下载

1下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 医学免疫学实验技术

医学免疫学实验技术.doc

医学免疫学实验技术

amanda_嘉嘉kq62n
2017-09-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《医学免疫学实验技术doc》,可适用于综合领域

医学免疫学实验技术主编邱玉华副主编居颂光苏州大学年月目录、外周血单个核细胞的分离„„„„„„„„„„„„„„„„„、T淋巴细胞亚群的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„、混合淋巴细胞反应„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、淋巴细胞增殖的检测„„„„„„„„„„„„„„„„„„、免疫荧光标记技术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、小鼠血清中Ig的含量测定„„„„„„„„„„„„„„„„、细胞因子的含量测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„、酶联免疫斑点分析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、人外周单核细胞来源树突状细胞的制备„„„„„„„„„„、小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的制备„„„„„„„„„„„„„、多克隆抗体的制备„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、B淋巴细胞杂交瘤的建株„„„„„„„„„„„„„„„„、细胞周期的分析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、双向免疫扩散技术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、免疫印迹技术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„、荷瘤动物模型的建立„„„„„„„„„„„„„„„„„„附件:免疫学实验常用试剂及配制方法„„„„„„„„„„„„实验外周血单个核细胞的分离(AbstractionofPeripheralbloodMononuclearCell)一、目的要求、掌握外周血单个核细胞分离的原理和实际操作方法。、掌握离心机及显微镜等仪器的使用。二、原理外周血中单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞其体积、形状和比重与其他血细胞不同。红细胞和粒细胞比重较大为左右淋巴细胞和单核细胞的比重为,之间血小板比重为,。利用一种比重为左右、接近等渗的分离液作密度梯度离心可使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布从而将各种血细胞加以分离。稀释的血浆及血小板rpm,minPBMCFicollFicoll红细胞及粒细胞三、材料、肝素抗凝的人外周血。、淋巴细胞分离液(Ficoll)。、Hanks液。、倒置显微镜。、离心机。吸管、吸球、移液枪、吸头、血球计数板及盖玻片等。、华氏管、四、方法、无菌抽取肝素抗凝外周血ml放入离心管中用Hanks液稀释血液,倍并用吸管反复抽吸将其混匀避免产生气泡。、吸取mlFicoll加入华氏管中。、用吸管吸取ml左右稀释血液在离分离液(Ficoll)液面上cm处沿倾斜的试管壁缓缓加入使稀释血液,、淋巴细胞增殖的检测常用方法还有哪些,各自的优缺点如何,、为什么要设复孔和空白对照,、为保证结果准确还有哪些注意事项,(葛彦)实验五免疫荧光技术(ImmunofluorescenceTechnique)一、目的要求、掌握免疫荧光技术的基本原理。、了解免疫荧光分析的实验方法。二、原理免疫荧光技术(Immunoflμorescencetechnique)是将抗体(或抗原)经荧光素标记然后再与相应的抗原(或抗体)结合在蓝紫色光的照射下放出可见光(称为荧光)借助荧光显微镜或流式细胞仪可对待测抗体或抗原进行定性和定量分析。目前使用的荧光素多为异硫氢酸荧光黄(FITC)四乙基罗达明(RB)藻红蛋白(RPE)和TexasRed等。因为它们激发光波长和发射光波长多不相同因而可以利用这些荧光对细胞的一种或多种蛋白进行示踪。免疫荧光技术主要适用标本有:建株细胞、新鲜分离细胞、组织切片、印片等多种来源和性质的标本。免疫荧光分析有直接免疫荧光和间接免疫荧光两种分析方法。三、材料、人CD基因转染细胞株(CDT)。、鼠抗人CD单抗。、FITG标记的羊抗鼠IgG。、FITG标记的鼠抗人CD单抗。、pHmolLPBS等。、Eppendorf管及吸管等。四、方法(一)间接免疫荧光标记、取生长良好的待测细胞CDT用PBS或Hanks液洗涤(rpmmin离心min弃上清)。、用PBS或Hanks液悬浮细胞计数调整细胞浓度到×ml。、取μl细胞悬液加于Eppendorf管中再加,μl(含抗体μg)小鼠抗人CD单抗震荡使之充分混匀同时设置阴性或及无关单抗对照、置min。、用PBS洗涤次。、加入已稀释好的FITC标记羊抗鼠IgGμl混匀。、min。、洗涤次后分析。CD分子鼠抗人CD单抗FITC标记的羊抗鼠IgG细胞膜荧光间接免疫荧光标记CD分子FITC标记的鼠抗人CD单抗细胞膜荧光直接免疫荧光标记(二)直接免疫荧光标操作同上在待测细胞中直接加入荧光素标记的CD单抗即可。结果分析(一)荧光镜检:沉淀细胞中加入μlPBS重悬细胞吸取细胞悬液μl于洁净玻片上轻轻盖上盖玻片置于荧光显微镜载物台上用高倍镜观察细胞膜染色结果细胞膜被染上黄绿荧光者判为阳性细胞。计数个细胞并计算阳性细胞百分率。阳性细胞百分率=(阳性细胞数总计数细胞)×(二)流式细胞仪分析:将待检细胞转移至流式测定管中每管加入μl测定液后上机分析。六、注意事项、抗体应该避光保存加入荧光抗体后反应过程亦应低温避光。、待测样品必须是单细胞悬液不可有团块或细胞粘连否则会影响判读结果或使流式细胞仪喷嘴堵塞可用,μm规格的尼龙网过滤。若要检测细胞核或细胞浆中的蛋白则需先用Triton预处理细胞使细胞通透性增加。、非特异性荧光及消除方法非特异性荧光产生原因包括()自然荧光如胶原纤维、脂褐素等新鲜组织或外周血细胞自发荧光较弱。