紫外线对老化钛表面理化性能及生物活性的再激活作用

紫外线对老化钛 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面理化性能及生物活性的再激活作用 卢海宾1，万  蕾2，张雪洋1，容明灯1，周  磊2 (1南方医科大学口腔医院(广东省口腔医院)牙周种植科，广东省广州市 510280；2南方医科大学口腔医院(广东省口腔医院)，广东省广州市 510280) 引用本文：卢海宾，万蕾，张雪洋，容明灯，周磊. 紫外线对老化钛表面理化性能及生物活性的再激活作用[J].中国组织工程研究，2017，21(22): 3519-3524. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.013    ORCID: 0000-0001-6576-7059(卢海宾) 文章快速阅读： 卢海宾，男，1985年生，广东省阳春市人，博士，主治医师，主要从事口腔种植体表面处理及骨代用品的研究，以及牙列缺失的种植修复研究。 通讯作者：卢海宾，南方医科大学口腔医院(广东省口腔医院)牙周种植科，广东省广州市 510280 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2017)22-03519-06 稿件接受：2017-06-21 Lu Hai-bin, M.D., Attending physician, Department of Periodontics and Implantology, Stomatological Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China Corresponding author: Lu Hai-bin, Department of Periodontics and Implantology, Stomatological Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China 文 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 释义：生物活性：是指生物材料与活体骨产生化学键合的能力，是衡量生物材料的一个重要指标。具有生物活性的钛表面，能够在生理环境诱导下，表面形成羟基磷灰石层，与骨组织实现直接的化学键结合，显著加强钛-骨的结合能力，并且能够加速骨愈合的速度。防止钛片老化的手段：第一种是通过改变钛种植体的储存方式，如可采用液体保存的方式来避免碳氢化合物的影响，并且还可以在液体中添加不同的离子成分，如钙、磷等，使之有利保存钛表面的生物活性，这已得到了相关学者的研究证实；第二种方法是通过技术手段，清除老化钛表面的污染物，并且增加其表面自由能，对其表面理化性能及生物活性进行再激活，恢复其原有的表面性能。摘要背景：随着储存时间的延长，钛种植体会出现老化现象，表面理化性能及生物活性会出现不同程度的下降，影响最终的种植体-骨结合效能，如何迅速有效的恢复钛表面的理化性能及生物活性值得深入研究。目的：探讨紫外线对老化钛表面理化性能及生物活性的再激活作用。方法：将经过喷砂酸蚀处理的钛片随机分为3组，A组为喷砂酸蚀处理后的新鲜钛片，B组为常温常压保存4周，C组为常温常压保存4周后紫外线照射15 min，采用表面轮廓测量仪、X射线光电子能谱分析仪、水接触角分析仪检测钛表面的粗糙度、元素构成及表面能。将MG63成骨细胞分别接种于3组钛片表面，接种30 min、1 h、2 h、4 h，以Hoechst33342荧光染色检测细胞黏附能力；接种1，3 d，采用MTS法检测细胞增殖。结果与结论：①3组钛表面的表面粗糙度无明显差异；②A、C组钛片表面C元素含量低于B组(P < 0.05)，Ti、O、N元素含量显著高于B组(P < 0.05)，A、C组钛片表面各种元素构成无明显差异；③A、C组钛片表面静态水接触角均为0°，B组钛片表面静态水接触角为115°；④接种30 min、1 h、2 h、4 h，A、C组钛片表面的细胞黏附数量高于B组(P < 0.05)，A、C组钛片表面的细胞黏附数量无明显差异；⑤接种1，      3 d，A、C组钛片表面的细胞增殖能力高于B组(P < 0.05)，A、C组钛片表面的细胞增殖能力无明显差异；⑥结果表明，紫外线可激活老化钛表面的理化性能及生物活性，显著减少碳氢化合物的污染，恢复钛表面的高表面能，有利于细胞的黏附和增殖。 关键词：生物材料；材料相容性；钛表面；碳氢化合物；紫外线；理化性能；再激活；国家自然科学基金主题词：牙种植体；钛；紫外线；组织工程基金资助：国家自然科学基金(81600900)；广东省自然科学基金(2014A030310146) Effect of ultraviolet rays on the re-activation of the physicochemical properties and bioactivity of aging titanium surface Lu Hai-bin1, Wan Lei2, Zhang Xue-yang1, Rong Ming-deng1, Zhou Lei2 (1Department of Periodontics and Implantology, Stomatological Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; 