四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析（可编辑）

四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析（可编辑） 四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分 析 SHANGHAI UNIVERSITY 毕业设计( 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 ) UNDERGRADUATE PROJECT THESIS 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目: 四种核酸染料在琼脂糖凝胶 电泳中染色特性的比较分析 学 院 生命科学学院 专 业生物工程 学 号 09123303 学生姓名 沈四维 指导教师 华子义 起讫日期 02-25~-06-04 毕业设计(论文)任务书 指导教师 华子义 课题名称 四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中 染色特性的比较分析 作业期限2 月 25 日起 6 月 4 日止 接受单位上海大学生命科学学院 学生姓名沈四维 学 号09123303 所在专业生物工程 二O 年 月 日 一课题来源、意义与主要内容:(注明自拟、科研、科技服务类别及任务提出单位) 课题来源:生产实践 意义与主要内容: 核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法,是分子生物学的核心技术之一。核酸电泳常用溴化乙锭(EB)作染料。但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染严重等缺点。 本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色,与传统染料EB对比,找出既染色效果好,又毒性小,不具致突变性的核酸染料,以期能替代EB成为实验用的普通染料。 二目的要求和主要技术指标: 实验将选用新型染料GenGreen、GelRed、SYBR Green?,以及传统染料EB,分别在缓冲液TAE和TBE中进行电泳,进行灵敏度、染色效果等方面的对比。各方综合,选出最佳染料,确保改进后的方法不仅经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏,而且毒性低,更好地确保操作人员的健康和周围环境的安全。 三进度计划: 2-25~3-5 查阅文献资料。 3-6~3-8 预实验,确定λDNA的浓度梯度。 3-9~3-29 以TAE为缓冲液,分别以4种染料染色,电泳。(胶染法、泡染法) 4-1~4-30 以TBE为缓冲液,分别以4种染料染色,电泳。(胶染法、泡染法) 5-1~6-4 写论文,准备答辩。 主要文献、资料和参考书: 《EB、银染和SYBR Green?在DNA显示中的比较》 《琼脂糖凝胶电泳常见问题的分析》 《核酸染料的应用研究课题》 《3中核酸染料应用于细菌脉冲场凝胶电泳染色的比较分析》 《EB和SYBR Green?染色方法的比较》 (五)审批意见: 系教研室负责人: 20 年 月 日 (六)学生意见: 学生签名: 20 年 月 日 (七)课题变动情况: 负责人: 20 年 月 日 (八)注意事项: 本任务书一式三份。(一)、(二)、(三)、(四)各项一般应在毕业作业开始前二周由指导教师认真填写,经系(教研室)负责人审查批准后,一份留系备查,一份由指导教师保存,一份下达给学生。 学生应在导师指导下,根据本任务书的要求具体制订实施计划,并积极完成任务。 课题内容如有变动,需经所属系或接受单位负责人同意。 毕业设计(论文)开题报告 学 院 生命科学 专 业 生物工程 学 号 09123303 姓 名 沈四维 指导教师 华子义 日 期 二? 13年 3 月 1 日 课题名称 四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析 课题来源 生产实践 一、课题背景及意义 (课题的立题依据及研究意义) 近年来分子生物学得到了迅速发展,聚合酶链式反应(PCR)是公认的一种简便、准确的核酸定量 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 技术。核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法,是分子生物学的核心技术之一。然而,它所能检测的极限及精确度依赖于现实DNA的染色方法。核酸电泳常用溴化乙锭(EB)作染料。EB能使凝胶中的DNA合RNA很好得着色,但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染严重等缺点。 本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色,与传统染料EB对比,找出既染色效果好,又毒性小,不具致突变性的核酸染料,以期能替代EB成为实验用的普通染料。 二、课题研究现状及发展趋势 (课题研究领域的发展现状及可能的发展方向) 现在研究者正在不断研究推出既染色效果好,又不具有致突变性的核酸染料,以期能替代EB成为实验用的普通染料,从而减少由EB染色带来的环境污染。如:GoldView、GelRed、GenGreen、SYBR Green?等。其中,GoldView的灵敏度与EB相当,使用方法与EB相同,而毒性低于EB。SYBR Green?的灵敏度为EB的 十倍,使用方法与EB相同,且几乎无毒,不具有致突变性,可用于凝胶中的核酸染色,也可用于对细胞中的核酸染色,但价格比较昂贵。 该领域可能的发展方向是:EB将被逐渐替代,甚至淘汰。