()标本的非特异吸附如结缔组织抗体不纯Fc段所致非特异染色标本荧光抗体质量差细胞本身具有较强的吞噬作用如巨噬细胞树突状细胞等。消除方法()反应保证在低温()环境中进行严格控制加入荧光抗体后的反应时间每次洗涤细胞必须充分待测细胞可先用小牛血清(FCS)或牛血清蛋白(BSA)封闭处理进一步降低其非特异性染色。()对于结缔组织干扰的组织或细胞可先用胰酶消化或加入肝粉吸收处理当免疫荧光技术应用于组织学细胞时对组织切片(印片)的处理方法不同反应步骤亦有差别详请参阅有关免疫组化方面资料。七、思考题、直接免疫荧光标记和间接免疫荧光标记的优缺点,、如何减少免疫荧光检测中细胞非特异性荧光染色,(邱玉华)实验六小鼠血清中IgG的含量测定(DeterminationforMouseSeralIgG)一、目的要求、掌握间接ELISA法的原理。、掌握酶标仪的使用方法及结果分析。二、原理酶免疫测定noassayEIA)或免疫酶技术(immunoenzymatic(Enzymeimmutechnique)是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行抗原抗体反应从而将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来根据酶作用底物后显色以颜色变化判断实验结果可经酶标测定仪作定量分析灵敏度可达微微克(pg)水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidaseHRP)和碱性磷酸酶(AlkalinephosphataseAP)它们与抗体结合不影响抗体活性这些酶具有一定的稳定性制成酶标抗体可保存较长时间。酶联免疫吸附实验(EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA)简称酶标法是根据酶免疫测定原理发展的一种技术。常用的有间接ELISA即双抗夹心ELISA等。间接ELISA鼠IgG羊抗鼠IgG抗原鼠IgG羊抗鼠IgG酶底物显色双抗夹心ELISA三、材料、小鼠IgG抗小鼠IgG。、抗小鼠IgGFcHRP(辣根过氧化物酶)。、包被液(pH、MTrisHCL)。、pH、MPBS。、抗体稀释液(含小牛血清的PBS)。、封闭液(含小牛血清的PBS)。小牛血清和吐温的PBS)。、洗涤液(含、邻苯二胺(OPD)溶液(mgml)。、N硫酸液。、酶标测定仪及酶标测定板。、吸管、吸球及吸水纸等。四、方法、用包被液将抗小鼠IgG稀释至μgml将其加入孔酶标板每孔μl冰箱中过夜。、弃去包被液用洗涤液洗两遍。每次每孔加μl洗涤液。、加入封闭液每孔μl温箱中放置小时或过夜。、弃去封闭液用洗涤液洗两遍每次每孔加入μl。、加入用稀释液稀释的待测标本每孔μl个复孔。同时设置标准曲线组及阴性对照组。反应小时。、弃去液体用洗涤液(每次每孔μl)洗涤两遍(rpm×min)。、加入抗小鼠IgGFcHRP工作液(根据说明书用稀释液将酶标二抗母液稀释至工作液)每孔μl反应小时。、弃去未结合的二抗用洗涤液洗三遍。、加入用柠檬酸缓冲液配制的邻苯二胺(OPD)底物每孔μl温箱中放置分钟进行底物显色。、加入N硫酸液每孔μl终止酶与底物的反应。、在酶标仪上读取nm波长处的OD值从标准曲线换算出待测物的含量。五、注意事项、实验须设置阴性或及无关对照孔。、待测样本须设置个复孔。、终止液加入孔中的顺序应与底物加入孔中的顺序一致以减少人为误差。、酶联免疫检测易出现非特异性阳性反应每次洗涤均要次以上。六、思考题、阴性或及无关对照组的意义如何,、在酶联免疫分析中要获取准确的检测结果应注意哪些事项,(朱华亭)实验七细胞因子的检测(DeterminationofCytokine)一、目的要求、熟悉双抗夹心ELISA测定细胞因子含量的原理。、了解ELISA的测定过程及结果分析。二、原理细胞因子(Cytokines,CK)是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。它们参与细胞之间信息传递调节细胞的生物学功能参与机体的免疫调节也是参与发热、炎症、休克等一系列病理过程的重要介质。根据它们的功能细胞因子可分为白细胞介素(Interleukin,IL)、干扰素(Interferon,IFN)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)、肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)、生长因子(Growthfactor,GF)、趋化因子(Chemokine)等。检测细胞因子的数量和生物学功能是从免疫学角度评估细胞因子生物学作用的重要的两个方面。本实验以检测人IFNγ为例介绍利用双抗夹心酶联免疫吸附法(EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA)测定细胞因子含量。其原理是)将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。)加受检标本保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。)加酶标抗体保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色测知标本中抗原的量。三、材料、包被缓冲液(PHM碳酸盐缓冲液)、洗涤缓冲液(PHPBS含Tween)、稀释液:FCSPBS、终止液(MHSO):,,、底物缓冲液(PH):MNaHPO(克,L)mlM柠檬酸(,,克,L)ml加蒸馏水ml。、TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(mg,ml无水乙醇)ml底物缓冲液(PH)ml,HOμl,,、ABTS使用液:ABTSmg底物缓冲液(PH)ml,HOμl,,、抗原、抗体和酶标记抗体。、正常人血清和阳性对照血清、商品化IFNγ、孔聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)ELISA检测仪μl及μl加样器吸水纸洗涤瓶。、小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。、冰箱孵育箱。四、方法、包被:用MPH碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至含量为,μg,ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加μl过夜。次日弃去孔内溶(简称洗涤下同)。