壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究-

壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究-DOC格式论文,方便您的复制修改删减壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究*(作者:___________单位:___________邮编:___________)作者,吴海明,华晓阳,何登全【摘要】目的研究壳寡糖对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用以及壳寡糖对培养的巨噬细胞相关的细胞因子表达的影响。方法接种肿瘤的小鼠尾静脉注射壳寡糖,观察壳寡糖对肿瘤的生长和抑制作用。用相对定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子转录和翻译水平的影响。结果壳寡糖对S180肉瘤的抑瘤率为35.02%,P,0.001),对Lewis肺癌的转移灶的影响,实验组,2.1?1.73,,对照组,4.0?2.14,,两组比较,P,0.05。巨噬细胞加入壳寡糖作用24h后,细胞因子的表达明显增强(P,0.01)。结论壳寡糖具有良好抑制肿瘤生长和转移的作用。壳寡糖可增强巨噬细胞相关的细胞因子表达。【关键词】壳寡糖,肿瘤,巨噬细胞,细胞因子DOC格式论文,方便您的复制修改删减【Abstract】ObjectiveTostudytheinfluenceofoligochitosanininhibitinggrowthandmetastasisoftumorinrats,andinexpressionofcytokinesassociatedwithmacrophage.MethodsInhibitionofgrowthoftumorwasobservedafteroligochitosaninjectedintoratsthroughtailvein,theinfluenceintranscriptionandtranslationofcytokinesassociatedwithmacrophagewasmeasuredbyRT-PCRandELISAtechniques.ResultsInhibitionrateofsarcomaS180was35.02%,P,0.001)afterinjectionofoligochitosan.TheinfluenceinmetastasisofLewislungcancer(P,0.05),experimentgroup,2.1?1.73,,controlledgroup,4.0?2.14,.24hsafteroligochitosanaddedtomacrophage,expressionofcytokineincreasedsignificantly(P,0.01).ConclusionOligochitosancaninhibitgrowthandmetastasisoftumor,andenhanceexpressionofcytokinesassociatedwithmacrophage.【Keywords】oligochitosan,tumor,macrophage,cytokine甲壳素是自然界丰富的生物资源之一,其部分脱乙酰化产物壳聚糖,具有抗肿瘤、免疫调节、抑菌等多种生理功能。但壳聚糖不溶于水,利用纤维素酶将其降解为壳寡糖,具有较好的水溶性易被人体吸收,本实验旨在研究壳寡糖对实验性小鼠S180肿瘤和Lewis肺癌的抑制作用以及壳寡糖对体外培养的巨噬细胞相关的细胞因子基因DOC格式论文,方便您的复制修改删减表达的影响。1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法1.1材料1.1.1壳寡糖由浙大医学院分子生物学实验室制备。1.1.2动物来源小鼠由浙江大学医学院动物中心提供,体重为18,20g。1.1.3小鼠单核巨噬细胞RAW264.7由中科院上海细胞所提供。1.1.4 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 DNAmarker和ELISA实验试剂由上海贝西科技公司提供。1.2方法1.2.1壳寡糖抗肿瘤作用实验方法无菌取S180肉瘤和Lewis肺癌细胞,制成2×107细胞/ml的细胞悬液,皮下注射肿瘤液于ICR种小鼠,0.2ml/只,,次日分组进行实验,每组10只ICR种小鼠。实DOC格式论文,方便您的复制修改删减验组尾静脉注射100mg/kg的壳寡糖,对照组注射生理盐水,停药次日处死小鼠,剥离实体瘤称重或观察转移病灶数,计算抑瘤率,%,。1.2.2壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响实验方法培养小鼠采用RT-PCR法和ELISA法研究壳寡糖对巨噬细胞IL-1、TNF-a和IL-18的基因表达的影响,实验组和对照组巨噬细胞?分别提取RNA和收集上清液?RT-PCR法检测mRNA水平基因表达的变化以及ELISA法检测蛋白表达量的变化。1.3统计学方法各组值均采用均数?标准差,x?s,表示,组间采用t检验,P,0.05为统计学差异有显著性意义。2结果2.1壳寡糖抗肿瘤作用壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响,见表1,,从表中可以看出实验组的抑瘤率为35.02%,P,0.001,,环磷酰胺组的抑瘤率为50.16%,P,0.001,。壳寡糖对Lewis肺癌的影响,见表2,实验组的转移灶为,2.1?1.73,,对照组的转移灶为,4.0?2.14,,P,0.05。综合表1和表2可以看出壳寡糖对肿瘤的生长和转移具有明显的抑制作用。表1壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响DOC格式论文,方便您的复制修改删减表2壳寡糖对小鼠Lewis肺癌转移的影响2.2壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响2.2.1壳寡糖最适作用时间的确定巨噬细胞贴壁后加入壳寡糖,在4、8、16、24、48h不同时间段通过RT-PCR法检测IL-1β、INF-α、IL-18的基因转录水平,结果显示24h达到高峰,故确定以24h为壳寡糖最适作用时间。2.2.2壳寡糖最适作用浓度的确定小鼠巨噬细胞经培养贴壁后,按浓度10、20、30、40、60、80μg/ml的剂量加入壳寡糖继续培养,各组巨噬细胞样本经RT-PCR法结果见表3、4、5。