将有经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏、相关性好、样品用量少、时间成本低、而且更好地保障工作人员的健康和周围环境安全的染料,并形成 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化操作方案。 三、研究内容及研究目标 (对研究的内容进行 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 ,并阐明要达到的目标) 实验将选用新型染料GenGreen、GelRed、SYBR Green?,以及传统染料EB,分别在缓冲液TAE和TBE中进行电泳,进行灵敏度、染色效果等方面的对比。各方综合,选出最佳染料,确保改进后的方法不仅经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏,而且毒性低,更好地确保操作人员的健康和周围环境的安全。 四、预计的研究难点 (课题研究过程中可能遇到的理论难题或技术难点) 保证实验的平行性。在实用不同的核酸染料电泳时,要保证其他的条件不变。如:相同的缓冲液、λDNA、PH、温度等。 点样时要快而精准,防止点入的样品溢出,飘散到缓冲液中,影响实验准确性。 五、创新点 (选题、观点、理论、材料、方法等创新点) 通过查阅大量文献,还未发现同时比较GenGreen、GelRed、SYBR Green?,以及传统染料EB这四种核酸染料的先例。 在染色方法上,选用胶染法和泡染法两种方法。 选择了不同的缓冲液:TAE和TBE。 六、进度计划 (根据研究内容及研究目标所预计的进度安排) 2-25~3-5 查阅文献资料。 3-6~3-8 预实验,确定λDNA的浓度梯度。 3-9~3-29 以TAE为缓冲液,分别以4种染料染色,电泳。(胶染法、泡染法) 4-1~4-30 以TBE为缓冲液,分别以4种染料染色,电泳。(胶染法、泡染法) 5-1~6-4 写论文,准备答辩。 七、资料来源 (指能够支持“课题背景”、“课题研究现状及发展趋势”所 论述内容的主要文献资料) 《EB、银染和SYBR Green?在DNA显示中的比较》 《琼脂糖凝胶电泳常见问题的分析》 《核酸染料的应用研究课题》 《3中核酸染料应用于细菌脉冲场凝胶电泳染色的比较分析》 《EB和SYBR Green?染色方法的比较》 指导教师意见:(对课题的认可意见) 指导教师: 年月日 系(教研室)审查意见:系(教研室)负责人:年月日 教务处制 目录 摘要 I ABSTRACT II 第一章 绪 论 1 1 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1 1.1 琼脂糖凝胶电泳概况 1 1.2 影响电泳因素 1 1.3 电泳方法 3 2选题背景 4 2.1 立题依据及研究意义 4 2.2 研究领域发展现状及展望 5 3多种染料概况 5 3.1 EB 5 3.2 GelRed 5 3.3 GenGreen 6 3.4 SYBR Green? 6 第二章 实验材料与方法 8 1材料及仪器 8 1.1实验试剂 8 1.2实验仪器 8 1.3实验用品 9 2实验方法 9 2.1 试剂准备与配制 9 2.2 琼脂糖凝胶的制备 10 2.3 点样与电泳 12 2.4结果观察与记录 13 第三章 实验结果与分析 14 1电泳分析 14 1.1胶染法TBE为缓冲液 14 1.2胶染法、以TAE为缓冲液时 18 1.3泡染法、以TBE为缓冲液时 22 1.4 泡染法、以TAE为缓冲液时 26 2不同染料比较分析 30 2.1视觉效果 30 2.2毒性 32 2.3 对DNA的迁移影响 33 2.4 可重复利用率 33 2.5稳定性 33 2.6时间成本 34 2.7价格 34 3实验结果 34 第四章 讨论 36 1实验注意事项 36 2问题及讨论 37 第五章 结 论 39 致 谢 40 参考文献 41 附页 43摘要 本实验采用琼脂糖凝胶电泳法,以不同浓度的λDNA作为样品,选用新型 核酸荧光染料Gelred、GenGreen、SYBR Green?,以及传统染料EB,分别在TAE、 TBE中,分别采用胶染法、泡染法进行染色,进行灵敏度、染色效果、染色时间等 对比实验。 首先将λDNA母液稀释成多种浓度,通过预实验,确定了λDNA的浓度梯 度为0.1、0.3、0.5、0.8、1 、3、5ng/ul。然后将此浓度梯度的λDNA溶液分 别点样于TAE、TBE两种凝胶电泳体系中,进行电泳。另外采用胶染法和泡染法两 种不同的染色方法。对染色效果、灵敏度、时间成本等进行对比分析。 结果表明,新型染料GenGreen,不仅操作简便、条带清晰、定量灵敏、价 格适中,而且无毒、低致突变性,能更好的保证操作人员的健康和周围环境的安 全。在本实验体系中能完美替代EB。 关键词:琼脂糖凝胶电泳;λDNA;EB;GenGreen;GelRed;SYBR Green? ABSTRACT In this study, agarose gel electrophoresis will be taken.With different concentrations of λDNA as calibration solution,and 3 kinds of novel nucleic acid fluorescent dye:Gelred、GenGreen、SYBR Green?,In addition to the traditional dye EB.There will be two kinds of buffer solution:TAE and TBE.Precast gel staining and soak staining will be used.Sensitivity, dyeing effect, dyeing time and many other factors will be compared. First,the original liquor of λDNA will be