液用洗涤缓冲液洗次。、加样:加一定稀释的待检样品μl于上述已包被之反应孔中置孵育小时。然后洗涤。(同时做空白孔阴性对照孔及阳性对照孔)。、加酶标抗体:于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)μl。孵育,小时洗涤。、加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液μl,分钟。、终止反应:于各反应孔中加入M硫酸μl。、结果判定:可于白色背景上直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深阳性程度越强阴性反应为无色或极浅依据所呈颜色的深浅以“”、“”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上根据仪器使用说明测定OD值和IFNγ含量。ELISA原理图五、注意事项、试剂盒置,保存。使用前试剂应摇匀并弃去,滴后垂直滴加。、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条置室温平衡分钟后再行测试余者应及时封存于冰箱中以备后用。、待测标本不可用NaN防腐。、结果判断须在较短时间内(一般分钟)完成。、酶反应的底物溶液必须在临用时新鲜配制。六、思考题、测定血清或细胞培养上清中细胞因子含量的方法有哪些,、实验过程中那些因素会影响实验结果的准确性,(居颂光)实验八酶联免疫斑点分析(enzymelinkedimmunospotassayELISPOT)一、目的要求、熟悉ELISPOT的工作原理和操作步骤、熟悉ELISPOT的适用范围二、原理ELISPOT是从单细胞水平检测分泌细胞因子细胞的一项免疫学检测技术是当世公认最灵敏的抗原特定T细胞体外检测技术。ELISPOT的原理与ELISA类似通过将特异性的单抗包被在特殊材质(如PVDF)的ELISPOT板上使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘获细胞分解后被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合通过显色反应在细胞分泌细胞因子的相应位置上显现清晰可辨的斑点可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数个斑点代表个细胞从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。该方法特异性好和灵敏度高易操作且成本较低已被广泛用于免疫机理和疾病发病机制的研究中。本实验以检测针对黑色素瘤抗原TRP的特异性T细胞分泌IFNγ为例介绍ELISPOT方法。三、材料、超净工作台、COC细胞培养箱、P、P、P微量移液器和P通道微量移液器、ELISPOTReader、PBS、PBST洗液(PBS加入Tween)、乙醇、包被抗体(coatingantibodyPrimaryantibody)、检测抗体(BiotinylateddetectorantibodySecondaryantibody)、酶联亲和素(StreptavidinALKconjugate)、碱性磷酸酯酶(ALK)的底物BCIPNBT、PHA刺激物(mgmlC贮存):使用时用RPMI培养基稀释成为工作液(μgml倍终浓度)每孔加入μl终浓度μgml。、TRP(~)合成抗原以DMSO按mgml溶解C贮存。、小鼠黑色素瘤细胞株BB小鼠。四、方法、用μl酒精孵育PVDF孔板室温下孵育分钟。、倒去酒精用μLPBS洗涤次。、将抗鼠IFNγ单克隆抗体用PBS按μgml稀释作为捕获抗体μl孔过夜。、弃包被液μLPBS洗板次加含BSA的PBSμL孔加盖ºC孵育h弃上清液将板置于密封袋中ºC可保存数周。、弃包被液洗涤一次。、每孔加入μl胎牛血清(FCS)的培养基封闭室温下孵育h。、弃封闭液用μlPBS洗涤一次。、取经小鼠黑色素瘤细胞B多次免疫的B小鼠脾脏和淋巴结细胞分离纯化CDT细胞、用FCS的RPMI重悬经纯化的CDT细胞×mL~×mL每孔加入μl细胞悬液每组中加入不同浓度(如:,:,:)的TRP抗原刺激(阴性对照组为不加刺激剂组阳性对照组加入PHA刺激)。细胞可预先在体外接受刺激(间接ELISPOT)。盖上标准的孔板塑料板盖CO孵育箱中孵育一定的时间(h~h)。、在水槽边和吸水纸上轻打倒去液体。、每孔加μl洗涤缓冲液孵育分钟。用μl洗涤缓冲液洗孔次。、、用BSAPBS中稀释μl检测抗体。每孔加μl此液体盖上板盖下孵育h。、倒去液体用μL洗涤缓冲液洗次。、每板以mlBSAPBS稀释μl的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入μl此液体盖上板盖孵育小时。、弃液体用μl洗涤缓冲液洗次。在吸水纸上拍打吸干残留的洗涤液。、每孔加入μl碱性磷酸酯酶的底物BCIPNBT。、室温下反应~分钟。完全显色后将此液倒于相应的盘中。、用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍使膜干燥。保存时将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后读取点数。Elispot方法的原理如下图所示:五、注意事项、细胞孵育期间不要晃动或移动孔板以免产生斑点拖尾现象。、下放置一夜点会比较明显。六、思考题、比较ELISPOT与ELISA、细胞内染色、四聚体法(Tetramer)和与Cr释放法等检测方法的优缺点和适用范围。(居颂光)实验九人外周单核细胞来源树突状细胞的制备(PreparationofDCfromHumanPeripheralMononuclearCell)一、目的要求、掌握从人单核细胞诱导树突状细胞的方法和原理、掌握观察单核细胞和树突状细胞形态和判断鉴别未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞。二、原理树突状细胞(dendriticcell,DC)是一类具有树枝状突起的抗原呈递细胞其分布广泛由骨髓中的髓性多能干细胞发育而成在免疫应答过程中至关重要。DC是目前已知的最重要的一类抗原提呈细胞未成熟DC具有强大的摄取和加工细胞发生增殖反应处理抗原的能力并将抗原信息提呈给Th细胞可激活Th而且还能刺激产生TC细胞。机体内DC含量极少研究中应用的DC多是通过其前体细胞诱导而来。其中外周血单核细胞和CD干细胞是研究和应用中常用的DC前体细胞。