种鸡蛋传性疾病——鸡白痢、禽霉形体病的新型dna药物研究

种鸡蛋传性疾病——鸡白痢、禽霉形体病的新型dna药物研究 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 种鸡蛋传性疾病——鸡白痢、禽霉形体病的 新型DNA药物研究 郝钦龙 伍迪 肖怡 陈丹 (华南农业大学 动物科学学院， 广东 广州 510642) 摘要:胚蛋传染性疾病是由母体直接传递的胚胎感染性疾病。种禽患有某种传染性疾病或长 期带菌时，会导致胚胎发生各种病理变化，甚至引起死亡。实验通过设计构建经过分子重构 与改良的蜂毒肽类似物和鸡β-防御素多基因输卵管特异高效表达载体，经肌肉注射途径导入 鸡体内。经过重组质粒在输卵管细胞高效特异表达，使鸡体获得对沙氏菌和支原体等蛋媒疾 病的有高效抗菌性的蜂毒肽类似物和鸡β-防御素蛋白，有效抑杀存在于种鸡卵巢和输卵管的 病原微生物。本实验旨在发展和完善一种新型高效的预防鸡沙门氏菌感染的DNA药物。 关键词:胚蛋传染性疾病 蜂毒肽 鸡β-防御素 沙门氏菌 蛋媒疾病 Kind of egg transmission of diseases - salmonellosis, avian mycoplasma disease of the new DNA drugs long WU Di Xiao Yi Chen Dan HAO Qin- (college of animal science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642, China ) Abstract: Embryos infectious diseases are the direct transfer of embryos from the maternal infections. Avian infectious diseases or suffering from some kind of long-term carrier would result in a variety of pathological changes in embryogenesis, and even cause death. Experimental Design and Construction by Molecular remodeling and improvement after the melittin analogs and chicken β-defensin genes more highly expressed vector, attenuated intracellular bacteria in the delivery of imported chicken. After the recombinant plasmid expressed specifically in the oviduct cells efficiently, so that physical access to the salmonella chicken and the egg-borne diseases such as mycoplasma have high antibacterial activity of bee venom peptide analogs and chicken β-defensin protein, effective suppression exists in the chicken kill ovaries and fallopian tubes of pathogenic microorganisms. This study was designed to develop and perfect a new and efficient prevention of Salmonella infection in chicken DNA drugs Key words: Embryos infectious diseases melittin chicken β-defensin Salmonella egg-borne diseases 鸡通过蛋传的疾病(蛋传病)是从感染母鸡传给新孵出后代的疾病。蛋传疾病主要有两种 传播途径:一是病原体在蛋壳和壳膜形成前感染卵巢滤泡，于蛋形成过程中进入蛋内，如沙 门氏杆菌等;二是鸡蛋在产出时或产下后因环境卫生差，病原体污染蛋壳，例如肠道菌，特 别是沙门氏菌、大肠杆菌，时而有绿脓杆菌、葡萄球菌及霉菌污染蛋壳等等，并通过蛋壳的 气孔进入蛋内。霉形体感染也可通过蛋传途径。由此，被传染的种蛋在孵化过程中可能造成 1 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 死胚或臭蛋，孵出的雏鸡多数为弱雏或带菌雏，在不良环境等应激因素的影响下发病或死亡[1,2]。 沙门氏菌属按其生化特性分为?、?、?、?和?五个亚属，共有2020种血清型。我国发现的血清型有216个。沙门氏菌的中毒作用主要是菌体内毒素的作用。许多血清型沙门氏菌都能产生内毒素，内毒素为一种多糖-类脂-蛋白质化合物。动物摄入大量活菌，病菌在肠道内繁殖，并经肠系膜淋巴系统进入血循环，形成一过性菌血症，肠道内大量的细菌及菌体崩解后释放出来的内毒素，对肠道粘膜、肠壁及肠壁神经、血管有强烈的刺激作用，造成肠 [3,4]道粘膜肿胀、渗出、粘膜脱落，因而中毒症状表现出呕吐、腹痛及不同性质的腹泻。内毒素由肠壁进入肠内，对肠管局部有致敏作用，引起局部炎症或加重局部炎症。