diluted to various concentrations. The concentration gradient of λDNA is identified as 0.1,0.3,0.5,0.8,1, 3,5 ng / ul through the pre-experiments.Then the λDNA solutions of different concentration will be spotted on two kinds of gel electrophoresis system of TAE and TBE.Using two different staining methods:precast gel staining and soak staining.After electrophoresis and staining,comparing and analyzing dyeing effect, sensitivity, time costs,and so on. The result of experiments show that GenGreen, is easy to operate , more sensitive and affordable,has clear bands.What's more,it has non-toxic and low mutagenicity.It can ensure operator's health and the environment.It can replace EB perfectly in this experimental system. Key words:Agarose gel electrophoresis;λDNA;EB;GenGreen;Gelred;SYBR Green? 第一章 绪 论 1 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1.1 琼脂糖凝胶电泳概况 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸的重要方法[1]。是核酸研究工 作中不可缺少的重要分析手段,广泛应用于基础理论研究、农业科学、医学卫生、 工业生产、国防科研、法医学和商检等许多领域,在生物化学和分子生物学的教 学和科研中具有重要作用[2~5]。 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的基本原理是基于DNA为多元酸,是两性解 离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离 [6]。核酸分子因而带负电荷,在中性或弱碱性缓冲液中向阳极泳动。而琼脂糖主 要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子[2],使用 琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分 子在从负极到阳极移动过程中的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的。 1.2 影响电泳因素 1.DNA分子大小及构型 DNA片段在琼脂糖凝胶中的迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物(marker)移动的距离与未知DNA片段的移动距离时行比较,便可测出未知DNA片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时,很难通过琼脂糖分子之间的空隙,就很难在琼脂糖凝胶中迁徙,普通琼脂糖凝胶很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。 不同构型的DNA:共价超螺旋闭环DNA(?)、直线DNA(?)、开环的双链环状DNA(?)在琼脂糖凝胶中的移动速度不同。在较低琼脂糖浓度中?型比?型迁移地更快,因为?型可以扭曲蠕行快速通过较大的凝胶孔径。而在高浓度的凝胶中,顺序可能颠倒,由于超螺旋DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率较低,而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进[7]。可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 2.琼脂糖的浓度 不同大小的DNA片段需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。对DNA片段的分离范围与琼脂糖浓度有关[8]。分离小于0.4kb的DNA片段时凝胶浓度通常为1.2~1.5%,分离大于8kb的DNA分子所需胶浓度为0.3~0.7%,DNA片段大小位于两者之间则所需胶浓度为0.8~1%。具体琼脂糖浓度与DNA分离范围的关系如下表[9]所示: 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1 表1 琼脂糖浓度与DNA分离范围 电压 在电场强度增加时,不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小[10,11]。一般采用恒压电源,电压选择为5 V/cm左右长度以两个电极之间的距离计算。电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐、清晰,过高时会出现弯月形条带;相反,电压降低,电泳时间较长,核酸条带相对整齐、清晰。 缓冲液 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE),Tris-硼酸(TBE)。