本实验介绍一种常用方法利用外周血单核细胞为前体细胞采用细胞因子GMCSF和IL诱导单核细胞分化成树突状细胞而利用TNFα促进树突状细胞成熟。三、材料、淋巴细胞分离液(Ficoll)。、RPMI培养液。、胎牛血清(FCS)。、PBS(无CaMg)。、人外周血。、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)重组人白细胞介素(IL),肿瘤坏死因子α(TNFα)。、FITC标记的鼠抗人CDCDHLADRCD单克隆抗体免疫磁珠标记的鼠抗人CD单克隆抗体(如需高纯度单核细胞。)、温控低速离心机。、倒置显微镜。、细胞计数板、离心管及塑料培养板等。四、方法、按实验一中方法分离获得人PBMC。、调节细胞浓度为mL,然后在孔板上贴壁,每孔加mL,h后吸去悬浮细胞并用预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞。、未成熟DC的诱导:DC培养基I:mL孔:含FCS的RPMI中含GMCSFngmL,ILngmL每天半量换液次培养至天。、成熟DC的诱导:加入DC培养基II:mL孔:含FCS的RPMI中含GMCSFngmLILngmLTNFαngmL。、DC形态观察和表型检测:光镜下形态:树突状细胞比淋巴细胞大,直径在,μm之间,有许多刺状突起,分布于细胞表面。培养d后,流式细胞仪检测DC表达CDCDHLADRCD。五、注意事项、单核细胞分离时要注意保持外周血合理的稀释度以及Ficoll的温度保持在,。PBMC贴壁后冲洗液应ºC预温冲洗应轻柔、如需利用高纯度(纯度>)的单核细胞作为诱导树突状细胞的前体细胞则可利用免疫磁珠标记的鼠抗人CD单克隆抗体及免疫磁珠分离系统分离上述贴壁细胞、操作过程中严格注意无菌操作。六、思考题、目前还有哪些常用的诱导人树突状细胞形成和成熟的方法,、人树突状细胞的功能有哪些根据其功能可将树突状细胞分为哪些亚群,、体外评估人树突状细胞功能的常用方法有哪些,、人树突状细胞有哪些理论研究和应用价值,(居颂光)实验十小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的制备(AbstrctionofPeritonealCellandMacrophageofMouse)一、目的要求、掌握小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的获取方法。、了解小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的作用及用途。二、原理单核巨噬细胞作为免疫系统重要的组成成分参与机体固有免疫应答作为桥梁连接机体固有免疫应答和适应性免疫应答。单核巨噬细胞的分离和检测对体内外评估机体的免疫功能和应用单核细胞进行免疫干预具有重要意义。从小鼠腹腔可获得大量的以巨噬细胞为主的腹腔细胞是免疫学研究中常用的单核巨噬细胞来源。利用ºC预温RPMI培养液冲洗腹腔可诱导腹腔巨噬细胞游出进入洗液由于单核巨噬细胞具有强烈粘附塑料器皿的特性可将抽出腹腔的巨噬细胞置入冰上预冷的容器并用预冷PBS缓冲液洗涤防止细胞在操作过程中损耗在获得腹腔细胞后可利用贴壁法去除非贴壁细胞而富集巨噬细胞。如需要更多量的巨噬细胞可通过预先向小鼠腹腔注射刺激剂降植烷(Pristane)或无菌液体石蜡油等诱导腹腔炎症从而促使巨噬细胞大量渗出。三、材料、,周龄小鼠。、RPMI培养液。、胎牛血清。、PBS(无CaMg)。、小鼠腹腔注射刺激剂降植烷(Pristane)或无菌液体石蜡油。、台盼兰染液。、温控低速离心机。、显微镜。、细胞计数板、离心管、孔塑料培养板、ml塑料针筒、剪刀与镊子等。四、方法、取,周龄小鼠用酒精消毒皮肤腹腔注射Pristane(或液体石蜡油)ml,d后收集腹腔细胞。如要收集腹腔静止巨噬细胞则不注射刺激剂。、断颈处死小鼠浸入酒精消毒,min。、固定小鼠用眼科剪于小鼠腹部中央剪一横向切口用两手向头尾两侧撕开暴露腹壁肌肉。、用ml注射器吸取mlºC预温的RPMI培养液一手持镊子轻轻提起腹壁一手持注射器将针尖刺入腹腔。、向腹腔推入mlRPMI培养液轻弹小鼠腹部将针尖进至肝肾隐窝最低点回吸洗液如此迅速反复冲洗腹腔次后尽量将洗液抽出。、迅速转移至预先至于冰上的ml离心管内rpmºC离心min弃上清。、用PBS洗涤细胞次每次rpmºC离心min。、弃上清用预冷的含有胎牛血清的RPMI培养液重悬细胞至×ml。、贴壁法富集巨噬细胞:()按×cm将腹腔细胞细胞接种于孔塑料培养板ºCCO培养h。()轻晃培养板吸取培养上清用ºC预温的RPMI培养液轻轻洗涤培养孔次。)用冰上预冷的PBS(无CaMg)冲洗培养孔将贴壁细胞冲洗下来迅(速置入冰上预冷的离心管中rpmºC离心min弃上清。()用预冷的含有胎牛血清的RPMI培养液重悬细胞至所需浓度备用。并用台盼兰拒染法计算细胞活力。五、注意事项、在腹腔细胞冲洗和洗涤以及重悬的操作过程中注意实验器材和溶液的预冷防止巨噬细胞贴附于实验器皿而导致细胞损耗。、操作过程中严格注意无菌操作。六、思考题、怎样确定腹腔巨噬细胞纯度,、在免疫学研究中腹腔来源巨噬细胞有何用处,、除上述方法外还有哪些获得单核巨噬细胞的途径,(居颂光)实验十一多克隆抗体的制备(Preparationofpolyclonalantibody)一、目的要求、掌握多克隆抗体的制备原理、熟悉多克隆抗体的制备过程、了解多克隆抗体效价的鉴定与判断方法二、原理抗原分子通常具有多个抗原表位用抗原免疫动物后可激发多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答。由活化的B细胞分化成浆细胞分泌抗体进入血液从血清中分离出多种针对不同抗原表位抗体的混合物即为多克隆抗体(polyclonalantibody,pAb),也称免疫血清或抗血清。高效价抗血清的获取主要取决于抗原的纯度、免疫原性及免疫程序(如免疫途径、抗原剂量、注射次数与周期等)。为提高抗原的免疫原性可在免疫动物时加用佐剂。常用的是弗氏佐剂包括弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂两种。三、材料、纯化的人免疫球蛋白IgG。、生理盐水或PBS。、弗氏完全及不完全佐剂(可自行制作或购买成品)。、健康成年兔雄雌不限体重,kg。、Eppendorf、金属镊子、无菌注射器及号与号注射针头。、动物固定架手术器械。、酒精棉球及碘氟等。四、方法、按,微克公斤体重称取人免疫球蛋白Ig溶于ml生理盐水进行计算。置于适当容器中进行溶解。、逐滴加入等体积的弗氏完全佐剂用装有号注射针头的注射器反复抽吸进行乳化直至取滴放在冰水面上不散开即为形成了乳化剂。