动脉壁细胞氧化修饰极低密度脂蛋白

动脉壁细胞氧化修饰极低密度脂蛋白 动脉壁细胞氧化修饰极低密度脂蛋白 sTJ--~76 第29卷第4期 1997年7月 生物化学与生物物理 ACTABl()cHIM1CAetglOPHYSICASINICA 侈, Vo【l29,No.4 july.1997 动脉壁细胞氧化修饰极低密度脂蛋白 曹圣室v芏淳本袁敏./岁动———一,_———一L一'一 (同济医科大学生化教研室,武汉430030)一 /1摘要;' '将正常极低密度脂蛋白(n—VLDE)分别与动脉壁的三种主要细胞;巨噬细胞(M),内皮细 胞(EC),平精肌细胞(SMC)温育24小时后,VLDL的TBARS值明显增高,琼脂塘电罚:速度加 快,溶血卵磷脂(LysoPC)与卵磷脂(Pc)的比值明显升高,载脂蛋白B?(apoB?)发生降解, 未见集中的降解医带,apoE的相对含量在各组无明显变化,加^抗氧化剂2,6叔丁基甲苯 (butylatedhyaroxytoluene,BHT)能抑{5|上述变化这些结果表明:动脉壁的三种主要细胞在体 外均能氧化修饰VLDL,在体内条件下可能存在这一过程 关建词平精肌细胞;内皮细胞;巨噬细胞 现在有大量实验表明氧化修饰的低密 ;正常堡童塞塑曼 度脂白(.x—LDL)有各种不同的作用促进动 脉粥样硬化(As)的形成].动脉壁的三种主要细胞:SMC,EC,M均能氧化修饰LDL, 在人和兔的血液中及As斑块中均能证实ox—LDL的存在?],为研究LDL在泡沫细胞的 形成及As发生中的作用取得了重大突破,我们以往的工作发现VLDL也能导致M内 脂质堆积],而且在体外经Cu修饰的ox—VLDL促进M内脂质堆积作用较i3.一VLDL 更强,通过结合竞争试验发现oxVIDL进人M主要通过i3.VLDL受体,小部分可以 通过清道夫受体..这些体外试验结果在As发病中是否具有重要性的关键是体内能否 对VLDL进行氧化修饰.为此,本文观察了动脉壁EC,SMC,Me与VLDL在一定条件下 温育后的变化,并初步探讨这种变化的可能机制,进一步了解OK—VLDL在As形成中的 意义. 材料与方法 1.1材料 苯硼酸(BBA),苯甲基磺酰氯(PMSF),四甲氧基丙烷(TMP),硫代巴比妥酸 (TBA),还原型谷胱甘肽(GSH)均购自Sigma公司.DMEM,M一199,胎牛血清均购自 GIBCo公司.其它试剂均为国产分析纯试剂. 啦稿日期:l9960708?接受日期:l9961119. *本文由八五国家医学科技攻美课题费胁(85—915—0304). 搿 氧 372生物化学与生物物理第29卷 1.2方法 1.2.1兔主动脉平滑肌细胞培养6周龄日本大耳白兔,体重0.75,L0kg,按王 国平等法[略加改良.无菌取出主动脉中膜,并切成1rilE.的组织块,接种于培养瓶中, 加入约5ml含10胎牛血清M199培养基,于37.C,5CO条件下,培养1,2小时 后,添加含10胎牛血清的M199培养基,静置温育3天,细胞贴壁后更换培养基,至 完全融合出现"峰谷"现象后,用0.25胰蛋白酶液分散传代实验用3,5代,融合选70 , 80%之细胞 1.2.2牛主动脉内皮细胞的培养参照Sprague口方法无菌条件下取出新生小牛胸 主动脉,剪除动脉外结缔组织,将其肋问动脉结扎,用含0.25胰蛋白酶的D—Hanks消 化液,注入动脉内,结扎两端,置于平皿中,于37?消化15,18分钟,将消化液收集离 心,弃上清,用含小牛血清,谷氨酰胺和青,链霉素的M199培养液洗涤细胞,制成细胞 悬液,接种于培养瓶中,置37.C培养箱培养,细胞生长融合后,加0.08胰蛋白酶和 EDTA的D—Hanks液于培养瓶,收集细胞后分种于培养瓶中,实验用2,3代细胞. 1.2.3小鼠腹腔巨噬细胞的培养收集昆明种雌性小白鼠(20,25g)腹腔M,按本 室方法培养24小时后用于实验. 1.2.4脂蛋白分离取新鲜正常人空腹血浆按王淳本法用密度梯度超速离心分离 VLDL及IDL,经琼脂糖电泳为单一区带.加青霉素,链霉素贮于清洁棕色瓶中,充氮, 4.C避光保存. 1.2.5腊蛋白的细胞氧化修饰用无血清培养基洗涤细胞三次,加入含VIDL的无 血清培养基(200gVLDL—protein/ml,200gmol/L苯硼酸),培养24小时后,取出各皿 瓶培养基透析,按TBARS荧光法测定脂质过氧化物含量,然后同组培养基合并浓缩, 测定琼脂糖电泳迁移率和进一步检测以VLDL在无细胞而在相同条件下温育作 为对 照,部分培养皿瓶加入BHT,观察是否能抑制氧化修饰. 1.2.6栽脂蛋白的SDS-PAGE电泳用Lowry法测定脂蛋白和细胞蛋白质含量, 各组以相同上样量经Maguire等的SDS—PAGE法分离载脂蛋白后,用色谱扫描仪测定 apoB,E的相对含量. 1.2.7脂蛋白的磷脂薄层层析将温育后浓缩的VLDL用Bligh法抽提脂质后,按 Vitiallo等法作磷脂薄层层析,用薄层扫描仪测定LysoPC及PC的相对含量. 结果 2.1氧化脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 各组脂蛋白透析后,浓缩约3,5倍,作琼脂糖凝胶电泳(图1).