双链线状DNA片段在TAE中的迁移速率比在TBE中快,但这些系统的分辨能力几乎相同,只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。 缓冲液浓度要适中,若浓度过低,溶液中缺少离子,电流太小,DNA迁移慢;反之,高离子强度的缓冲液由于电流太大会产生大量热量[12],严重时,会造成DNA的变性和凝胶熔化。 电泳缓冲液一般可重复使用多次,但若出现浑浊情况就应及时更换,否则影响电泳分辨率[9]。 染料 预制凝胶染色法即胶染法,由于在制备凝胶时直接将染料加在凝胶中,电泳时有些染料会嵌入DNA[13],可能会影响DNA的迁移率。如当核酸和EB泳动到 凝胶的适当位置时,EB染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,负电荷减少,使线状DNA迁移率降低15%[7]。 1.3 电泳方法 1.电泳类型 琼脂糖凝胶电泳共有两种类型:垂直型及水平型(平板型)。 水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。本实验选用的电泳方法是水平型,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,从而节约凝胶和染料。 2.缓冲液系统 为了便于保存,电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液,临用时稀释到所需倍数。如:TAE配制成50×的存储液,使用时稀释成1×的工作液;TBE溶液长期贮存会出现沉淀,为避免此缺点,室温下贮存5×溶液,使用时稀释成0.5×的工作液。 3.凝胶的制备 以稀释好的缓冲工作液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入胶槽,插入梳子,自然冷却。胶染法染色时,要在稍冷却(60?左右[14])的琼脂糖溶液中滴入适量染料。泡染法则不用加染料。 4.样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带,可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。 5.电泳 在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。随着电场强度的增加,较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此,在低浓度、低电压下,分离DNA片段效果较好。随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不宜高于5V/cm。 电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的迁移并没有显著的影响。因此,通常在室温下进行电泳即可,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4?进行电泳[15]。 6.染色和拍照 胶染法电泳后直接在凝胶成像系统下观察DNA条带,拍照,输出照片,并进行有关的数据分析。 泡染法要在电泳结束后,要将凝胶放置在配制好的染液中避光染色0.5~1小时左右。再取出进行观察拍照。 2选题背景 2.1 立题依据及研究意义 近年来分子生物学得到了迅速发展,聚合酶链式反应(PCR)是公认的一种简便、准确的核酸定量检测技术。核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法,是分子生物学的核心技术之一。然而,它所能检测的极限及精确度依赖于显示DNA的染色方法。核酸电泳常用溴化乙锭(EB)作染料。EB能使凝胶中的DNA合RNA很好得着色,但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染严重等缺点。 本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色,与传统染料EB对比,找出既染色效果好,又毒性小,不具致突变性的核酸染料,以期能替代EB成为实 验用的普通染料。 2.2 研究领域发展现状及展望 现在研究者正在不断研究推出既染色效果好,又不具有致突变性的核酸染料,以期能替代EB成为实验用的普通染料,从而减少由EB染色带来的环境污染。新型染料更是层出不穷,如:GoldView、GelRed、GelGreen、GenGreen、GeneFinder、SYBR Green?、SYBR Green?等。其中不乏染色效果堪比EB甚至超越EB的染料,然而有些在稳定性、对DNA的迁移影响、灵敏度个、毒性等方面还存在一些问题。 该领域可能的发展方向是:EB将被逐渐替代,甚至淘汰。将有经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏、相关性好、样品用量少、时间成本低、而且更好地保障工作人员的健康和周围环境安全的染料,并形成标准化操作方案。 3多种染料概况 3.1 EB 溴化乙锭EB是核酸电泳最常用的染料。它能使凝胶中的DNA和RNA很好的着色,从而显示凝胶中核酸的相应位置。 但EB具有灵敏度差、毒性强、难以降解转化、净化处理繁琐、环境污染严重等缺点。大量文献报道,包括果蝇、小鼠等的实验均证实小剂量的EB亦存在致突变、抑制细胞生长等问题,长期使用极有可能对操作人员造成危害。废液处理也存在生物安全隐患,污染环境[16~18]。 因此实验结束后,应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置,以避免污染环境。 3.2 GelRed GelRed 是一种无毒性的新型核酸染料。GelRed 独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内,艾姆斯氏试验结果也表明,该染料的诱变性远远小于 EB。 