、将体重适宜的健康家兔用剪刀剪去颈背部及后脚掌的毛发固定好。用碘氟、酒精消毒皮肤。、用ml的注射器吸取抗原溶液ml,于兔颈背部及后脚掌皮下多点注射每点,ml。、间隔周重复免疫抗原的剂量及注射部位同上应用弗氏不完全佐剂进行乳化。免疫,次。、末次免疫可经静脉注射不加佐剂的抗原溶液剂量为首次免疫的,。、免疫血清的效价测定:末次免疫后天左右从耳缘静脉取血少许放置小时以上以rmin离心分钟收获血清。采用免疫双扩散方法测定抗体的效价。、经测定如抗体效价达到要求(一般为:以上)采用颈动脉放血法收集血液(应无菌操作)待其凝固后离心收获血清。五、注意事项、抗原乳化剂的制备、动物免疫及收获血清等实验过程中均应注意无菌操作。、动物免疫的抗原用量及免疫次数因抗原的性质及不同的动物种类而异。一般免疫,次。、如经鉴定抗体效价较低可再免疫,次后收获免疫血清。六、思考题、免疫动物的途径大多采用皮下注射为什么,、制备可溶性抗原的溶液时加用免疫佐剂的目的是什么,附:免疫血清的保存方法为了减慢抗体效价降低的速度免疫血清一般采取无菌、低温、高浓度及加防腐剂的方法保存。收获的免疫血清应立即进行分装后冷冻保存。视具体情况(如免疫血清仅用于体外的实验研究)可加入,的叠氮钠(NaN)作为防腐剂。保存过程中尽可能减少冻溶的次数以免抗体变性效价降低。(邱玉华)实验十二B淋巴细胞杂交瘤的建株(BlymphocyteHybridomaEstablishment)一、目的要求、掌握分泌特异抗体杂交瘤细胞建株的原理。、熟悉细胞融合的操作过程及技术要点。、了解细胞杂交后细胞生长状态的观察、分析与处理方法。二、原理根据抗体选择学说一个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系称为克隆(clone又称无性繁殖细胞系或克隆系)。来自克隆系的细胞基因是完全相同的产生的抗体也完全相同。这种从一株克隆系产生的性质相同的均一抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,单抗)。它们具有完全相同的分子结构和生物学特性但这种具有分泌功能的B淋巴细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术将上述B淋巴细胞与在体外能长期增殖的骨髓瘤细胞进行融合经过选择培养获取杂交细胞这种细胞称为杂交瘤细胞(Hybridoma)。该细胞既有免疫B淋巴细胞分泌特异性单抗的功能又具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。HAT代表次黄嘌呤(hypoxanthineH)、氨基碟呤(aminopterinA)和胸腺嘧啶(thymidine,T)三种物质。肿瘤细胞的DNA生物合成有两条途径一是生物合成的主要途径即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸进而合成DNA。在核酸合成过程中叶酸衍生物为合成核苷酸所必需氨基碟呤是一种叶酸拮抗物它可阻断细胞内DNA生物合成的主要途径。此时若培养液中含有核苷酸合成的中间产物次黄嘌呤和胸腺嘧啶则细胞的DNA合成可通过另一条替代途径进行即在HGPRT和TK(thymidinekinase,TK)的催化下利用外源性的次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸。若缺乏其中一种酶该合成途径被阻断。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后。存在种不同的细胞类型:脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体脾细胞和骨髓瘤细胞的同核融合体及未发生融合的脾细胞和骨髓瘤细胞。脾细胞及其同核融合体在培养液中不能长期生长天左右即死亡骨髓瘤细胞及其同核融合体在HAT培养液中其DNA合成的主要途径被A阻断后由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中的H虽TK可利用T但不能完成完整的DNA合成过程。只有脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体即杂交瘤细胞既从脾细胞获得了HGPRT和TK从而利用培养液中的H和T合成DNA又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力因此能在HAT选择培养液中生存下来。B淋巴细胞杂交瘤的建株及单克隆抗体的制备三、材料、特异抗原免疫的BALBc小鼠。、小鼠骨髓瘤细胞sp或X。、细胞融合剂PEG(分子量,)。、离心机。、水浴锅。、,目钢丝筛。、简易解剖架。、玻璃注射针芯。、,cm平面皿。、PBS、基础培养基及HAT培养基。、孔细胞培养板。、吸管、吸球、ml塑料离心管、烧杯、酒精消毒、小剪刀及镊子等。四、方法、取免疫BALBc小鼠,摘除眼球致死自来水冲洗干净酒精消毒分钟。、将小鼠腹部朝上放置在简易的解剖架上。、打开腹部取出脾脏置于钢丝筛内将筛放在盛有约ml的PBS或基础培养基的平面皿中用玻璃注射针芯轻轻压磨脾脏成单个细胞。移去钢丝筛计数细胞用吸管将细胞转移至离心管中。、取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp或X混合(:)于ml塑料离心管中rpm离心分钟弃上清(要彻底)轻轻弹松细胞。、用移液管取mlPEG溶液(放置水浴预热)将移液管的尖端插入管底轻轻地搅动细胞并缓慢地滴加PEGmin内加完。静置min。再漫漫加入基础培养液,ml。rpm×min离心弃上清。、将沉淀细胞轻悬于适量的HAT选择培养液中滴加在孔培养板中每孔ml(滴)静置min,显微镜下观察融合细胞的状态。五、注意事项、取小鼠脾脏细胞时要正确抓住小鼠以免被其咬伤。、脾脏细胞和骨髓瘤细胞混合离心后要彻底弃去上清。、融合时要缓慢加入PEG融合并边加边轻轻搅拌以保证细胞与融合剂的充分接触。七、思考题、细胞融合后有几种状态的细胞存在,、HAT培养基选择培养的原理与目的是什么,(邱玉华)实验十三细胞周期的分析(AssayofCellCycle)一、目的要求、熟悉细胞周期的基本概念、原理掌握实验操作的流程和方法。、观察流式细胞仪检测、分析细胞周期的各种峰形图的意义。、了解细胞周期测定实验的用途。二、原理细胞周期是指从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束所经历的时间。细胞周期反映了细胞的增殖速度周期越短说明细胞的增殖速度越快。