免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶
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protocol
免疫共沉淀实验(Coimmunoprecipitation)
51,细胞接种和质粒转染:将消化完全的293T细胞(8×10)接种于6孔板,待
细胞密度达到50-70%时,按照
标准
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磷酸钙沉淀法进行转染;或者将消化完全5的BHK细胞或pk15细胞((8×10)接种于6孔板,按照Lipofectamine 2000
(Invitrogen) 转染试剂说明进行转染。
2,细胞蛋白的收取:细胞转染24h-36h后,弃取培养液,并用预冷PBS洗涤两
次。每孔加入200,l蛋白裂解液(50mM Tris.Hcl,PH 8.0;150mM Nacl; 5mM
EDTA,1% NP-40; 10% Glycerol, 配制成蛋白裂解基础液。使用前,加入100
×proteinase inhibitor cocktail 和10mM DTT)。冰上孵育10min,涡旋
1min,重复三次。4?,12000rpm,离心20min,收集上清,即为收取蛋白液。 TM 3,杂蛋白的去除:向收取蛋白液中加入20,l Gamma BindG Sepharose Beads ,
于 4?旋转摇床作用1h左右,以去除同Beads 非特异性结合的蛋白质。 4,4?,3000rpm,离心3min,取上清。BCA法测定蛋白浓度,并取500,g,调
整到500 ,l。加入到预先混匀的15 ,lBeads 和2,g 抗体中。颠倒混匀,4?
旋转摇床最慢速度作用,2h至过夜。
?,3000rpm,离心3min,去除上清,并使用Lysis Buffer 基础液洗涤三5,4
,l 2X Loading Buffer, 煮沸5-10min。4?,3000rpm,离次。最后加入20
心3min,取上清。
6,选用合适浓度的分离胶电泳。转印后进行Western blot检测。
激光共聚焦实验(Confocal assay) 1,将玻片(Fisher brand,cover slips)预先在培养基中浸润,轻轻放入培养板孔5内。接种293T细胞(1×10)于24孔板,待细胞密度达到50-70%时,按照
标准磷酸钙沉淀法进行转染。
2,转染20-24h后,去除培养液。用预冷的PBS洗涤三次。
3,细胞固定:每孔加入500,l固定剂(即1% 多聚甲醛,储存液为4%,临用前
用PBS稀释),室温下孵育15min。PBS洗涤三次。
4,细胞透化:每孔加入500,l 透化剂(即0.2%Triton X100,PBS配制)。冰上
孵育15min。PBS洗涤三次。
5,A: 如果使用pEGFP-N1/C1, 或者pDsRed-N1/C1 重组质粒进行转染,直接转
入下一步。
B:间接免疫荧光实验:室温下1%BSA封闭30min-1h;室温下孵育一抗1h;
PBS洗涤三次;室温下避光孵育二抗(FITC)35-40min;PBS洗涤三次;室
温下避光孵育第二个二抗(TexasRed,或罗丹明标记)35-40min;PBS洗涤
三次。
6,DAPI 染核:将200,l DAPI加入试验孔中,避光孵育3-5min。PBS洗涤三次。 7,玻片的封闭:滴一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上,轻轻取出玻片,正面(细胞
面)向下轻轻加到载玻片上。滴一滴中性树胶于玻片上,轻轻加上盖玻片。 8,制备好的玻片,于4?避光保存,或直接在共聚焦显微镜下观察。
荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter assay)
51,将消化好的293T细胞(1×10)接种于24孔板,待细胞密度达到50-70%时,按照标准磷酸钙沉淀法进行转染。
表
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达质粒及对照质粒为0.5,g/孔;荧光素酶报告基因质粒为100ng/孔;海肾酶对照质粒为10ng/孔。每组设三个重复。
2,转染后12h,24h,48h,按照双重特异性报告基因试剂盒(Promega产品)说明检测荧光素酶活性。以海肾酶荧光素酶活性为基础,计算报告基因的萤火虫荧光素酶相对活性。
3,对不同刺激下报告基因的变化:在转染后18h,加入相应的刺激物:Poly( I:C)(25,g/ml);TNFα(20ng/ml),或者LPS(25ng/ml)。分别在刺激后0h,6h,12h,24h,收取细胞,按照按照双重特异性报告基因试剂盒(Promega产品)说明检测荧光素酶活性。以海肾酶荧光素酶活性为基础,计算报告基因的萤火虫荧光素酶相对活性。