GelRed 灵敏度高,适用于各种大小片段的电泳染色,对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I。 GelRed稳定性高,适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶;室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定,耐光性强。 此外,它操作简单,EB 一样,与在预制胶和电泳过程中染料不降解;而电泳泡染色过程也只需30分钟且无需脱色或冲洗,即可直接用紫外凝胶透射仪观察。GelRed适用范围广,可选择电泳胶染色(胶染法)或电泳泡染色(泡染法) ;适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳;可用于 dsDNA、ssDNA 或 RNA 染色。 3.3 GenGreen GenGreen稳定性极好,适用于使用微波或其他方法加热,可以在室温下保存。 其独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内,艾姆斯氏试验结果表明,该染料的诱变性远小于EB。 适应性广泛,适用于预制凝胶和凝胶电泳泡染色,适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳,可用于 dsDNA、ssDNA或 RNA染色。 染色过程简单,与 EB 一样,在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解;而电泳泡染色过程也只需 30 分钟且无需脱色或冲洗,即可直接用可见光凝胶透射仪观察。 3.4 SYBR Green? SYBR Green?是一种新推出的核酸荧光染料,灵敏度非常高,至少可检出20pg DNA,高于EB染色法25~100倍[19]。 适用于各种电泳分析,操作简单,无须脱色或冲洗。在凝胶核酸染色中的使用方法跟EB完全相同,但不具有EB的强致突变性、强致癌性。 用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强,背景信号低,可适用于多种电泳分析。可用于对凝胶中的核酸染色,也可用于对细胞中的核酸染色,是相对比较安全的染料。 第二章 实验材料与方法 1材料及仪器 1.1实验试剂 1)0.5ug/ulλDNA (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司) GelRed(10,000× 水溶液) GelRed3× 染色液 GenGreen 10,000×(鼎国) GenGreen3× 染色液 SYBR Green? 10,000× ,DMSO DH392-2,Invitrogen分装 SYBR Green?3× 染色液 EBNEP028,鼎国 NaOH EDTA Tris碱 硼酸 冰乙酸 琼脂糖(Agarose 6× loading buffer 以上实验药品和试剂均为分析纯。9~15的试剂和药品均购自国药集团化学 试剂有限公司。 1.2实验仪器 高温高压灭菌锅TOMY SX-500 电热恒温干燥箱恒宇 JB/T5520-91 电子天平METTLER TOLEDO AL104 基础型电泳电源CAVOY 水平电泳槽 上海天能科技有限公司 微波炉 美的 恒温水浴锅 精宏实验设备有限公司 凝胶成像系统(312nm激发)BIO-RAD PH计Mettler Toledo 0.2~2ul移液枪 Thermo 2~20ul移液枪 Thermo 20~200ul移液枪 Thermo 100~1000ul移液枪Thermo 计算机 Lenovo 1.3实验用品 1)250ml三角烧瓶 2)1000ml广口瓶 3)100ml量筒聚丙烯塑料盒 铝箔 药勺 PE手套 橡胶手套 EP管枪头 报纸梳子 胶槽 保鲜膜 报纸 2实验方法 2.1 试剂准备与配制 1.DNA浓度梯度稀释 EP管、枪头连盒放入高压灭菌锅中灭菌20min,再放入烘箱中8h烘干。 取10ul的0.5ug/ulλDNA母液于EP管中,加入990ul的ddH2O,稀释成 5ng/ul溶液。 3)按照下表配制不同浓度(0.1、0.3、0.5、0.8、1ng/ul)的λDNA溶液。然 后放入4?冰箱保存。 管号 1 2 3 4 5 6 7 VλDNA5ng/ul/ul 2 6 10 16 20 60 100 VddH20/ul 98 94 90 84 80 40 0 表2 λDNA浓度梯度配制表 2. 0.5mol/l EDTA溶液的配制 在电子天平上称取14.612gEDTA,置于100ml三角烧瓶中。 在三角烧瓶中加入约80ml的ddH2O,在水浴锅中60?适当加热,在磁力搅拌 器上充分搅拌。 边搅拌边用NaOH调解PH至8。(约用2gNaOH) 搅拌至固体完全溶解。 待溶液冷却后,再用NaOH调解PH至8。 在三角烧瓶中加ddH2O,定容到100ml。 高温高压灭菌后,室温保存。 3. 5×TBE的配制 1)在电子天平上称取Tris碱27g、硼酸13.75g。置于1000ml广口瓶中。 2)加入10ml的0.5mol/L EDTA。 3)加水补足500ml。 4)使用时稀释成0.5×的工作液即可使用。 4. 50×TAE的配制 在电子天平上称取Tris碱60.5g。置于1000ml广口瓶中。 加入50ml的0.5mol/L EDTA。 加入14.275ml冰乙酸。 加水补足250ml。 使用时稀释成1×的工作液即可使用。 5. 染色液的配制 用H2O将GelRed 10,000×储液(或GenGreen、SYBR Green? 储液)稀释约3,300倍到0.1M NaCl中,制成 3× 染色液。(例如将15μL GelRed 10,000×储液和5mL 1M NaCl加到 45mL H2O 中)。 2.2 琼脂糖凝胶的制备 2.2.1胶染法(胶染法)琼脂糖凝胶的制备 1.