测定细胞周期的方法很多有同位素标记法、细胞计数法和流式细胞仪测定法等。流式细胞仪测定法是利用溴化乙锭(PI)渗入测定细胞周期的方法。溴化乙锭加入培养基后可做为细胞DNA复制的原料经过两个细胞周期后细胞中两条单链均含溴化乙锭的DNA将占l反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期则染色体中约一半为两条单体均浅染另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期则两条单体均深染。计分裂相中各期比例就可算出细胞周期的值。三、材料、秋水仙素。、溴化乙锭(mgml)。、无水乙醇。、RPMI完全培养基。、RNaseA(mgmL)。、PBS。、孔细胞培养板。、离心机。、流式细胞仪。、细胞培养箱。四、方法、取×对数生长期的细胞接种于孔板调整好细胞生长状态。、离心收集细胞弃上清用预冷PBS洗涤两次。、加入预冷,乙醇ml于固定分钟。、离心收集细胞取mLPBS洗涤一次加入ml反应液(含μgmL溴化乙锭μgmLRNaseA和TritonX的PBS)避光孵育分钟。、PBS洗涤两次用流式细胞仪检测分析。五、注意事项、实验操作过程中动作要尽量轻柔不可用力打碎细胞。、RNA酶最好现加以彻底去除细胞中RNA的干扰。、溴化乙锭是光敏物质操作过程中注意避光。、最后一步的洗涤应尽量弃净上清以免游离PI残留影响实验结果。六、思考题、认真查阅资料测定细胞周期的方法还有那些,、如何使培养板中用于测定的细胞周期同步化,、细胞周期测定可应用于哪些方面的研究,(陈永井)实验十四双向免疫扩散技术(DoubleImmunodiffusion)一、目的要求、熟悉双向免疫扩散试验的基本原理练习实验操作方法。、观察抗原、抗体扩散后在琼脂凝胶中形成的沉淀线。、了解双向免疫扩散实验的用途。二、原理可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合在一定的温度和电解质存在的条件下比例适当的抗原和抗体经过一定的反应时间能够形成肉眼可见的沉淀物称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。抗原、抗体在凝胶中自然扩散于接触界面发生免疫反应出现抗原抗体复合物沉淀叫做免疫扩散反应。双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数及位置可了解抗原或抗体的若干性质如浓度、特异性等。沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关抗原浓度越高形成的沉淀线距离抗原孔越远抗体浓度越高形成的沉淀线距离抗体孔越远。因此当固定抗体的浓度稀释抗原可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置测定未知抗原的浓度同理若固定抗原的浓度亦可测定抗体的效价。观察两个邻近的抗原孔与一个抗体孔所形成的沉淀线的形状可以判断这两种抗原是否有共同成分。()融合性沉淀孤说明两孔中抗原相同为同一性反应()两沉淀线独自形成并形成交叉说明两孔中的抗原完全不同为非同一性反应()融合性沉淀弧出现支线或同时有另一条或两条沉淀线说明两孔中抗原有相同成分又有不同成分此为部分同一性反应三、材料、,生理盐水琼脂。、羊抗鼠IgG。、鼠IgG。、兔IgG。、羊IgG。、人IgG。)。、方阵型打孔器或单孔金属管(孔径约mm、培养箱。、吸管、微量加样器、载玻片、注射针头、滤纸、纱布及带盖铝盒。四、方法、在沸水中加热溶解,琼脂。、将载玻片置于水平桌面上取已溶化的盐水琼脂ml倾注于载玻片上使其自然流成平面。、琼脂凝固后取方阵型打孔器打孔或单孔金属管打孔再用注射针头挑去孔中琼脂。孔径mm孔距距mm。每块琼脂板打两个方阵型。、用油性记号笔在琼脂板的底面将孔编号。、用微量加样器加羊抗鼠IgG鼠IgG于两个方阵型的中央孔中第一方阵型的周围孔依次加入鼠IgG、兔IgG、羊IgG、人IgG。第二方阵型周围各孔依次加入:、:、:、:稀释的羊抗鼠IgG。、将玻片置于有湿纱布的有盖铝盒内。、培养箱静置小时后取出载玻片观察抗原抗体复合物形成的白色沉淀线。五、注意事项、加样时不要将琼脂划破样品不要溢出加样孔以免影响沉淀线的形成。、反应时间要适当。时间过长会出现沉淀线解离、无沉淀线或沉淀线模糊不清。、加样时作好标记不同浓度抗体和抗原不要混淆否则影响试验结果。、加样时吸取每份标本均应更换塑料吸头。六、思考题、根据观察的结果分析各种抗原有无共同成份是否存在交叉反应,、羊抗鼠IgG抗体的效价如何,哪种稀释度比较理想,、该技术可应用于哪些方面的研究,(陈永井)实验十五免疫印迹技术(WesternBlotting)一、目的要求、了解蛋白质印迹法的基本原理及其应用。、掌握免疫印迹的实验操作方法。二、原理免疫印迹法又称为Westernblot是一种利用抗原抗体特异性反应的原理检测固定在固相载体上蛋白质抗原的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化。蛋白质抗原(待测蛋白)根据其分子量大小利用SDSPAGE电泳方法进行分离再通过电场作用将凝胶中分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上利用针对目的抗原的单克隆或多克隆抗体(一抗)与NC膜上的抗原发生特异性结合进一步用酶或其他某种物质标记的第二抗体与一抗反应使得目的蛋白条带被酶等所标记。将NC膜上结合的酶与其特异性底物反应使膜上目的蛋白条带显现并被放大。根据蛋白条带的位置确定其分子量大小。该方法广泛应用于蛋白的定性分析和半定量分析。因该实验中电泳分离后的蛋白往往需再利用电转移方法将蛋白转移到固相载体上所以把这个过程称为免疫印迹。三、材料、BioRad电泳仪转膜仪玻璃制胶版离心机电炉和暗盒。、丙烯酰胺N,N’亚甲双丙烯酰胺十二烷基硫酸钠SDS溶液()TEMED过硫酸胺溶液()。、分离胶缓冲液:mmolLTrisHCL(pH)浓缩胶缓冲液:mmolLTrisHCL(pH)。、×SDSPAGE上样缓冲液:molLTrisHCL缓冲液(pH)ml甘油mlSDSml巯基乙醇ml溴酚蓝mlHOml混匀。、×Tris甘氨酸电泳缓冲液:gTrisg甘氨酸gSDS。用蒸馏水溶解至ml得molLTrismolL甘氨酸电极缓冲液。、转膜缓冲液:称取g甘氨酸、gTris、gSDS加入ml甲醇定容至L。、脱脂奶粉PBS缓冲液和Tween。、第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体。