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免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶报告protocol

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免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶报告protocol免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶报告protocol 免疫共沉淀实验(Coimmunoprecipitation) 51,细胞接种和质粒转染:将消化完全的293T细胞(8×10)接种于6孔板,待 细胞密度达到50-70%时,按照标准磷酸钙沉淀法进行转染;或者将消化完全5的BHK细胞或pk15细胞((8×10)接种于6孔板,按照Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 转染试剂说明进行转染。 2,细胞蛋白的收取:细胞转染24h-36h后,弃取培养液,并用预冷PBS洗涤两 次。每孔加入200,...

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免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 protocol 免疫共沉淀实验(Coimmunoprecipitation) 51,细胞接种和质粒转染:将消化完全的293T细胞(8×10)接种于6孔板,待 细胞密度达到50-70%时,按照 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 磷酸钙沉淀法进行转染;或者将消化完全5的BHK细胞或pk15细胞((8×10)接种于6孔板,按照Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 转染试剂说明进行转染。 2,细胞蛋白的收取:细胞转染24h-36h后,弃取培养液,并用预冷PBS洗涤两 次。每孔加入200,l蛋白裂解液(50mM Tris.Hcl,PH 8.0;150mM Nacl; 5mM EDTA,1% NP-40; 10% Glycerol, 配制成蛋白裂解基础液。使用前,加入100 ×proteinase inhibitor cocktail 和10mM DTT)。冰上孵育10min,涡旋 1min,重复三次。4?,12000rpm,离心20min,收集上清,即为收取蛋白液。 TM 3,杂蛋白的去除:向收取蛋白液中加入20,l Gamma BindG Sepharose Beads , 于 4?旋转摇床作用1h左右,以去除同Beads 非特异性结合的蛋白质。 4,4?,3000rpm,离心3min,取上清。BCA法测定蛋白浓度,并取500,g,调 整到500 ,l。加入到预先混匀的15 ,lBeads 和2,g 抗体中。颠倒混匀,4? 旋转摇床最慢速度作用,2h至过夜。 ?,3000rpm,离心3min,去除上清,并使用Lysis Buffer 基础液洗涤三5,4 ,l 2X Loading Buffer, 煮沸5-10min。4?,3000rpm,离次。最后加入20 心3min,取上清。 6,选用合适浓度的分离胶电泳。转印后进行Western blot检测。 激光共聚焦实验(Confocal assay) 1,将玻片(Fisher brand,cover slips)预先在培养基中浸润,轻轻放入培养板孔5内。接种293T细胞(1×10)于24孔板,待细胞密度达到50-70%时,按照 标准磷酸钙沉淀法进行转染。 2,转染20-24h后,去除培养液。用预冷的PBS洗涤三次。 3,细胞固定:每孔加入500,l固定剂(即1% 多聚甲醛,储存液为4%,临用前 用PBS稀释),室温下孵育15min。PBS洗涤三次。 4,细胞透化:每孔加入500,l 透化剂(即0.2%Triton X100,PBS配制)。冰上 孵育15min。PBS洗涤三次。 5,A: 如果使用pEGFP-N1/C1, 或者pDsRed-N1/C1 重组质粒进行转染,直接转 入下一步。 B:间接免疫荧光实验:室温下1%BSA封闭30min-1h;室温下孵育一抗1h; PBS洗涤三次;室温下避光孵育二抗(FITC)35-40min;PBS洗涤三次;室 温下避光孵育第二个二抗(TexasRed,或罗丹明标记)35-40min;PBS洗涤 三次。 6,DAPI 染核:将200,l DAPI加入试验孔中,避光孵育3-5min。PBS洗涤三次。 7,玻片的封闭:滴一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上,轻轻取出玻片,正面(细胞 面)向下轻轻加到载玻片上。滴一滴中性树胶于玻片上,轻轻加上盖玻片。 8,制备好的玻片,于4?避光保存,或直接在共聚焦显微镜下观察。 荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter assay) 51,将消化好的293T细胞(1×10)接种于24孔板,待细胞密度达到50-70%时,按照标准磷酸钙沉淀法进行转染。 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达质粒及对照质粒为0.5,g/孔;荧光素酶报告基因质粒为100ng/孔;海肾酶对照质粒为10ng/孔。每组设三个重复。 2,转染后12h,24h,48h,按照双重特异性报告基因试剂盒(Promega产品)说明检测荧光素酶活性。以海肾酶荧光素酶活性为基础,计算报告基因的萤火虫荧光素酶相对活性。 3,对不同刺激下报告基因的变化:在转染后18h,加入相应的刺激物:Poly( I:C)(25,g/ml);TNFα(20ng/ml),或者LPS(25ng/ml)。分别在刺激后0h,6h,12h,24h,收取细胞,按照按照双重特异性报告基因试剂盒(Promega产品)说明检测荧光素酶活性。以海肾酶荧光素酶活性为基础,计算报告基因的萤火虫荧光素酶相对活性。
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