细胞作用24小时 后.VLDL电泳速度明显较无细胞对照组和加BHT组快,在M组为2.2倍,SMC组为 L2倍,EC组为1.4倍. 2.2温育后VLDL的TBARS值变化 由图2可见,经细胞作用的VLDLTBARS值均较无细胞对照组高,而加BHT可以 抑制氧化修饰. I 第4期动脉壁细胞氧化修饰扳低密度脂蛋白373 糖 _——_''?'! VLDL+ECVLD【+~C'BHTVLDL 墨曼 VLDL+M~+BHTVLDL ??—??—? VLDL+M~ VLDL+SMCvLD{8MC~BHT. VLDL Fig.1MigrationofVLDLsonagarosegel alterlncubation 2.3温育后VLDL的载脂蛋白电泳结果 MSMCEC ?VLDL4CELL?nWLDL口VLD也L+BHT Fig.2EffectofcellsONtheTBARSlevelsof VLDL.Datashown8re!sofatleasttWOexperi— meritswithtriplicatevaluesperexperiment(P< 0.01) 由图3可见,与细胞温育后的VLDL的apoB?降解明显,未见明显集中的降解区 带;而经扫描后由表1可见apoE/C比值无明显变化. —m?oBID0 —一?oE Fig.3SDS—PAGEofVLDLs a.VLDL;bVLDL+EC+BHT;c.VLDL+ECtd.VLDL}e.VLDL+M+--BHT}f.VI|DLM~e ;g.VLDL:h—VLDL +SMC+BHT{iVLDL-_SMC 2.4温育后VLDLLysoPC/PC值的变化 浓缩后的各组脂蛋白,经脂质抽提后,作磷脂的薄层层析分离,结果如下(图4和表 2). ? _Il? ]?』 ? I r_. ? I d2Ol6?2O 一量呈_邑妇,m l 374生物化学与生物物理第29卷 Table1RatioofapoE/CofVLDLafter incobationtdataaremeansoftriplicatevalues fromatleasttwoexperiments MSSMCEc VLDL+CEL【_0.311.230.35 n-VL1)【.0350.760.33 VLDL+CEIL+BHT0.401.770.35 *Nosignificantdifferenceamongthegroup fttesc9) bcd Table2RatioofLysoPC/PCofVLDLafter incubation,dataaremeansoftriplicatevalues fromatleasttwoexpeHments MeSMCEC VLDL+CELL4.06l0.22.86 n—VLnLl_181.99l_13 VLDL+CELL+BHTl_31l06l_02 毒 毒 ' 斓l争 l争.m枷 Ly'~-PId0bO fgh Fig.4TCLofphospholipidsfromVLDLs . VLDL;bVIDL+EClc.VLDL—EC+BHT;d.VLDL}eVLDL+MSj..VLDL}gVLDL+ SMClh.VLDL—SMC+BHT. 由图4和表2可见,温育的VLDL中LysoPC/PC比值在三种细胞修饰后明显升高, 以SMC作用最为明显 讨论 VLDL分别与M},SMC,EC共同温育24小时后,其琼脂糖电泳迁移率明显增加, 分别为无细胞对照组的2.2,1.2,1.3倍;VLDLTBARs值明显升高.分别达11.4土 0.7010.6?0.90,7.8土0.75nmol/mgprotein.明显高于无细胞对照组5.3土0.54,7.2 =0.89,5.1?0.64nmol/mgprotein.在ox—LDL,由于脂质降解产物与apoB的赖氨酸 结合,封闭了正电荷,从而使电泳速度加快],VLDL可能发生类似变化;TBARS值升 高是由于脂质过氧化作用的结果,以M+作用最强,可能由于Me的脂加氧酶和产生自 由基的作用较强.BHT能阻断氧化过程,VLDL加BHT后,其TBARS值明显比相应的 有细胞无BHT组低,分别为46土0.38,5.5?0.47,5.2士0.62nmol/mgprotein,因而 细胞修饰VLDL是一个氧化过程.而无细胞对照组的n—VLDL在37.C条件下,由于内 源性抗氧化剂的耗竭,会逐渐发生自氧化,TBARS值亦略升高,OX—VLDL的LysoPC 第4期动脉壁细胞氧化修饰扳低密度脂蛋白375 与PC的比值有较大变化,分别达到4.O6,10.2和2.85,而无细胞对照组分别为1.18, 1.99和1.13,加入BHT组比值更低,OXVLDL的溶血卵磷脂的含量有明显增加.LDL 在氧化过程中,其PC大部转变为LysoPC,磷脂酶Az(PLA)的抑制剂可以阻止LysoPC 和脂质过氧化物的产生口.,ox—LDL的LysoPC的增加是LDL固有的PIAz所催化的, 各组织细胞膜表面亦存在PLA,本文中SMC作用最强,可能与SMC细胞数较多有关, 所以细胞修饰的VLDL中,溶血卵磷脂的变化可能是上述两种因素的综合作用.溶血卵 磷脂对单核细胞具有趋化作用,所以.OX—VLDL较n—VLDL对单核细胞(MC)有更强的 趋化作用.OX—VLDLapoBo.发生较大变化,以M+和SMC作用最为明显,完整的 apoB儿吣消失.但与oxIDL不同,未见明显的降解片段;而无细胞对照组和加BHT组 apoB仍保持一条带.细胞氧化修饰的LDLapoB..