、显影液、定影液、X胶片和红光源。四、方法、根据目的蛋白的性质配制适当浓度的SDSPAGE浓缩胶和分离胶(通常分离胶为浓缩胶为)。、处理蛋白质样品按一定的上样顺序加样品µl于上样孔内同时加入µl预染的蛋白Marker设定V电压进行电泳直至蛋白条带完全分离。、电泳实验结束后剥离SDSPAGE胶小心放入转膜缓冲液中待用。、裁取与胶等面积的硝酸纤维素膜张滤纸张浸透转膜缓冲液同时将张海绵垫也浸泡于转膜缓冲液中。、按示意图的顺序和层次进行SDSPAGE胶、NC膜和滤纸“三民治”转移夹的铺设夹紧后按正确方向放入转移槽进行蛋白质湿转同时插入冰盒。、接通电源设定电压V转移小时。、取出转移夹并拆除用扁头镊子夹出NC膜观察蛋白Marker的转移效果。、将NC膜置于反应盒加入配制好的脱脂奶粉室温封闭小时。、取出NC膜置于第一抗体反应盒(抗体浓度为µgml)室温反应小时。、取出NC膜置于cm玻璃平皿中用PBST(含Tween)洗涤次每次分钟。、将NC膜置于辣根过氧化物酶标记的第二抗体反应盒(抗体浓度为µgml)室温反应小时。、用PBST洗涤次每次分钟。、在暗室中历干NC膜铺于透明塑料袋加入ECL反应底物。、在暗盒中压入X胶片使蛋白条带暴光适当时间(目的条带蛋白量越高暴光时间越短)。、将X胶片浸于显影液中反应分钟。、用清水冲洗后置于定影液中反应分钟左右。、自来水冲洗后观察、晾干并拍照。五、注意事项、蛋白上样量要适当上样前须煮沸,分钟。、铺NC膜时必须赶尽气泡。、抗体用量、反应时间和暴光时间要适当否则容易出现非特异性条带。、过硫酸胺须现配现用电泳和转膜时正确接入正、负电极。、蛋白质转移过程中须保持低温最好插入冰盒或埋于冰中进行。六、思考题、免疫印迹的特点是什么,、实验中转有蛋白的NC膜为什么要用脱脂奶粉先封闭再与一抗反应、洗涤液中加入的Tween有何作用、如何确定压片暴光的时间显影、定影可以用红光源吗,(陈永井)实验十六荷瘤动物模型的建立(TheAnimalModelWithTransplantedTumor)一、目的要求、了解荷瘤动物模型的建立方法。、了解建立肿瘤动物模型的用途。二、原理荷瘤动物模型是将体外人工培养的肿瘤细胞接种于适当的动物体内通过肿瘤细胞在动物体内的增殖形成实体瘤或血循环中的散在肿瘤。从而研究肿瘤在体内的生长、扩散、生存时间、死亡率等肿瘤生物学特性。同时还可将荷瘤动物用于新的抗肿瘤药物的筛选以及治疗效应与毒副作用的评价研究等。三、材料、BALBc裸鼠,周龄,体重,g,雄雌各半。、人B淋巴瘤细胞株Raji。、RPMI培养基。、胎牛血清。、生理盐水(NS)。、碘氟及酒精棉球。、台盼蓝染液。、游标卡尺。、生物倒置显微镜。、电子天平。、离心机。、吸管、试管、载玻片及注射器等。四、方法、收集生长良好的Raji细胞于试管中rmin离心min弃上清。、加入适量生理盐水重新悬浮细胞取滴与等量的台盼蓝染液混合均匀后滴加在载玻片上用显微镜计数活细胞的比率(计数至少个细胞活细胞不着色死细胞被染成篮色)。要求活细胞在以上。、将上述细胞再行离心速度同上。重复洗涤次。、用生理盐水将细胞的浓度调整为×ml。、用碘氟及酒精棉球序贯消毒小鼠的前左侧腋下皮肤。、用注射器吸取Raji细胞悬液小鼠皮下注射ml只。、逐日观察小鼠的生存状态定期用游标卡尺测量瘤的长径、短径和高度。肿瘤体积的计算方法为:V(mm)=(,长径短径高度)。同时记录成瘤时间及小鼠存活期等指标。、根据肿瘤的生长状况绘制肿瘤生长曲线计算成瘤率及荷瘤鼠的存活期(接种肿瘤细胞后观察天)。五、注意事项、各种肿瘤细胞株的致瘤性差异较大针对具体的肿瘤细胞应摸索适当的接种数量一般在,×只。、小鼠皮下注射的体积不宜太大一般为,ml。、接种时注射针刺入皮肤后应轻轻挑起针尖后注入肿瘤细胞以免刺入太深。六、思考题、用来源于人的肿瘤细胞建立肿瘤模型为什么选用BALBc裸鼠,、建立肿瘤模型的用途有那些,(朱华亭)附件:免疫学实验常用试剂及配制方法一、缓冲液、血细胞保存液葡萄糖g氯化钠g枸橼酸钠g枸橼酸g将上述试剂溶解于ml蒸馏水经kg高压蒸气灭菌min保存备用。、Hanks液原液甲:NaClgKClgMgSOHOgMgClHOgCaClg(先溶于ml双蒸水中)溶于ml双蒸水加氯仿ml防腐保存。原液乙:()NaHPOHOgKHPOg葡萄糖g将上述各物溶于双蒸水ml中。()酚红溶液:称取酚红g放入玻璃研钵中滴加molLNaOH,不断研磨直至完全溶解约加molLNaOHml。将溶解的酚红吸入ml量瓶中用双蒸水洗下研钵中残留酚红液并入量瓶中最后补加双蒸水至ml。将()液和()液混合补加双蒸水至ml即为原液乙加氯仿ml防腐置保存。应用液:原液甲份原液乙份双蒸水份混合后分装于ml小瓶中kg高压蒸气灭菌min保存可使用个月临用前用无菌的NaHCO调pH至,。、无Ca、MgHanks液NaClgKClgNaHCOgNaHPOHOgKHPOg葡萄糖g酚红ml将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中最后补加双蒸水至ml以NaHCO调整pH至冰箱保存备用。、molL磷酸盐缓冲液(PB)A液(molLNaHPO):称取NaHPOHOg(或NaHPOHOg)溶于蒸馏水中最后补加蒸馏水至ml。B液(molLNaHPO):称取NaHPOHOg(或NaHPOHOg或NaHPOHOg)加蒸馏水溶解最后加水至ml。molL缓冲液配制:A液Xml中加入B液Yml为molLPB(见下表)。若再加蒸馏水至ml则成为molLPB。molL磷酸盐缓冲液(PB)的配制pH值A液(ml)B液(ml)pH值A液(ml)B液(ml)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)()molLPBS(pH)molLA液mlmolLB液ml加NaClg用蒸馏水稀释至ml。()molLPBS(pH)molLA液mlmolLB液ml加NaClg用蒸馏水稀释至ml。加NaClg用蒸馏水稀释至ml。(注:A、B两液配制见“”)。Tris缓冲液(TBS和THB)()molLTBS(pH)的配制Tris(三羟甲基胺基甲烷)gNaClg加蒸馏水ml磁性搅拌下滴加浓HCl至pH为再加蒸馏水至ml即可。如需含TritonX,则在滴加HCl前先加mlTritonX,()THB的配制A液(molLTris):称取gTris(MW)溶于ml蒸馏水中。B液(molLHCl):取HCl(比重)ml加入蒸馏水中使成ml。不同pH(,)的molLTHB配制:取A液ml加入B液Xml(见下表)补加蒸馏水至ml。