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——几种常见猪病的酶联免疫吸附试验检测方法
一、猪伪狂犬病毒
1.1试验材料
抗原、酶标抗体、阴性血清、阳性血清;底物邻苯二胺一过氧化氢(OPD-H202)溶液,抗原包被液、封闭液、冲洗液、终止液配制方法见附录C(标准的附录),酶标反应板
1.2操作步骤
1.2.1包被
用包被液(见附录c中C2)将抗原稀释到工作浓度加人酶标板孔内,每孔100uL,37℃作用1h后,放入4 C°冰箱过夜。
1.2.2洗涤
弃去孔内液体,用冲洗液(见附录C中Cl)洗3次,每次3 min,用吸水纸拍干。
1.2.3封闭
各孔加人封闭液(见附录C中C3)100 uL,37 C°作用1h。按1.2. 2步骤洗涤。
1.2.4加人待检血清和阴性、阳性血清对照
待检血清经56 C° 30 min灭活后,用冲洗液作1:40稀释,加入抗原孔中,每孔100uL;同时将阴性血清对照和阳性血清对照各加人三个抗原孔中,分别标记,37 C°作用1 h,重复1.2.2步骤
1.2.5加人酶标抗休
用冲洗液将酶标抗体按工作浓度稀释,每孔加人100 uL,37 C°作用1h。按1.2. 2步骤洗涤。
1.2.6加人底物邻苯二胺一过氧化氢,(见附录C中C4)
每孔100 uL,室温避光显色25 min
1.2.7终止反应
每孔加人50uL一终止液(见附录C中C5)终止反应
1.2. 8测定透光值(OD)值
在酶联免疫检测仪上于490 nm波长处测定光吸收值。
1.2.9结果的判定
阴性对照光吸收值(OD) 3孔的平均值,
阴性对照光吸收值(OD) 3孔的平均值,
血清检测值与阳性对照血清检测值之比(S/P)值计算:
S/P=(样品A490 –NC)/(PC-NC)
如S/P≥0.5,则判为抗体阳性;如S/P﹤0.5,则判为抗体阴性。
附录C:
c1冲洗液
含0.0,5%吐温-2(1("1'ween-20)pH7. 4的磷酸盐缓冲液。
将下列试剂按次序加人1 000 rill,体积的容器中,充分溶解即成。
氮化钠(NaCl) 8.0g
氯化钾(KCI) 0.2g
磷酸氢二钠(NaHPO4·12H2O) 0.2g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.9g
吐温一20(Tween-20) 0.5mL
加蒸馏水至1000mL
C1抗原包被液
0.025 mol/L,PH96碳酸盐缓冲液。
碳酸钠(NaCO3) 1.59g
碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g
蒸馏水 1000mL
C3封闭液
冲洗液 100mL
牛血清白蛋白(BSA) 0.1g
C4底物溶液邻苯二胺一过氧化氢(OPD-H202)
C4.1 0.1 mol/L pH5.0 磷酸盐一柠檬酸盐缓冲液将下列试剂按次序加人1 000 ml体积的容器中,磷酸氢二钠 71.6g
柠檬酸 19.2g
蒸馏水 1000mL
C4.2底物溶液
0.1mol/L pH5.0磷酸盐一柠檬酸盐缓冲液 100mL
邻苯二胺(OPD) 40mg 30%过氧化氢 0.15mL 此液对光敏感,应避免强光直射。现配现用。
C5终止液
2 mol/L,硫酸
硫酸 22.2mL
蒸馏水 177
二、
浙公网安备 33021202002483