家禽沙门氏菌感染有两类:一类为不运动的两种沙门氏菌—鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)和鸡伤寒沙门氏菌(S.gallinarum)感染，分别称鸡白痢(Pullorum disease，PD)和禽伤寒(Fowltyphoid，FT)。另一类为大量可运动血清型沙门氏菌感染，统称禽副伤寒(Paratyphoid，PT)。 鸡白痢由鸡白痢沙门氏菌感染引起，是雏鸡的急性全身性疾病，主要经卵传递，消化道、呼吸道亦可感染，在,,,周龄的雏鸡发病率和死亡率最高;禽伤寒由鸡伤寒沙门氏菌感染引起，是一种急性或慢性败血性疾病，各种日龄的鸡均可发病，以产蛋母鸡最易感染。这两种疾病有一定的差异，但病史、临床症状、流行病学、病理变化、控制及消灭 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 等方面有相似之处。鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌具有高度的宿主适应性。其血清型基本相同，都含有O抗原1、9、12。前者有O12抗原的变异，后者没有。禽副伤寒的血清型总数超过2400多个，但只有大约10%的已从家禽中分离出来。禽副伤寒除了那些受应激高度敏感的雏禽外， [5,6]很少引起家禽急性全身性疾病。鸡的副伤寒沙门氏菌感染，往往以无症状的消化道定植为特征。该病主要经卵传递，消化道、呼吸道和损伤的皮肤或粘膜亦可感染。许多沙门氏菌(如鸡白痢、禽伤寒、肠炎沙门氏菌等)感染家禽后，既可垂直传播也可水平传播。有些血清型，如肠炎沙门氏菌，还存在于清洁完整的蛋内，如前处理不当，可导致它们增殖达到引起消费者严重胃肠道疾病的水平，从而引起食物中毒。 由于种鸡沙门氏菌病的蔓延，结果导致商品代雏鸡在孵化过程中被污染，出壳的雏鸡在育雏的最初几日发生急性全身性感染而导致大批死亡，残存的部分鸡也变为隐性带菌鸡，造成生长缓慢、长期下痢、死淘率升高，需长期投药维持鸡群健康，开产后产蛋率低，且达不到产蛋高峰。同时，由于种鸡养殖企业普遍采用定期投喂有效抗菌药物的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 控制沙门氏菌病发生，致使沙门氏菌耐药性迅速增加，一旦商品代鸡群发生沙门氏菌病，可供选择的有效药物数量已经很少。近年来，商品代养殖企业普遍存在“鸡难养，有效的鸡药难寻，鸡病难治”令养殖企业头痛的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，且愈演愈烈，形成恶性循环，导致商品代鸡养殖企业经济效益 [4,7]差，甚至亏损。 在种鸡的生产中，定期检疫需耗费企业大量人力、物力、财力，增加生产成本，淘汰阳性带菌鸡又会造成一定的经济损失。因此，多数种鸡养殖企业采用定期投喂大剂量抗菌药物来暂时性预防鸡沙门氏菌病的发生。沙门氏菌在种鸡群散播，并经蛋传播给商品代鸡群，将[4]直接祸及商品代鸡群的健康及其产品的卫生安全。动物和人类的沙门氏菌感染和食品中毒又常来源于患沙门氏菌病的禽类、禽蛋或其他产品，因此，加强对禽类沙门氏菌病的防治，无论在养禽业或是公共卫生上都有重要意义。 由上可见，随着养鸡产业的飞速发展，鸡沙门氏菌病已成为养鸡行业危害最为严重的蛋媒细菌病，同时，对人类食品卫生的安全形成了潜在的威胁，必须予以高度重视。 蜂毒肽是目前人类已知最强的抗菌消炎活性物质之一，它能结合到天然的或人工合成的细胞膜上，裂解各种类型的细胞和脂质体。蜂毒肽强烈抑制20余种革兰氏阳性及阴性病原微生物的生长，抗炎活性是氢化可的松的100多倍;蜂毒肽同时具有类似激素的作用，但无激素的不良反应;蜂毒肽的镇痛强度是吗啡的40% ,且持续时间长，但无水杨酸类药物对消化道的2 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 刺激和甾体类药物的免疫抑制作用;蜂毒肽对前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚镁辛的70倍; [8-9]同时还具有治疗关节炎、抗肿瘤和心血管疾病、抗电离辐射以及免疫调节的功能;通过抑制HIV-I LTR的调节作用而抑制细胞内Gag抗原结构蛋白和mRNA合成，抑制病毒复制，ID值在0.9,1.5 μmol/L之间;能改变受HIV感染的T淋巴细胞功能，抑制HIV复制，抵抗病毒的感染力，并能以计量依赖方式减少持续感染人类免疫缺陷病毒I的T淋巴瘤细胞HIV-I的[10-11] 量;对肿瘤细胞如淋巴瘤和肉瘤等具有强烈的细胞毒素作用。蜂毒肽能作用于多种细胞 2+内蛋白及酶类而影响细胞代谢功能。例如与细胞内钙调蛋白有很高的亲合力，影响Ca转导; 2+通过提高肌浆Ca水平而诱导骨骼肌收缩等等。农业上蜂毒肽主要应用于家畜家禽的疾病防治和植物保护，抵御多种病原微生物侵染，抗细菌和真菌，毒杀害虫。如对果蝇属幼虫的DL50为129μg/g、烟草天蛾为15μg/g，对美洲棉铃虫和亚洲玉米螟等也有强毒杀作用，及强烈[8]抑制烟草花叶病毒(TMV)复制。 蜂毒肽分子较小,比起其它一些毒素蛋白如蓖麻毒蛋白、白喉毒蛋白等较大分子毒蛋白来说，免疫原性很低,且不易产生过敏反应。由于蜂毒肽的药用功能很强，是一种不可多得的天然生物活性物质，引起了许多学者的关注，已成为一种研究抗微生物多肽类物质结构与功能 [11]的模式肽。 申请者先前已经从粗蜂毒样品中分离纯化了蜂毒肽，并对其物理化学性质、最低溶血浓 [12-14]度、最低抑菌浓度、抑菌效价等做了较系统的研究。