B液(ml)pH值B液(ml)pH值碳酸盐碳酸氢钠缓冲液(molL)pH值molLNaCOmolLNaHCO()(ml)(ml)(注意:该缓冲液在Ca、Mg存在时不得使用)molL醋酸缓冲液(pH,)A液:molL醋酸:冰醋酸,,相对密度(比重),,ml加蒸馏水使成ml。B液:molL醋酸钠水溶液:醋酸钠(CHONa)g或(CHONaHO)g加蒸馏水使成ml。缓冲液:按下表将A液XmlB液Yml蒸馏水至ml即配成所需的pH。pH值A液(ml)B液(ml)pH值A液(ml)lB液(ml)µmolLpH巴比妥缓冲液巴比妥g(加蒸馏水ml加热溶解)巴比妥钠g叠氮钠g加蒸馏水溶解并补加到ml。硼酸盐缓冲液(Boratesalinebuffer)a不同pH硼酸盐缓冲液molL硼酸(HBO):硼酸g加水至ml。molL硼砂(NaBO):硼砂g加水至ml。如下配制。pHmolLmolLpHmolLmolL硼砂(ml)硼酸(ml)硼砂(ml)硼酸(ml)磷酸缓冲甘油封固剂(pH)pHmolLPB:取molLNaHPOml加molLNaHPOml蒸馏水加至ml。pHmolLPB混合即可。用于免疫荧光实验。份甘油与份pHmolL甘氨酸缓冲液取甘氨酸gNaClg加蒸馏水至ml再加molLNaOH,ml调至pH。二、培养液RPMI基础培养液()RPMIg()HEPESgg()谷氨酰胺g()碳酸氢钠g()葡萄糖()丙酮酸钠g用适量蒸馏水并定容至ml用µm微孔滤膜滤过除菌。分装后保存。mmolLL谷氨酰胺溶液L谷氨酰胺g三蒸水ml溶解后过滤除菌分装小瓶每瓶ml保存。两性霉素B配法(gml)两性霉素Bmg三蒸水ml过滤除菌分装小瓶每瓶ml保存。无血清RPMI的配法RPMI培养液mlL谷氨酰胺(mmolL)ml抗生素(青链霉素)(万ml)mlNaHCOml混匀后即可使用。RPMI完全培养液RPMI培养液mlL谷氨酰胺(mmolL)ml抗生素(青链霉素)(万ml)ml两性霉素B(gml)mlNaHCOml灭活小牛血清ml混匀后即可使用。TC培养液取培养基干粉g溶于三蒸水ml加温使溶加NaHCOg使pH调至滤膜除菌分装保存。EagleMEM培养液()将MEM(标准包装)干粉倒入ml三蒸水(温度为,)搅匀待溶解。并用另外ml三蒸水冲洗MEM包装内的剩余粉末汇集到一块搅拌直至完全溶解透明。()每升MEM加入gNaHCO(或NaHCO溶液ml)同时也可加入其他补充物如抗生素、HEPES等。()用molLNaOH和molLHCl调pHpH可比需要值高出。()滤膜除菌分装置保存。保存。三、ELISA试剂包被缓冲液(pH、molL碳酸盐缓冲液)NaCOgNaHCOg加入蒸馏水至ml洗涤缓冲液(pH、molLTrisHClTween)Tris(三羟甲基氨基甲烷)gmolLHClmlTweenml加蒸馏水至ml稀释液牛血清白蛋白(BSA)g加洗涤缓冲液至ml或使用以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成的,液。终止液(molLHSO)蒸馏水ml逐滴加入浓硫酸()ml。底物缓冲液(pH磷酸柠檬酸缓冲液)molLNaHPO(gL)mlmolL柠檬酸(gL)ml加蒸馏水mlTMB(四甲基联苯胺)使用液TMB(mgml无水乙醇)ml底物缓冲液(pH)mlHOµl四、其他试剂溶液酚红取g酚红置于乳钵中加入少量molLNaOH研磨将溶解液移至ml量瓶中。分批加入molLNaOH研磨直至酚红溶解所得染液都移入量瓶中NaOH的用量不能超过ml。加双蒸水至ml过滤置室温或保存。碳酸氢钠液调pH常用浓度有、、三种。用双蒸水(或去离子水)配制。无菌过滤除菌小量分装或灭菌min分装置保存。肝素抗凝剂取肝素用Hank's液(或其他溶剂)稀释至终浓度为ml灭菌min(或min)后分装保存。用时按每毫升血液加,ml肝素抗凝。或按实验要求浓度配制、使用。姬姆萨(Giemsa)染液姬姆萨染料g甘油ml甲醇ml将g染料加到ml甘油中混匀置水浴箱内h不时搅拌。取出晾至于室温相同时加入甲醇ml用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤滤液即为原液。应用时用PBS(molLpH,)或蒸馏水稀释倍瑞氏(Wright)染液瑞士染料g纯甲醇ml将g染料置于乳钵中加入少量纯甲醇研磨将溶解的染料移至洁净的棕色玻璃瓶中。分批加入甲醇研磨直至染料全部溶解。配制的染料置室温周后即可使用。新鲜配制的染料偏碱放置后可显酸性。染料储存越久染色越好。要封闭保存以免吸收水分影响染色效果。也可加入ml中性甘油染色效果更好。瑞氏姬姆萨染液取瑞士染液ml姬姆萨原液ml加蒸馏水或PBS(pH,)ml。如沉淀生成须重新配制或按以下方法配制:瑞士染料g姬姆萨染料g甲醇ml配制方法同瑞士染液。台盼蓝(trypanblue)台盼蓝g双蒸水ml将台盼蓝加入双蒸水中充分溶解(配制方法同瑞士染液)过滤去沉淀置或室温保存。临用时用gLNaCl盐水:稀释后即可应用。伊红Y(eosinY)伊红Yg双蒸水ml配制方法同台盼蓝。中性红(neutralred)中性红g双蒸水ml配制方法同台盼蓝。临用前用Hank's液稀释倍即可用于染色。Nessler试剂(奈氏试剂)a氯化汞g、KIg、NaOHml加蒸馏水至ml。b碘化汞g、碘化钾g加蒸馏水ml完全溶解后过滤加KOHml。Alsever液(阿氏液)葡萄糖g、柠檬酸钠(HO)g、NaClg、蒸馏水ml溶解后以柠檬酸调pH过滤、分装MPa(磅吋)min灭菌保存。酚红溶液称g酚红置于玻璃研钵中逐渐加入molLNaOH不断研磨直至所有颗粒几乎完全溶解所加NaOH量应为ml将已溶解的溶液吸入ml量瓶中用双蒸水洗研钵数次均收集于量瓶中最后加双蒸水至ml摇匀保存于冰箱备用。氨基黑染色液将g氨基黑B溶在molL醋酸ml中再加molL醋酸钠ml混匀后置棕色瓶中保存。脱色液冰醋酸ml、甘油ml、冰蒸馏水ml混匀。清洁液重铬酸钾g蒸馏水ml浓硫酸ml。加重铬酸钾加入蒸馏水中使之自然溶解或水浴溶解亦可在大坩埚中加热溶解然后慢慢加入浓硫酸边加边搅拌见发热过剧则稍停冷却后再继续加。盛清洁液的容器要坚固上加厚玻璃盖操作时要穿橡皮围裙、长统胶靴、戴上眼镜和厚橡皮手套以保安全。洗液一旦变绿表示铬酸已经还原失去了氧化能力不宜再用如将这样洗液加热再加适量重铬酸钾又可重新使用。麻醉剂(戊巴比妥)戊巴比妥g生理盐水或PBS加至ml溶解过滤后分装保存。应用于兔及小鼠等动物麻醉。剂量为mgkg体重

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/61

医学免疫学实验技术

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利