表3不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-1β基因转录水平的影响注,以β-actin为内参照标准,各组均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.05(n=4)表4不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-18基因转录水平的影响注,以β-actin为内参照标准,各组均值以均数?标准差表示,?表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.05,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.01(n=4)DOC格式论文,方便您的复制修改删减表5不同浓度壳寡糖对巨噬细胞TNF-α基因转录水平的影响注,以β-actin为内参照标准,各组均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.05(n=4)结果显示10μg/ml的壳寡糖实验组与对照组比较无显著性差异,20、30及40μg/ml组均差异有显著性,故确定20μg/ml的壳寡糖为对IL-1β和TNF-α的最适作用浓度,以40μg/ml的壳寡糖作为对IL-18的最适作用浓度。2.2.320μg/ml的壳寡糖对IL-1β和TNF-α的转录和翻译水平的影响用含20μg/ml壳寡糖刺激培养的巨噬细胞,用RT-PCR法检测壳寡糖对IL-1β和TNF-α转录的水平的影响,用EISA法检测壳寡糖对IL-1β和TNF-α分泌的影响,见表6、7、8、9,。2.2.440μg/ml壳寡糖对IL-18基因转录水平和翻译水平的影响用含40μg/ml壳寡糖的细胞培养液培养巨噬细胞,RT-PCR检测对IL-18基因转录水平的影响ELISA法检测对IL-18细胞因子分泌的影响,见表10、11,。表620μg/ml壳寡糖对IL-1β基因转录水平的影响注,以β-actin为内参照标准,均值以均数?标准差表示,*表示经tDOC格式论文,方便您的复制修改删减检验与对照组差异有显著性,P,0.01表720μg/ml壳寡糖对巨噬细胞释放IL-1β的影响注,均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.01表820μg/ml壳寡糖对TNF-α基因转录水平的影响注,以β-actin为内参照标准,均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.01表920μg/ml壳寡糖对巨噬细胞释放TNF-α的影响注,均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.01表1040μg/ml壳寡糖对IL-18基因转录水平的影响注,以β-actin为内参照标准,各组均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.01表1140μg/ml壳寡糖作用下IL-18ELISA检测结果注,各组均值以均数?标准差表示,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P,0.01结合RT-PCR和ELISA实验结果,可以看出壳寡糖能促进巨噬细DOC格式论文,方便您的复制修改删减胞细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18基因表达,促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18。3讨论国内外研究发现壳寡糖具有多种优异的生理功能,能提高机体的抗肿瘤能力和免疫功能,1,3,。实验结果表明,以壳六糖为主的壳寡糖具有良好的抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤转移的作用。壳寡糖对S180肉瘤的抑制作用较环磷酰胺略弱,但两者与对照组比较差异均有非常显著性,P,0.001)。壳寡糖对Lewis肺癌转移的抑制作用较干扰素略强,转移灶数分别为壳寡糖组,2.1?1.73,和干扰素组,2.8?1.39,,两组与对照组比较差异均有显著性,P,0.05)。现代肿瘤免疫学研究发现巨噬细胞、T淋巴细胞和NK细胞在抗肿瘤的免疫效应中发挥着主要作用。巨噬细胞在免疫系统中具有十分重要的地位,它属于专职的抗原提呈细胞,APC,,同时又是免疫效应细胞,它通过吞噬提呈抗原、激活T淋巴细胞,并分泌和产生多种细胞因子、活性氧及一氧化氮,NO,等,诱导肿瘤细胞凋亡及抑制蛋白质合成等作用,是机体免疫应答和免疫调节的重要环节,4,。实验结果显示壳寡糖能促进巨噬细胞细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18基因的表达,促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18。而这些细胞因子又可以反馈激活巨噬细胞和NK细胞,形成网络状的反DOC格式论文,方便您的复制修改删减馈调节关系,从而极大地增强机体的免疫功能和抗肿瘤能力。壳聚糖是自然界中第二大生物资源,其降解产物壳寡糖具有无毒、无免疫源性、良好的组织相容性和易溶于水、生物活性高等特点,5,,可开发成为一种新型的抗肿瘤药物和免疫调节剂。【参考文献】1张虎,杜昱光,虞星炬.几丁寡糖与壳寡糖的制备和功能.中国生化药物杂志,1999,20(2),99.2杜昱光,白雪芳,金宗濂,等.壳寡糖抑制肿瘤作用的研究.中国海洋药物,2002,21(2),18-21.3OuchiT,BanbaT,MatsumotoT,etal.Synthesisandantitumoractiv-ityofconjugatesof5-fluorouracilandchito-oligosaccharidesinvolvingahexamethylenespacergroupandcarbamoylbonds.DrugDesDeliv,1990,6(4),281-287.4竺国芳,赵鲁杭.几丁寡糖和可寡糖的研究进展.中国海洋药物,2000,19(1),43-46.5KimSK,ParkPJ,YangHP,etal.Subacutetoxicityofchitosanoligo-saccharideinSprague-Dawleyrats.Arzneimittelforsch,2001,51(9),769-774.