以TBE为电泳缓冲液 1)称量在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g,倒入150ml三角烧瓶中。 2)熔胶在锥形瓶中加入35ml的0.5×TBE缓冲液,与琼脂糖干粉混合,配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。 3)倒胶琼脂糖浆正在冷却时,在干净的胶槽内摆好合适的梳子,形成加样孔。待熔化的凝胶稍冷却后,在三角烧瓶中滴加2μL核酸染料。轻轻地摇动以便充分混匀。冷却至不烫手(60?C),浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。 4)拔梳 待胶完全凝结后,轻轻拔掉梳子。 2.以TAE为电泳缓冲液 1)称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g,倒入150ml三角烧瓶中。 2)熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1×TAE缓冲液,与琼脂糖干粉混合,配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。 3)倒胶 琼脂糖浆正在冷却时,在干净的胶槽内摆好合适的梳子,形成加样孔。 待熔化的凝胶稍冷却后,在三角烧瓶中滴加2μL核酸染料。轻轻地摇动以便充分混匀。 冷却至不烫手(60?C),浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。 4)拔梳 待胶完全凝结后,轻轻拔掉梳子。 2.2.2 泡染法(泡染法)琼脂糖凝胶的制备 1.以TBE为电泳缓冲液 1)称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g,倒入150ml三角烧瓶中。 2)熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1×TBE缓冲液,与琼脂糖干粉混合,配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。 3)倒胶 琼脂糖浆正在冷却时,在干净的胶槽内摆好合适的梳子,形成加样孔。 冷却至不烫手(60?C),浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。 4)拔梳 待胶完全凝结后,轻轻拔掉梳子。 2.以TAE为电泳缓冲液 1)称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g,倒入150ml三角烧瓶中。 2)熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1×TAE缓冲液,与琼脂糖干粉混合,配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。 3)倒胶 琼脂糖浆正在冷却时,在干净的胶槽内摆好合适的梳子,形成加样孔。 冷却至不烫手(60?C),浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。 4)拔梳 待胶完全凝结后,轻轻拔掉梳子。 2.3 点样与电泳 1)在水平电泳槽中加入电泳缓冲液。 2)将凝胶安放在电泳槽内,使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。 3)在EP管内或保鲜薄膜上混合10μLDNA样品和2μL的6×上样缓冲液。每个浓度混合2个。 4)用微量移液器将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。每个浓度点2个孔。 5)关上电泳槽盖,接好电极插头。DNA应向阳极侧移动。电压给于100V。 6)待染料到适当距离时停止电泳。 7)关上电源,拔出电极插头,打开电泳槽盖。 2.4结果观察与记录 2.4.1 泡染法(泡染法)电泳泡染色 将凝胶小心地放入聚丙烯容器中。缓慢加入足量的3×染色液浸没凝胶。 室温避光染色30min左右,最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略 有 不同。染色时间通常介于30min到1h。 胶染法(胶染法)电泳后可直接观察结果,无需再染色。 2.4.2 紫外光下观察拍照 在紫外凝胶成像仪上铺上保鲜膜。 取出凝胶,在紫外凝胶成像仪上成像拍照,输出照片,观察结果。 实验结果与分析 1电泳分析 1.1胶染法TBE为缓冲液 1.1.1 EB染色电泳图 图1.胶染法、以TBE为缓冲液、EB为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见8ng 背景荧光信号 较强 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.1.2 GelRed染色电泳图 图2.胶染法、以TBE为缓冲液、GelRed为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 浓度高时轻微扭曲 边缘是否清晰锐利 是 1.1.3 GenGreen染色电泳图 图3.胶染法、以TBE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.1.4 SYBR Green?染色电泳图 图4.胶染法、以TBE为缓冲液、SYBR Green?为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见1ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 有,轻微拖尾现象 有无扭曲 浓度高时轻微扭曲 边缘是否清晰锐利 浓度高时否 1.2胶染法以TAE为缓冲液 1.2.1 EB染色电泳图 图5.