同时，通过采用计算软件“HyperChem 7.0”，对蜂毒溶血肽类似物定量构效关系(QSAR)计算分析，结果显示，蜂毒肽溶血活性与生成热、键合能、表面积、分子体积、极化能、醇水分配系数、水合能相关。遵循先前我们 [12]已建立的蜂毒肽模型预测，为获得溶血活性相对最低，保留或提高抑菌活性的蜂毒肽分子，有目的进行了蜂毒肽类似物的分子设计;并对蜂毒肽原基因进行了突变，在表达蜂毒肽原基因基础上，通过多种PCR技术，获得了十几条蜂毒肽类似物的突变基因，克隆到原核和真核表达载体上，获得了十多个重组的蜂毒肽类似物表达质粒。重组表达载体转化后，经诱导， [ 13,14 ]其表达产物溶血活性比天然多肽降低约14~25倍之多，并保留了原有的强抑菌活性。 本课题研究旨在发展和完善一种新型高效的预防鸡沙门氏菌感染的DNA药物。在以往研究发现蜂毒肽类似物对鸡沙门氏菌有强的抑菌效果的基础上，设计构建蜂毒肽类似物基因的重组表达载体，通过减毒胞内菌的运送，将重组质粒导入鸡体内，使重组质粒在输卵管细胞高特异表达;以及采用人工注射输卵管的方式，将构建的蜂毒肽类似物基因的重组表达载体直接导入靶组织细胞特异表达，不影响其他组织。使鸡体获得对沙门氏菌的抗性;研究重组质粒的体内表达产物与体外表达的免疫原性。 蜂毒素具有广谱杀菌作用，能抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性病原微生物的发育，尤其对耐药菌株有明显抑杀作用;抗真菌活性;抗螺旋体、支原体和衣原体活性(L. Béven,1997; V.N. Lazarev,2002);抗原虫活性(Diaz-Achirica,1998);抗肿瘤活性，对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤能力(张展，2003;凌昌全,2004;Arora, AS,1996;Shamsher S,1999);抗病毒活性，如艾滋病病毒、疱疹病毒都起作用(Michael Wachinger,1992;A. Baghian,1997; Wachinger, M,1998);在预防和治疗辐射方面都具有一定的功效，可使受辐射动物的生存率提高20%~60%(孙丽萍,2002)。 抗菌肽受到人们的关注，是由于抗生素耐药性问题越来越严重，而抗菌肽与传统抗生素有很大的不同，它们的区别包括:(1)产生机制不同:传统抗生素主要是细菌的发酵产物，由酶促反应合成，而抗菌肽是由宿主基因编码在核糖体上合成的产物。(2)杀菌机制不同:传统抗生素大多数是通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥作用，而抗菌肽主要通过与带负电的微生物细胞膜直接作用，改变其通透性，造成膜的物理性损伤，导致细胞内容物外渗而死亡。(3)作用方式不同:传统抗生素作用涉及到与细菌细胞膜或胞内特异的受体结合且受体类型有限，细菌容易通过变异而产生耐药性，抗菌肽的作用不涉及特定的受体，完全是阴阳离 3 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 子的物理作用，它可以很快杀灭微生物而不产生抗性。(陈胜锋,2006) 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌种、细胞株及载体 ?T vector为TAKARA公司产品，pCR2.1 vector、哺乳动物真核表达载体pVAX1为pMD18- Initrogen公司产品。基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 菌株E.coli DH5α由本室保存。VERO细胞株由动物科学学院家禽实验室保存、CHO细胞株由广东省农科院兽医所猪病室保存。大肠杆菌KD为本室保存，1231鸡白痢沙门氏菌购自中国兽医药监察所。 2.1.2实验动物、饲料 150日龄处于开产期的母麻鸡及饲料购于华南农业大学鸡场 2.1.3 主要仪器 电泳仪:DYY-5型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂;EC570-90蛋白质电泳仪，美国Therom Forma公司; PCR扩增仪:PTC100，美国;PCR Express Gradient PCR仪，HYBAID公司产品; 电泳槽:DYZ-24D型垂直电泳槽，北京市六一仪器厂;DG-3A微型水平电泳槽，北京鼎国生物技术发展中心; 超低温冰箱:超低温冰箱，Haier公司;Thermo 702REL2型超低温冰箱，美国Forma公司; 150型生化培养箱，上海一恒恒温培养箱:LRH-250A生化培养箱，广东省医疗仪器厂;LRH- 科学仪器有限公司; 离心机:5804R型低温高速离心机，德国Eppendorf;5810R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf;5415D型高速离心机，德国Eppendorf; pH计:METTLER TOLEDO 320 PH Meter，梅特勒-托利多仪器 (上海有限公司); PB-10赛多利斯科学仪器(北京)有限公司; METTLER TOLEDO AB204-E分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海有限公司); 超净工作台，苏州净化设备厂; H.S.G?C-4电热恒温水浴锅，临海市东方仪器厂; Tanon-2500数码凝胶图像处理系统; 可见分光光度计:WFJ 7200型可见分光光度计，尤尼柯(上海仪器有限公司); 恒温振荡器:THZ-C、THZ-D台式恒温振荡器，江苏太仓试验设备厂;Orbital shaker，美国Therom Forma公司; CO2培养箱， NUAIRE 公司; Olympus CK30 型倒置显微镜; DMI6000B普通荧光显微镜，Leica公司; 普通水平离心机，Beckman 公司; 细胞培养板购自 ORANGE 公司玩 2.1.4 主要试剂 2.1.4.1 培养基 LB培养基:每升 10g蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl 高压灭菌。 