2Stomatological Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China)Abstract BACKGROUND: The physicochemical properties and bioactivity of titanium surface will degrade with time because of the aging phenomenon, affecting the efficiency of implant-bone osseointegration. Therefore, the re-activation of the implant surface physicochencical properties and bioactivity is important. OBJECTIVE: To investigate the re-activation effect of ultraviolet rays on aging titanium surface. METHODS: Sand-blasted and acid-etched titanium discs were divided into three groups randomly: Group A was new titanium surface, Group B was stored in a sealed container for 4 weeks, Group C was treated with ultraviolet rays for 15 minutes after stored in the sealed container for 4 weeks. The surface roughness, elemental composition and surface energy of the titanium surface were examined by optical profilometer, X-ray photoelectron spectroscopy and contact angle measuring device, respectively. The bioactivity of the titanium surface was examined by cell culture experiments. MG63 osteoblast-like cells were cultured on the different titanium surfaces. After 30 minutes, 1, 2, 4 hours of incubation, the cells were strained with Hoechst33342 fluorescence, and initial attachment of cells was evaluated by measuring the amount of cells attached to the titanium surface. The proliferation of cells was quantified in terms of cell density at 1 and 3 culture days using tetrazolium salt (MTS)-based colorimetry. RESULTS AND CONCLUSION: There was no obvious difference in the surface roughness of the three groups, and ultraviolet treatment did not change the surface morphology of titanium surface. X-ray photoelectron spectroscopy showed that the C element content of group A and group C was lower than that of group B (P < 0.05), and the content of Ti, O, N elements was significantly higher than that of group B (P < 0.05). No difference in the surface element composition between group A and group C was found. Both of the surface contact angles of group A and group C were 0o, but in group B, the value was 115°. The number of initially attached cells of group A and group C was significantly higher than that of group B after incubated 30 minutes, 1, 2 and 4 hours (P < 0.05), and no difference between group A and group C was found. The