇台成动力 学模型,并应用实验数据回归了动力学模型参数,并将模型预测值与实验值进行比 较.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,模型预测值与实验值较吻 台. 关键词中国红豆杉,紫杉醇.发酵培养,动力学模型 FermentationKineticModelsforTaxusChineseCellSuspensionCulture TangZhiqunMeiYmlggeoYuFei (DepartmentofBioengineering,HuazhongUniversityofSc1&Tech.,Wuhan430074) AbstractThemetabolickineticsforTaxusChinesecellwerearIa1yzedThekineticmodelsofc ellgrowth, nutrientuptake,taxolformationwereestablished,andthemodelparameterswerereg~edwit hthe experimentaldata.ThesimulatedL311"V~bythemodelwereingoodagreementwiththeexp erimentaldata. KeyworasTaxusChinesetaxolfermentationkineticmodd 红豆杉是一种生长缓慢的木本裸子植物,其树 皮中所含的紫杉醇是一种具有强抗癌活性的二萜类 化合物,但含量极低,仅为0.01%.为了解决紫杉 醇的稳定供应问题,国内外学者围绕化学合成,人工 栽培,组织和细胞培养等领域进行了许多工作,取得 了令人瞩目的进展.近年来,国内外研究者在细胞 培养方面的主要工作集中在培养基的优化,代谢调 控及发酵 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 条件的考察等方面'1J,培养规模已达 中试水平,紫杉醇的产量也逐渐提高,本实验室在中 国红豆杉细胞培养中其含量已达到40mL/L.如何 将这种高产率稳定地保持到大规模培养中,尚需作 进一步的研究.细胞培养要达到工业规模的应用, 须建立培养过程动力学模型,目前植物细胞的动力 学研究除了几种典型植物如长春花'2等有工业化 的倾向外,大多数植物细胞培养的研究不够深入. 所以,本文在研究红豆杉细胞的代谢动力学的基础 上研究了其发酵动力学,建立了发酵过程中细胞生 长及紫杉醇合成动力学模型. l材料和方法 1.1实验材料 (1)细胞株:供试的红豆杉细胞来源于已连续继 代20代以上的中国红豆杉(TaxusChinese)愈伤组 织无性系. (2)培养基:采用MS培养基.添加6一BA 0.5mL/L,NAA0.5mg/L,2,4一D0.1mg/L,肌 醇100mg/L,水解乳蛋白0.5g/L,灭菌前调vH值 5.8. 1.2发酵工艺 将3瓶2L摇瓶培养的红豆杉细胞接人10L机 械通气搅拌式反应器.工作体积8升,温度25?, 转速60rpm,通气量0.4L/L?rain.采用批式培养. 取样时关闭出气口.从取样口取出50mL细胞 悬浮液,同时取两次,并加入无菌水100mL. L3分析方法 (1)细胞鲜重,干重的检测:将细胞培养物减压 抽滤,滤饼用蒸馏水洗净,称鲜重,然后于60?下烘 24h,称其干重以细胞干重作为其生长的指标; (2)培养液pH值的测定:采用pHs一3c精密酸 度计测定; (3)总糖和还原糖的测定:用DNS法测定?; (4)磷酸盐的测定:用磷钼蓝显色法测定磷酸根 离子含量l3: (5)紫杉醇含量的测定:按参考文献【4的HPLC 2001年第29卷第1期广州化工?17? 法测定结果取3次重复的平均值. 2动力学模型 0510I520253035 时闭:, 图1反应器细胞生长与产物合成动力学曲线 ?干重?pH?紫杉醇 叠 旨一 时 龋 0510152025303j 时?E](天) 图2反应器中营养消耗动力学曲线 ?蔗糖?葡萄糖?磷酸盐 由图1知,红豆杉悬浮细胞在10L反应器中的 生长曲线为S形,其延滞期约为5天,指数生长期出 现在5,20天,此后进入稳定期.整个培养过程中 pH值始终在5.3--6之问波动,这表明培养基的缓 冲能力能够满足植物细胞培养全过程对pH的要 求.由图2可知,糖的消耗较快,尤其是在指数期, 葡萄糖在第7天达到最大值,当糖几乎耗尽时,细胞 已进入稳定期,此时的糖主要维持细胞的正常生理 代谢以及次级代谢产物的合成.磷酸盐一直呈下降 趋势,在10天内利用较缓慢,之后,利用速度加快, 到第20天时培养基中几乎检测不到无机磷的存在, 但是磷酸盐并没有成为生长限制因子.在培养前期 培养基就渐渐变红,说明有色素合成,从而造成细胞 生长缓慢,但分泌的棕色色素与紫杉醇的合成并没 有明显的相关性.