固体LB，另加入1.5%的琼脂粉 细胞培养液:DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)、F12 Nutrient Mixtures(Ham)培养基干粉均购于广州英韦创津公司，胎牛血清、胰酶均购自 GIBCOBRL 公司 4 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 F12培养基:每升F12干粉 1.176gNaHCO，PH调节至 6.8~7.0，过滤除菌。 3 DMEM培养基:每升DMEM干粉 2.000gNaHCO ，PH调节至 6.8~7.0，过滤除菌。 3 完全培养液为含 10%胎牛血清的基础培养液。 2.1.4.2 其他试剂及试剂盒 基因工程分子操作用酶:EcoR?、Nhe?、Mlu?、Xho?、Taq酶、T4 DNA连接酶、DNase One Step RT-PCR Kit Ver.2购自Takara公司;Blend Taq?和反转录试剂盒PrimeScript? 酶和T4 DNA连接酶购自TOYOBO公司;EcoR?、Nhe?、Mlu?、Xho?购自Promega公司;TRIzol Reagent RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。 转染试剂:invitrogen公司的Lipofectamine TM 2000;国奥生物公司的LipoFu2008。 小鼠单克隆抗体(Anti-His antibody)购自英国AbD公司，Goat Anti-Mouse-FITC购自美津生物公司，anti-mouse-594生产商为中杉金桥。 Corticosterone、17β-Estradiol购自CalBioChem，德国EMD Biosciences of Merk KGaA。胰岛素购自北京普博欣生物科技有限公司。 质粒小量、大量抽提试剂盒、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自TIANGEN公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自TIANGEN公司、TAKARA公司和莱德尔公司(Omega琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。 PCR引物由北京奥科生物有限公司合成。 2.1.4.3免疫荧光相关试剂 0.01mol/L PBS缓冲液:NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L， 调pH7.4 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB):柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g，加水定容至1000ml， 调 pH6.0 组织细胞打孔液:0.01mol/L CB 99.5mL加入曲拉通X-100 0.5mL 封闭工作液:正常山羊5mL或者BSA 5g，溶于0.01mol/L PBS，定容至100mL，若是用BSA， 定容后过滤 过氧化氢封闭液:市售的过氧化氢浓度为30% 10mL，用0.01mol/L PBS定容至100ml 注 意:此液现用现配 抗体稀释液:一抗稀释液，BSA 2g,用0.01mol/L PBS定容至100mL，过滤;免疫荧光染色二抗 稀释液，购于碧云天生物技术研究所 封裱剂:抗荧光萃灭封片液购于碧云天生物技术研究所 4%多聚甲醛:4g 多聚甲醛定溶于 0.01mol/L PBS 100ml中，50?加热搅拌，逐渐滴加1mol/L 氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解，3号定性滤纸过滤除沉淀备用。 2.1.4.4 Tricine-SDS-PAGE 相关试剂 贮液A(49.5%T，6%C): 称取46.5g丙烯酰胺，3g N,N’-亚甲叉双丙烯酰胺，加水定容至100mL， 10?保存。 贮液B(49.5%T，3%C): 称取46.5g丙烯酰胺，1.5g N,N’-亚甲叉双丙烯酰胺，加水定容至 100mL，10?保存。 3×凝胶缓冲液: 3 mol/L Tris，0.3%SDS，HCL调节pH=8.45 10×阳极缓冲液: 1 mol/L Tris，HCL调节pH=8.9 10×阴极缓冲液: 1 mol/L Tris，1 mol/L Tricine，1%SDS，pH=8.25 固定液: 50%甲醇，10%冰醋酸，100mol/L醋酸铵 染色液: 50%甲醇，0.25%考马斯亮蓝G-250，10%冰醋酸. 