proliferation of cells of group A and group C was significantly higher than that of group B after incubated 1 and 3 days (P < 0.05), but no difference between group A and group C was found. In conclusion, ultraviolet rays show good effects on the re-activation of the aging titanium surface, which can reduce hydrocarbon contamination and recover the high surface energy to increase cell adhesion and proliferation. Subject Headings: Dental Implants; Titanium; Ultraviolet Rays; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81600900; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030310146 Cite this article: Lu HB, Wan L, Zhang XY, Rong MD, Zhou L. Effect of ultraviolet rays on the re-activation of the physicochemical properties and bioactivity of aging titanium surface. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(22): 3519-3524. 0  引言  Introduction 20世纪60年代，由于钛-骨结合现象的发现，纯钛及钛合金开始被应用于人工牙根的制作，从而开始现代口腔种植的新纪元。至今，人工种植牙应用于临床已半个世纪，并且取得了可靠的临床效果。尽管如此，人工种植牙仍然存在着以下问题：从一期手术到最终修复完成仍需要较长时间，通常需要12周以上；骨和种植体的结合率仍然不高，只有(45±16)%，距离理想的100%骨结合率仍有很大距离[1-3]，这并不利于种植体的长期稳定。因此，如何获得更快的骨愈合速度及更好的骨结合率，仍然是需要研究的问题。 钛种植体与骨组织形成骨结合的速度及骨结合率均与其表面性能直接相关[4-5]。钛的化学性能非常活泼，暴露于大气后，极短时间内就已与空气中的氧气发生化学反应，形成不同价态的氧化膜，直至钛的氧化层厚度达到1-  10 nm后，这种反应自然终止[6]。由于钛表面的氧化膜为钝态，通常不能像生物活性材料那样与骨发生化学键性结合。因此，在钛种植体应用于临床前，通常需要进行表面处理，使之形成具有生物活性的表面。生物活性是植入材料能够与生物组织形成键合的特性[7]。具有生物活性的钛表面，能够在生理环境诱导下，表面形成羟基磷灰石层，与骨组织实现直接的化学键结合，显著加强钛-骨的结合能力，并且能够加速骨愈合的速度。 目前，常用的钛种植体表面处理技术均能显著改善其表面性能，提高其生物活性[8-10]。但有研究发现，临床上使用的种植体表面性能较新制备的钛种植体存在着不同程度的差异。一般而言，新制备的钛表面理化性能及生物活性较高，而随着储存时间的延长，钛的表面性能存在不同程度衰退，导致钛种植体与骨的结合能力下降，即出现了钛表面的老化现象[3，11-12]。研究表明，钛种植体受到空气中碳氢化合物的污染，可能是导致其表面性能下降的主要原因。由于临床上主流的种植体包装方式为常温常压下密封保存，虽然能隔绝微生物的污染，但对避免空气中碳氢化合物的污染无能为力，不可避免的出现表面性能的下降。因此，如何简单快捷地重新激活钛表面的理化性能及生物活性具有重要临床意义。 近年来，有研究表明，紫外线能够与钛氧化膜发生光催化作用，对碳氢化合物等有机物具有较强的清除能力，并且能够增加其表面自由能，有利于成骨细胞的黏附和增殖[13-14]。因此，此次研究的目的利用紫外线对老化种植体表面进行处理，以探讨紫外线对其理化性能及生物活性的再激活效果。 1  材料和方法  Materials and methods 1.1  设计  随机对照观察实验。 1.2 时间及地点 实验于2015至2017年在广东省口腔医院完成。 1.3 材料 商用二级纯钛(宝鸡市虹华有色金属有限公司)；SiC防水砂纸(湖北玉带砂带股份集团有限公司)；36%盐酸(分析纯)、98%硫酸(分析纯)(广州市化学试剂厂)；电热恒温水浴锅HSW系列(上海一恒科技有限公司)；超声波清洗机KQ5200(东莞科桥超声设备有限公司)；表面轮廓测量仪(Wyko NT9300，Vecco，美国)；X射线光电子能谱仪(ESCALAB250，Thermo-VG Scientific，美国)；接触角分析仪(OCA15，Dataphysics，德国)；MG63成骨细胞系(ATCC，美国)；胎牛血清、DMEM培养基、PBS(Hyclone，Thermo，美国)；Hoechst33342( Sigma-Aldrich，美国)；CellTiter 96?Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay MTS试剂盒(Promega Corporation，美国)；荧光显微镜、显微镜专业成像系统MP5.0(Olympus，日本)；细菌计数软件Tanon Colon(中国)；图像分析软件Image-Pro Plus6.0、酶标仪BIO-RAD(美国)。 1.4  实验方法  制备钛片：将商用二级纯钛板切割成直径15 mm、厚度1.0 mm的钛片，依次以400，800，1 200目SiC防水砂纸同方向逐级打磨，至表面呈金属光泽，表面划痕一致，然后置于硫酸(体积分数49%)和盐酸(质量分数18% ) 混合酸中，60 ℃水浴加热酸蚀40 min，ddH2O超声清洗      15 min(2次)，干燥后备用。 实验分为3组，具体如下：A组为新制备钛片；B组为常温常压密封保存4周；C组为常温常压密封保存4周后，紫外线照射15 min。 1.5 主要观察指标 表面粗糙度测量：随机抽取3组中的钛片各3片，采用表面轮廓测量仪对表面粗糙度进行分析，测量粗糙度参数Sa、St、Sdr。放大倍数为10倍，测量每次区域为        456 μm×600 μm。 表面元素分析：采用X射线光电子能谱仪在超高真空环境下分析3组实验样品表面的元素构成，光电子由单色化AlKαX光源在150 W辐射产生，电压为15 kV，电流为    10 mA，能量为1 486.6 eV，采用90°出射角，光斑大小为500 μm，获得扫描全谱及主要特征峰(Ti 2p，O 1s，C 1s，Al 2p和N 1s)。各元素结合能以284.8 eV矫正。 表面亲水性检测：随机抽取3组中的钛片各3片，采用OCA15接触角分析仪测量1 μL ddH2O在各组钛片表面的静态水接触角。 钛片表面的细胞培养实验：在3组钛片表面接种MG63成骨细胞进行培养，接种密度为2.4×104/cm2，分别孵育  30 min、1 h、2 h、4 h后终止培养，使用Hoechst33342荧光染色剂对细胞核进行染色，然后在荧光显微镜下采集图像，并通过显微镜专业成像系统进行图像采集，对视野内的细胞数目进行计数(×100倍，随机选择30个视野观察)，然后进行统计分析，检测细胞的黏附能力。在细胞接种于钛片表面的第1，3天，使用MTS反应剂，通过酶标仪测量检测细胞A值来检测各组钛片表面上MG63成骨细胞的增殖水平。 1.6  统计学分析  采用SPSS 15.0统计软件对各组间样品的表面理化性能、细胞黏附和细胞增殖方面各项参数进行统计学分析，检验水准α=0.05，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。 2  结果  Results 2.1  各组钛片表面粗糙度检测结果 各组钛片表面粗糙度各项参数(Sa、St、Sdr)比较差异无显著性意义，见表1，由此可见，各组钛片的表面粗糙度处于同一水平，紫外线处理对钛表面的物理形态无明显影响。 2.2  各组钛片表面元素构成 通过X射线光电子能谱对3组钛片表面进行元素分析，结果如表2所示，与A组相比，B组钛片表面的元素构成出现了较明显变化，C元素含量明显增加，Ti和O元素含量显著下降；而经过紫外线处理后的C组，各种元素构成与A组无明显差异。 2.3  各组钛片静态水接触角分析结果  A组新制备的钛表面表现出超亲水特性，静态水接触角为0°；B组钛片储存了4周后，静态水接触角变为115°；经过紫外线照射处理后，C组钛表面又重新获得了超亲水特性，静态水接触角为0°。 2.4  各组钛片表面的细胞黏附能力  MG63成骨细胞在不同处理组钛片表面的黏附情况见图1所示，统计结果见表3所示。在A组钛片表面，30 min细胞黏附率接近50%，4 h细胞黏附率接近80%；在B组钛片表面，30 min细胞黏附率仅为2%，4 h的细胞黏附率低于50%；经过紫外线照射后，C组钛片表面细胞黏附的各项参数与A组无明显差异，显著优于B组。 2.5  各组钛片表面细胞增殖能力  在细胞培养第1天时， B组钛片表面细胞增殖活性显著低于A、C组(P < 0.05)；在细胞培养第3天时，这种现象仍然存在，A组及C组钛片表面细胞增殖始终无差异，见表4。 3  讨论  Discussion 对于纯钛种植体而言，如果其表面仅存在Ti和O两种元 接种30 min 接种1 h 接种2 h 接种4 h A组 B组 C组 图注：A组为喷砂酸蚀处理后的新鲜钛片，B组为常温常压保存4周的钛片，C组为常温常压保存4周后紫外线照射15 min的钛片。MG63成骨细胞在A组、C组钛片表面黏附良好。 图1 MG63成骨细胞在不同处理钛片表面的黏附情况(Hoechst33342荧光染色，×100) Figure 1 Attachment of MG63 cells to different titanium surfaces (Hoechst33342 fluorescence staining, ×100) 表1 各组钛片表面粗糙度参数的比较 (±s，n=3，μm) Table 1 Surface roughness comparison among different titanium surfaces 表注：A组为喷砂酸蚀处理后的新鲜钛片，B组为常温常压保存4周的钛片，C组为常温常压保存4周后紫外线照射15 min的钛片。 表注：A组为喷砂酸蚀处理后的新鲜钛片，B组为常温常压保存4周的钛片，C组为常温常压保存4周后紫外线照射15 min的钛片。与A组比较，aP < 0.05；与B组比较，bP < 0.05。