胶染法、以TAE为缓冲液、EB为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见8ng 背景荧光信号 较强 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.2.2 GelRed染色电泳图 图6.胶染法、以TAE为缓冲液、GelRed为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 浓度高时轻微扭曲 边缘是否清晰锐利 是 1.2.3 GenGreen染色电泳图 图7.胶染法、以TAE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.2.4 SYBR Green?染色电泳图 图8.胶染法、以TAE为缓冲液、SYBR Green?为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 灵敏度 最少可见3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 有,比用TBE为缓冲液时严重 有无扭曲 浓度大时轻微扭曲 边缘是否清晰锐利 浓度大时否 1.3泡染法以TBE为缓冲液 1.3.1 EB染色电泳图 图9.泡染法、以TBE为缓冲液、EB为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见5~8ng 背景荧光信号 较强 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.3.2 GelRed染色电泳图 图10.泡染法、以TBE为缓冲液、GelRed为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见1ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.3.3 GenGreen染色电泳图 图11.泡染法、以TBE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见5ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.3.4 SYBR Green?染色电泳图 图12.泡染法、以TBE为缓冲液、SYBR Green?为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见1~3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.4 泡染法以TAE为缓冲液 1.4.1 EB染色电泳图 图13.泡染法、以TAE为缓冲液、EB为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见5~8ng 背景荧光信号 较强 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.4.2 GelRed染色电泳图 图14.泡染法、以TAE为缓冲液、GelRed为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见1ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.4.3 GenGreen染色电泳图 图15.泡染法、以TAE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见5ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 1.4.4 SYBR Green?染色电泳图 图16.泡染法、以TAE为缓冲液、SYBR Green?为染料电泳图 分析: 电泳时间 20min 染色时间 60min 灵敏度 最少可见1~3ng 背景荧光信号 弱 DNA条带的整齐度 有无拖尾 无 有无扭曲 无 边缘是否清晰锐利 是 2不同染料比较分析 2.1视觉效果 通过3中新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green?与传统染料EB的染 色视觉效果对比,发现: 在背景信号方面,不管是胶染法还是泡染法,以TAE或TBE为缓冲液,用EB 为染料时,电泳后的凝胶在紫外光照射下,背景信号较高,条带不明显。而另外三 种新型染料则都体现出了背景信号低、样品信号高的优势,利于观察条带。 在条带质量方面,使用EB和GenGreen为染料跑出的条带,条带都边缘清晰、无扭曲和拖尾现象。用胶染法和泡染法的效果相当,缓冲液不同对染色效果也无明显影响; 使用GelRed为染料时,在泡染法时条带质量好。但用胶染法染色后的条带会出现轻微扭曲、边缘不平整的现象,且DNA浓度越高扭曲现象越严重(见图17、18)。缓冲液的不同对其无明显影响; 使用SYBR Green?为染料时,在胶染法时条带会出现拖尾和扭曲现象,且DNA浓度越高拖尾、扭曲越严重(见图19、20)。而泡染法则不会出现这些现象,条带清晰质量好。在缓冲液TAE中扭曲拖尾比在TBE中更为严重。 在灵敏度方面,不管何种染色方法、何种缓冲液,4中染料都能显出出8ng以上的DNA。且电泳结果显示3种新型染料的灵敏度都高于EB。在312nm紫外光照射下,GelRed与SYBR Green?的灵敏度相当,GenGreen次之,EB灵敏度最低。缓冲液的不同对灵敏度的影响不大。 综合比较背景信号、条带质量和灵敏度三个因素来考量各染料的视觉效果,得出以下结论: 使用胶染法时,GenGreen的视觉效果优于EB;使用泡染法时,GenGreen、GelRed和SYBR Green?的视觉都效果优于EB。 图17.胶染法、以TAE为缓冲液、4种染料电泳对比图 图18.胶染法、以TBE为缓冲液、4种染料电泳对比图 图19.