脱色液: 10%冰醋酸，10%乙醇 5 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 2.2.1 抗菌肽基因的设计 2.2.1.1改造的Melittin基因序列的设计 1 蜂毒素基因的改造 原始氨基酸序列:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 改造后氨基酸序列: MGIG AVL RGL TTG PA LIS WIK RKR QQHHHHHH—(启动子与终止子之间序列) 在已有的研究基础上，对原序列进行了一些改动，缩短肽链长度，加强正电荷，降低螺旋度，加大疏水力矩，以期达到增大蜂毒素抑菌活性同时降低溶血活性的目的。本次实验的改造 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及目的如下: ? Lys-7改为Arg(加强正电荷，且Arg为螺旋的不敏感者) 错误～未找到引用源。 Val-8均改为Gly (打破螺旋，加大疏水力矩) 错误～未找到引用源。 Del Leu-13:从热力学的角度分析，肽链越长，折叠所需时间越长，也不利于与膜的结合，Leu-13与螺旋的折叠无关，删除13位可显著降低溶血 综合以上三点，经软件分析及前人验证，螺旋度下降，正电荷增强，保留了两亲性，加大了疏水力矩。 2 蜂毒素基因与引物设计 根据上述改造方案，共设计4条序列，根据改造后的氨基酸序列和鸡偏爱密码子推断出DNA序列，在其N端加入Kozak翻译起始序列和起始密码子ATG，从而能进行正确的翻译;在3,端加上6个组氨酸，以便于后续实验的纯化及检测;DNA序列的5,端和3,端加上相应的特异性限制内切酶位点，并在两端各加上3个保护碱基，然后利用PRIMER 5.0 引物设计软件设计出相应的搭桥引物。 蜂毒素原始氨基酸序列:G I G A V L K V L T T G L P A L I S W I K R K R Q Q 蜂毒素原始核苷酸序列: GGTATCGGTGCTGTTTTGAAGGTTTTGACTACTGGTTTGCCAGCTTTGATCTCCTGGATTAAGAGAAAGAGACAACAA 改造后序列: ATT GCTAGC AGATCT CGCCACC ATG GGA ATT GGA GCT GTG CTG CGC GGA CTG ACA ACA GGA CCA GCT CTG ATT TCT TGG ATT AAA CGC AAA CGC CAA CAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TAA TAA GAATTC AAT 引物设计如下: 1 M-?-8: 5′ ATT GCTAGC AGATCT CGCCACC ATG GGA ATT GGA GCT GTG C 3' 2 M-?-2: 5' TCAGAGCTGGTCCTGTTGTCAGTCCGCGCAGCACAGCTCCAATTC 3' 3 M-?-3: 5' AGGACCAGCTCTGATTTCTTGGATTAAACGCAAACGCCAACAGCA 3' 4 M-?-7: 5′ ATTGAATTCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTTGGCGTTT 3′ 引物由上海英骏生物公司、奥科生物公司合成。 2.2.2.1 Melittin的PCR合成 (1)将Melittin及Gel9合成引物用ddH2O溶解成终浓度为100μmol/L的储液，然后取20μL储液加入80μLddH2O，稀释成20μmol/L工作液。按以下程序进行PCR反应:(合成Melittin的引物:M-?-8、2、3、9) Primers(20μmol/ L) 各1μL dNTPs(10mmol/L) 1μL 2， 10×Buffer(Mg+) 5μL rTaq DNA Polymerase(2.5U/μL) 1μL 6 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 ddH2O up to 50μL PCR循环参数:94? 2min，(94?30s 52?30s 72?40s)×30cycles，72? 5min。PCR反应结束后，取反应液2μL进行1.5,琼脂糖凝胶电泳观察鉴定。 2.2.2.2 Melittin的扩增 用上一次PCR反应的产物为模板，用M-?-8和M-?-9为引物进行第二次PCR扩增，方法如下: Primers(20μmol/L) 各2μL Template 1μL rTaq DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL 10×PCR buffer 5μL dNTP mix 2μL ddH2O up to 50μL PCR循环参数:94? 2min，(94?30s 52?30s 72?40s)×30cycles，72? 5min。 PCR反应结束后，同样取反应液2μL进行1.5,琼脂糖凝胶电泳观察鉴定。 2.2.2.3 PCR产物的回收 上述两种PCR反应产物分别全部点样到1.2,琼脂糖凝胶电泳点样孔中进行电泳。按凝胶回收试剂盒说明，具体操作见试剂盒说明书，进行PCR产物回收。 2.2.3 真核表达重组载体的构建 2.2.3.1 pVAX1质粒的制备 取已带有pVAX1的DH5α菌种，接种4mL LB培养基(含50μg/mL Kan)，37?，220r/min振荡培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒。