酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法(ELISPOT)具体步骤:
包被抗体:
1. 按1:200比例稀释，将包被抗体加入到4?储存的1×PBS中，在ELISPOT平板每孔中加入100μl稀释后的包被抗体;
2. 置于4?冰箱封闭过夜(16小时);
封闭:
3. 弃去包被抗体稀释液。每孔加入200μl含10%牛血清的RPMI1640培养基清洗，放置2分钟;
4. 每孔加入200μl的含10%牛血清的RPMI1640培养基，室温放置2小时; 刺激细胞:
5. 弃去每孔中的200μl的含10%牛血清的RPMI 1640培养基; a) 阴性孔:在11列中加入20μl含10%牛血清的RPMI1640培养基; b) 阳性孔:在12列中加入5μl的10μg/ml的PMA和2μl的1mg/ml的Ionomycin; c) 实验孔:实验孔每孔加入8μl的100μg/ml的多肽;
66. 每孔加入180μl的1.5×10/ml待检测细胞悬液;
7. 37? 5%CO孵育24小时; 2
加入检测抗体:
8. 吸弃细胞。每孔中加入200μl去离子水，室温放置5分钟，再次加入200μl去离子水，室温放置5分钟;
9. 每孔用200μl 1×PBST清洗3次，每次室温放置2分钟，弃去PBST;
:250比例稀释，将检测抗体加入到含10%血清的1×PBS中，ELISPOT10. 按1
平板每孔加入100μl稀释后的检测抗体;
11. 室温放置2小时;
酶联:
12. 弃去检测抗体稀释液。每孔用200μl 1×PBST清洗，共3次，每次室温放置2分钟;
13. 按1:100比例稀释，将亲和素-HRP加入到含10%血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100ul酶联稀释液;
14. 室温放置1小时;
显色:
15. 弃去酶联稀释液。每孔用200μl的1×PBST清洗4次，每次放置2分钟; 16. 每孔用200μl的1×PBS清洗2次，每次放置2分钟;
17. 每孔加入AEC显色液100μl，室温避光放置10,30分钟，其间观察是否形成斑点;
18. 斑点形成后，用去离子水冲洗终止酶联反应;
19. 取下垫盘，室温干燥过夜;
20. 使用CTL ELISPOT读数仪，读取
分析
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数据，ELISPOT平板放入自封袋室温保存。
浙公网安备 33021202002483