泡染法、以TAE为缓冲液、4种染料电泳对比图 图20.泡染法、以TBE为缓冲液、4种染料电泳对比图 染料 缓冲液 染色方法 视觉效果 灵敏度(ng) 背景荧光信号 有无拖尾 有无扭曲 边缘是否清晰 EB TBE 胶染 较强 无 无 是 8 泡染 较强 无 无 是 5~8 TAE 胶染 较强 无 无 是 8 泡染 较强 无 无 是 5~8 GelRed TBE 胶染 弱 无 有 是 3 泡染 弱 无 无 是 1 TAE 胶染 弱 无 有 是 3 泡染 弱 无 无 是 1 GenGreen TBE 胶染 弱 无 无 是 3 泡染 弱 无 无 是 5 TAE 胶染 弱 无 无 是 3 泡染 弱 无 无 是 5 SYBR GreenTBE 胶染 弱 有 有 否 1 泡染 弱 无 无 是 1~3 TAE 胶染 弱 有 有 否 1~3 泡染 弱 无 无 是 1~3 表3.四种染料染色效果比较表 2.2毒性 EB:具有强毒性、强致癌性和高诱变性。 GelRed:由美国安全认定无毒,其水溶染色剂通过美国环保局安全认定,废弃 物可直接倒入下水道,而不会造成任何环境污染。独立的测试服务公司( Litron Laboratories, Inc. )进行的标准艾姆斯氏测试结果表明, 在 18.5 μ g /mL (该浓度远高于推荐用于电泳后染色的 约 4 μ g/mL 的 3X 染色液 )浓度下,仅在 S9 代谢活化时有微弱的诱变性[20]。诱变性远远低于EB。 GenGreen:独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内,艾姆斯氏试验结果表明,艾姆斯氏测试结果表明,GenGreen在凝胶染色浓度下完全没有诱变性,因此完全没有致癌毒性。[21]。 SYBR Green I:属花箐染料,能透过细胞膜进入活体细胞内,但容易生物降解,不会在体内残留,低毒。诱变性低于EB[22]。 2.3 对DNA的迁移影响 EB:对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I[23]。 GelRed:对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I[20]。 GenGreen:对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I[21]。 SYBR Green I:对核酸迁移有一定影响,会造成大片段的滞后[22]。 2.4 可重复利用率 EB:可重复利用率高,稳定不易分解,泡染的染色液可多次重复使用。 GelRed:可重复利用率低,通过实验发现,60ml的3× 染色液一般只能泡染一块胶。染第二块条带颜色暗,第三块基本看不到条带。 GenGreen:可重复利用率低,通过实验发现,60ml的3× 染色液一般只能泡染一块胶。染第二块条带颜色暗,第三块基本看不到条带。 SYBR Green I:可重复利用率低,易分解, 3× 染色液不可长期保存使用。60ml的3× 染色液一般只能泡染一块胶。染第二块条带颜色暗,第三块基本看不 到条带。 2.5稳定性 EB:稳定,可在室温下保存。 GelRed:非常稳定,可长期在室温下保存。 GenGreen:室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定,耐光性强。适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶; SYBR Green I:在常用的微碱性电泳缓冲溶液或预制凝胶中会快速降解,稳定性差[24]。因此实验时配胶和点样的速度要快。 2.6时间成本 EB:对于1kb的λDNA,电压100V时,电泳时间为20min,泡染时间为60min。 GelRed:时间同EB。条带迁移率与EB相当。 GenGreen:时间同EB。条带迁移率与EB相当。 SYBR Green I:时间同EB。条带迁移率与EB相当。 2.7价格 EB:50元/1ml GelRed:980元/500ul GenGreen:400元/500ul SYBR Green I 10000x,DMSO:450元/50ul (以上价格均查自鼎国网上价格表) 染料 毒性 对DNA的迁移影响 可重复利用率 稳定性 泡染时间 价格 EB 强 小 高 高 60min 低 GelRed 无 小 低 高 60min 中 GenGreen 低 小 低 高 60min 中 SYBR Green低 较大 低 差 60min 高 表4.四种染料综合因素比较表 3实验结果 从多个方面比较三种新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green?与传统染料EB,通过一系列实验得出以下结果: 在视觉效果方面,虽然GelRed、GenGreen、SYBR Green?的灵敏度都高于EB,但在胶染法时,用SYBR Green?预制的凝胶上的条带会出现拖带和扭曲现象,GelRed预制的凝胶上的条带会发生扭曲现象。而只有GenGreen不管用何种染色方法,都能保证条带的清晰度,不扭曲、不拖带,虽然GenGreen的灵敏度不及SYBR Green?和GelRed,但其视觉效果最好最稳定。 在毒性方面,3中新型染料的毒性和致突变性都低于EB。其中GelRed和GenGreen无毒,SYBR Green?低毒。 在对DNA的迁移影响方面,SYBR Green?对DNA的迁移影响最大,GelRed、GenGreen和EB对DNA的迁移影响都较小。 在可重复利用率方面,EB的可重复利用率高,而GelRed、GenGreen和SYBR Green?的可重复利用率都比较低。 在染料本身的稳定性方面,SYBR Green?的稳定性最差,GelRed、GenGreen的稳定性都与EB相当。 在时间成本方面,用何种染料对电泳的速率基本没有影响。 在价格方面,染料价格从低到高依次为:EB、GenGreen