操作方法见说明书。 2.2.3.2 pVAX1及MLT基因的酶切与回收 pVAX1空质粒的酶切反应体系如下: pVAX1 20μL 10× buffer 5μL Nhe I 1μL E.coR I 1μL ddH2O up to 50μL 扩增的PCR产物MLT的酶切消化反应体系如下: PCR产物 25μL 10× buffer 5μL Nhe I 1μL E.coR I 1μL ddH2O up to 50μL 以上酶切体系，混匀，37?下反应4hr，然后加入10×loading buffer终止反应。酶切后的反应液全部用1.5,琼脂糖电泳，在紫外灯下切下目的片断的条带，并用胶回收试剂盒回收酶切后的目的DNA片断(具体操作见试剂盒说明书)。 2.2.3.3 pVAX1与MLT基因的连接反应 取PCR管，按以下步骤操作: 酶切回收MLT 7μL 酶切回收pVAX1 1μL TDNA Ligase buffer 1μL 4 TDNA ligase 1μL 4 总体积 10μL 7 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 按以上配制连接反应体系，混匀，置4?连接过夜。 2.2.3.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 按以下方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞: (1) E.coli DH5α菌种(15,甘油保存，‐70?)固体LB上划线过夜培养; (2) 挑取过夜培养的LB平板上的单菌落于5mL LB液体培养基中，过夜培养; (3) 取过夜培养的菌液100μL，加入到50mL LB液体培养基中(置于250mL三角瓶)， 于37?下 220rpm 培养约4h左右，至OD,0.5,0.7(此时为对数生长前中期，600 细胞最有活力); (以下步骤均在超净台中操作) (4) 将达到对数生长期的菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min使菌液冷至0?; (5) 4?，4000rpm离心10min，收集菌体，弃上清，倒置在吸水纸上1min; (6) 加入10mL预冷的0.1mol/L CaCl，小心在冰上摇动，悬浮菌体, 冰浴25min; 2 (7) 4?，4000rpm离心10min，弃上清; (8) 加入1mL预冷的含30%甘油的0.1mol/L CaCl，小心悬浮，分装为每管50μL，即可2 用于转化或保存于-80?。 2.2.3.5 连接产物的转化 按以下步骤进行转化操作: (1) 将连接产物加入到50μLE.coli DH5α感受态细胞中，混合均匀; (2) 冰浴30min; ?水浴90s; (3) 42 (4) 冰浴2,3min; (5) 加入800μL LB液体LB培养基并用吸头混合均匀。37?，150rpm，培养45min; (6) 分别取100、200μL涂于低盐固体LB平板(含50μg/mL Kan); (7) 待平板上菌液吸收后，倒置于37?下培养过夜。 2.2.3.6 转化子的鉴定 按照下表配置PCR反应液:(检测引物为:T7启动子通用引物和M-?-9)。 Primers (20μmol/ L) 各0.5μL μL dNTPs(10mmol/L) 0.5 2， 10×Buffer(Mg+) 1.5μL Taq DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.25μL ddHO up to 15μL 2 随机选取转化后长出的单菌落接种于液体LB培养基，37?培养约8h，用小枪头蘸取微量菌液，在PCR反应液中沾一下，作好相应的编号。PCR反应程序:94? 2min，(94?30s 55?30s 72?30s)×30 cycles，72? 10min。PCR反应结束后，取反应液4μL进行1.5,琼脂糖凝胶电泳观察鉴定。 挑取菌落PCR鉴定结果阳性菌的剩余菌液，抽取质粒，并用Nhe I 和E.coR I酶切4小时后，取反应液4μL进行1.5,琼脂糖凝胶电泳观察鉴定。阳性菌委托奥科生物公司测序。 终得到重组载体pVAX1- MLT(Melittin)。 2.2.4 重组真核质粒的大量抽提 参照TIANGEN无内毒素质粒大量抽提试剂盒进行。方法如下: 将带有目的质粒的E.coli接种于装有100ml LB/kan(50ug/ml)培养基的1升培养瓶中，37?摇床过夜培养12-16 hr，以扩增质粒。为了得到最好的结果，可以使用约1ml过夜培养物作为接种物。 (1) 向吸附柱加入2.5ml的平衡溶液，10000离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附8 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 柱重新放回收集管中。 (2) 取100ml菌液于一合适的250ml离心管中，室温下10000rpm离心3min，以沉淀菌 种;倒出或吸出培养基并弃去; (3) 尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。 (4) 往沉淀中加入7ml溶液P1(加入了RNaseA)，漩涡振荡或用移液枪吹打使细胞完全 重新悬浮; (5) 重悬液中加入7ml溶液P2， 轻轻翻转混和液6-8次以获得澄清裂解液，将裂解液 于室温下静置5min; (6) 向离心管中加入7ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分均匀，此时会出现 白色絮状沉淀。室温放置10min左右。10000rpm离心5-10min; (7) 准备一个澄清裂解液过滤器， 拉出针筒中的活塞，将针筒竖直放在一个合适的试管 架上，在注射器下端出口处放置一个新的50ml试管，针筒开口朝上，将裂解液加入 澄清裂解液过滤器的针筒中;细胞裂解液在针筒中停留5分钟，白色絮状物应该漂 浮于裂解液表面;用新的50ml试管收集细胞裂解液;插入注射器活塞至针筒中，小 心的推动活塞以使裂解液流入收集试管中; (8) 向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱中，吸附柱 放入50ml收集管中; (9) 室温10000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管(滤液 太多，分多次离心); (10)向吸附柱中加入10ml漂洗液，10000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱重新放回 收集管中; (11)重复操作步骤10; (12)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温10000rpm离心2min，倒掉废液; (13)将吸附柱重新放回收集管中，10000rm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液 去除; (14)将吸附柱置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱 缓冲液，室温放置5min，然后室温10000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液 全部移入一个干净的1.5ml离心管。(可以用pH8.0的蒸馏水代替洗脱缓冲液，滴加 前水预热65-70?) 取适当稀释样品(100倍)，测量其在260nm和280nm下处的吸光值。质粒浓度可按下列公式算出: [DNA浓度] = A260×50×(稀释倍数)μg/ml 纯化的质粒DNA A260与A280的比通常在1.8,2.0左右，可直接用于细胞转染甚至动物体内实验。 2.2.5 重组载体转染CHO细胞 2.2.5.1 细胞的复苏、培养及传代 从液氮罐中取出装有CHO细胞的冻存管，直接投入37?温水中，并不时摇动令其尽快融化。从37?水浴中取出冻存管，低速离心，用酒精消毒后，吸去冻存液，用含10%血清的完全培养液洗细胞一次后，注入新完全培养液，重悬细胞，适当稀释后，接种培养瓶，置于37?CO培养箱中，培养。次日更换一次培养液，继续培养。 22+2+待细胞生长到一定密度时，先用预冷的无Ca、MgPBS洗细胞两次，加入0.25%胰酶消化液，室温放置数秒至数分钟。待细胞开始变圆，加入完全培养基，终止消化，吹起并使细胞单个均匀悬浮，按1:2~10的比例分瓶，继续培养。 2.2.5.2 转染前细胞的准备 9 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 5待CHO细胞达到最佳生长状态时，分别接种0.5-2×10/孔数量的细胞到6孔板中，细胞达到90~95%汇合度时，即可进行转染。转染前数小时可更换不含抗生素、血清的培养液。 2.2.5.3 脂质体介导的重组质粒转染细胞 TM重组质粒pVAX1-MLT转染CHO细胞，具体操作如下(按Lipofectamine2000说明书进行): (1) 每孔用无血清培养基洗细胞两次，加入1ml新鲜的无血清培养基; (2) 准备溶液A: 250ul的无血清培养基加入4ug 去内毒素的重组质粒;溶液B:250ul 的无血清培养基加入10ul的转染试剂，室温孵育5min; (3) 轻轻混合A、B液，室温孵育20分钟; (4) 不移除培养基，每孔逐滴加入500ul的脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边， 边加边振摇培养板); -7(5) 37?孵育6h，更换为完全培养基继续培养，同时加入雌二醇10mol/L、皮质酮 -610mol/L和胰岛素40μg/L。 (6) 24、48后，置于倒置显微镜下观察，并收集细胞上清，-80?保存。 2.2.5.4 带抗菌肽基因的重组质粒转染细胞的RT-PCR检测 RT-PCR检测主要包括两部分: 细胞总RNA的提取和RT-PCR鉴定。 (1) 总RNA的提取: 按TRIzol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书，提取转染细胞中的总RNA。具体操作方法如下: 细胞转染48hr后，吸去六孔板中的细胞培养液，加1mL/孔TRIzol于六孔板中，用枪头吹下细胞，将溶液移入RNase Free的1.5mL离心管中，反复摇匀至细胞碎片完全裂解、液体完全澄清为止;室温放5 min，使样品充分裂解。加入200 μL氯仿，振荡混匀，室温放置5min;4?下12000rpm离心15min，液体被分为三层;吸取含总RNA的上层水相于新的离心管中，加500μL异丙醇，充分混匀，室温放置10min后4?下12000rpm离心10min，在管底可见凝胶状RNA沉淀，弃上清，沉淀用75%的酒精洗涤一次，风干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。