在生长期基本上无紫杉醇积累, 从第l5天产物开始合成,紫杉醇的最大产量为 1.32?1g/g,可见其合成主要是在细胞进入稳定期之 后进行的,与细胞生长无相关性,这与其他的红豆杉 细胞基本相同. 根据以上分析,并参照1995年Guardiole建立 的葡萄细胞培养的动力学模型L7J,假设: (1)糖是细胞生长和次级代谢生产的限制性基 质; (2)次级代谢物的分解及细胞浓度无关. 在此假设下,可将糖的利用途径表示为: s ?三弓..::./ 由此可将红豆杉细胞发酵培养的生产,底物消 耗,产物合成的模型描述如下: i1dx=, 一F2(s)一x.t一[1一Ft(s)](1) il五ds=一些F2(s)一msF(s)一(s)(2) 睾:x?,一F3(s)一pkd(3) 对(1),(3)式中Fl(s),F2(s),F3(s)均易知: Fi(0)=0,Fi(o.)=1,(i=1,2,3) 在此,对Fi(s)采用Monod模型,即: 式(1),(4)构成了红豆杉细胞发酵过程中细胞生长 及紫杉醇形成的动力学模型,该模型共含10个参 数. 3模型求解 上述动力学模型为一个非线性方程组,采用四 阶Runge—Kutte方法求解.用单纯形法对模型参 数进行估值.通过对10L发酵罐的发酵实验数据 进行回归,得到上述模型中各个参数值见表1. lll100000 蛐?L三蚰0 加圬加0 一:,新嘶 一崔缸掌一, 18广州化工2001年第29卷第1期 表1发酵培养动力学模型的参数预测值 o51o1520253035 嗍(J 图4模型与实验数据之间的比较曲线 由图4可知.模型的拟合效果较好.X,P值的 计算值与实验值之间的平均相对误差分别为 2.6%,7.8%,由此可见,所提出的动力学模型能够 很好地描述红豆杉细胞发酵过程中细胞生长及产物 浓度的变化规律. 4讨论 一 个导致植物细胞大规模悬浮培养技术工业化 进程缓慢的重要原因就是缺乏对培养过程的透彻, 合理的动力学研究本文在研究其代谢动力学之 后,建立了红豆杉悬浮细胞在10L反应器中的非结 构模型.代谢动力学表明,紫杉醇的合成与细胞生 长是非相关性的,从而可以向紫草细胞那样,采用二 步培养法.所建立的动力学模型及回归所提的模型 参数值可以预测出发酵过程中细胞浓度,产物浓度 随时间的变化规律.由于植物的遗传背景及代谢机 理十分复杂,难于利用维生物的模型或其他的植物 细胞模型,本文仅是对红豆杉细胞作了一些尝试及 努力.如果能摆脱经验积累而采用反应器的自动测 控与人工智能的专家系统,那将是生化工程的一个 重大突破. 符号说明: s:糖P:次级代谢Pf:次级代谢产物 x:生物量Px:初级代谢产物 qs:基质的比消耗率 qD:紫杉醇的比合成率 qm:底物消耗用于维持细胞生存的比消耗率 qx:细胞的比生成率 :细胞的比消耗率 地:最大维持率 :紫杉醇的比生成率 kd:紫杉醇的比分解率 ,YD分别表示糖消耗得率系数与产物形成率系数 F1(s)表示qm与地之比 当底物浓度降低时,细胞有部分降解用于维持作用, 定义为1一F1(s) 以F2(s)表示. 以F3(s)表示/. 参考文献 1甘烦远.郑光植.鼓丽萍.云南植物研究,1996,18(2):134 —— 138 2WM.VanG~llk,H.J.G.Tea.H,andJJl~jnen, Kineti~andS呻ichhTofC,mwthofPlantCA1Cultures ofCatharanthusr口目EusandNiconanatabaeumin:Batchand (hn?惦Fm1朗凹s,Bi0echandBi0eng,1992,40,863 3李建武,萧能慧生物化学实验原理与方法,北京:北京大 学出版社.1994 4鲁明渡.苏湘鄂,梅兴国.华中理工大学,1998,26 (7):107--109 5WickreraeshneERM,AftraRN.Taxt~Ce1lCul~: ln~tiatioa,G~rthc】,曲l_啦d.l1,aH?证It;.nand TaProduction.Pl蚰tcdl,"ffLs~eandoI售anCulture, 1993,35:181 6LulsJPestehenker.SmaaC.P.d~m,andMichaelL. Shal~.kineticof口tmmhmti~andnutrientin susp~asloncultta~ofTax-uset~pidatainsI【eflasksanda wilson—type[fiorea~.E1me~cmbe.teehno1.,1996. 19:256 7J.Guardioh.J.LIborra.andM.Canovas,AModelThat LinksGrowthandse?laMetaboliteProdueti~in PlantCell&珥H1si?Cultures,Biotech&B~eng.1995, 46:291