降解成2,3个较大的片段,",OX VLDI的apoB虽也发生降解,但未见明显集中的区带,这与LDL,VIDL的结构不同 有关,VLDL含有多种蛋白成分,其构象较LDL复杂,apoBoo多肽链的氧化程度不同, 从而造成apoB..的降解区带很宽而且不能完全分开.ApoB的断裂,一方面是由于新生 的过氧化脂质自由基攻击肽链使apoB降解.另一方面与细胞分泌的各种蛋白酶类 有关,经活性氧氧化损伤的蛋白质较天然蛋白质更易为蛋白酶水解.而apoE,C等的相 对含量在细胞组,无细胞对照组和细胞加BHT组无明显差异,可能与apoE,,C不易受自 由基攻击有关.我们以往的实验表明:ox—VLDL进入M+主要经过n—VLDL受体,小部 分可能经清道夫受体一一,而apoE是n—VLDL受体的配体,这与ox—VLDL的apoE变化 不大是相符的. 综上所述,n—VLDL与M+,EC和SMC温育24小时后,其TBARS值明显增高,琼 脂糖电泳速度加快,表明VLDL已被氧化修饰,同时apoBoo发生降解,apoE的相对含 量在各组无明显变化,而且在氧化过程中,卵磷脂大部分转变为溶血卵磷脂.加入脂质抗 氧化剂BHT,脂质的过氧化反应受到抑制,整个氧化修饰过程也受到了抑制. 我们过去的工作表明,OX—VLDL促进Me内脂质堆积转变为泡沫细胞的作用比n— VLDL强和在单核细胞(MC)与EC粘附中起一定作用'.,而这正是As早期病变形 成的两个重要环节,本文证实VLDL在体外能被动脉壁的三种主要细胞所氧化修饰,提 示在体内可能存在VLDL的氧化修饰,而使VLDL能加速As的形成,这对血脂升高以 VLDL为主的中国人As发病有重要意义. 参考文献 1]SteinbergDa1.ModificationsoflowdensitylipoprotMnthatincr~seitsatherogeneeitytN E,Med, 1989,320:915 [2]PalinskiWel口f.Lowdensity]ipoproteinundergoesoxidativemodifkationinvlvotP?"AcadSciUSA, l989,86:1372. 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OxidativeModificationofVeryLowDensity LipoproteinbyArterialWallCells CAOSheng.FENGZong—Chen.WANGCun—BenandYUANMing (DepammentofBiochemist*y?TongjiMedica2University,mk430030,China) ABSTRACT ModificationofVLDLbyarteria1wallcellswasobserved.AfterincubatingVLDL (200vgprotein/m1)withbovineaorticendothelialcells(EC),rabbitaorticsmooth musclecells(SMC)ormouseperitonealmacrophages(M)for24hours,theTBARSin VLDLincreasedstrikinglyto7.80~0.75,10.6士0.90and11.4士0.70nmol/mg—pro— teinrespectively,muchhigherthanthoseoftheircontrols(5.10士0.6O,7.20?0.89,5.' 30~0.54nmol/mg—protein).Thecell—modifiedVLDLmigratedfasterthanthecontrols onagaroseelectrophoregramandtheSDS—PAGEoftheapolipoproteinsshowedthatapo. Bl?ofVLDLwasdegradedtofragmentswithoutdistinctbands,whileapoEwasessen— tiallykeptintact.Phosphatidylcholinewashydrolyzedtolysophosphat1dylchoI1neduring themodificationprocess.ThesechangeswereinhibitedbyBHT,indicatingthatthemod— ificationofVLDLwasanoxidativeprocess.TheresultsuggeststhatsinceVLDLcould beoxidativelymodifiedbyarterialwallcellsincludingEC,SMC,MSinvitro,suggesting— theoxidativemodificationofVLDLmayOccurinvivoandplayanimportantrolein atherogenesis. KEYWORDS:Smoothmusclecell;Endothelialcell;Macrophage;Normalvery lowdensitylipoprotein;Oxidativelymodifiedverylowdensitylipoprotein 柏一0一一川…