提取后的细胞总RNA直接用于反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或按一定比例加入RNase Inhibitor后-80?保存备用。 (2) MLT基因的RT-PCR扩增 反应采用RT-PCR方法扩增目的基因，具体操作参照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2使用说明进行。 RT-PCR反应体系为: 2×One Step RNA PCR Buffer 25 µL M-?-8 1 µL M-?-7 1 µL RNA 5 µL 1 step Enzymes Mix 2 µL RNase Free dH2O up to 50 µL 将上述反应体系混匀、离心，在PCR Express Gradient PCR仪上执行如下反应程序:50?30min，94?预变性2min，一个循环;94?30s，55?退火30s，72?延伸30s，30个循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 2.2.5.6 细胞表达产物的Tricine-SDS PAGE检测 将转染48hr的细胞从6孔板中用细胞刮刮下，4? 4000rpm离心15min，吸去上清，加入50ul 0.01mol/L PBS重悬细胞，再加入5×SDS loading buffer，煮沸5min，获得总蛋白样品。 按下表中的配方配制16.5,Tricine-SDS-PAGE各层凝胶: 10 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 表2.3 Tricine-SDS-PAGE配方 分离胶(mL) 间隔胶(mL) 浓缩胶(mL) 贮液A 2.0 , , 贮液B , 0.63 0.25 3×凝胶缓冲液 2.0 1.0 0.75 80, 甘油 0.80 , , ddH2O 1.2 1.40 2.0 ,3 ,3,310,AP 20×106×10 25×10 ,3,3,3TEMED 6×10 2×10 2.5×10 总计 6 3 3 分别加入正极缓冲液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.9)及负极缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L Tricine，0.1,SDS)，取上述样品点样15μL。稳压40mV电泳。待蛋白进入间隔胶后，可调至100mV，至指示剂离胶底部1cm处停止电泳。小心取出凝胶，先放置在固定液中固定45min，然后用含有考马斯亮蓝R250的染色液染色30min。换脱色液轻微振荡脱色漂洗，至凝胶背景透明为止，照相分析。 2.2.5.7 检测细胞培养液上清抑菌情况 将收集到的细胞培养液(上清液)用0.22um滤膜过滤，并冻干成粉末。用0.01mol/L PBS重新溶解成一定浓度，备用。 用紫外分光光度法测上述样品蛋白浓度，按以下公式计算: 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45×A-0.74×A 280260 用微量稀释方法分析样品抑菌情况: 5 100ul的菌液(1×10CFU/well) +100ul蛋白溶液 将上述混合液培养2hr后，取50ul涂板。 3 实验结果与分析 3.1.1 MLT基因的合成及扩增 MLT、Gel9基因的PCR合成分为两步:合成和扩增。经过两步PCR后，扩增出的片段的电泳结果如下: 图3.1 MLT基因的PCR合成 M: DNA Marker 1. MLT基因PCR合成与扩增产物 11 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 从上图可见，扩增的PCR条带只有一条，大小在125bp~250bp之间，与目的片段133bp(MLT) 的大小基本相符。 3.1.2 pVAX1-MLT转化子的鉴定 图 pVAX1-MLT转化子的菌落PCR鉴定图 图 pVAX1-MLT酶切鉴定 M. DNA Marker 1~2.pVAX1-MLT重组子酶切结果 图3.4 pVAX1-MLT重组子的测序结果 12 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 转染重组质粒48h后的CHO细胞 转染细胞RT-PCR检测 1~2 pVAX1-MLT转染COS7细胞 3 阴性对照，没加模板RNA 细胞裂解液的Tricine-SDS-PAGE检测 收集转染后细胞，用0.01M PBS重悬后，加入5×SDS loading buffer，使细胞破碎并细胞内蛋白变性。进行TRCINE-SDS-PAGE检测，结果发现pVAX1-MLT9转染CHO细胞在5KD左右出现蛋白条带 13 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 图 细胞裂解液的Tricine-SDS-PAGE检测 Marker:200,116,97.2,66.4,44.3,29,20.1,14.3,6.5 中间有些黑的 可能看不清 细胞表达产物抗菌活性检测 ck(未转染重组质粒的细胞上清浓缩) 14 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 转染了pVAX1-MLT的上清浓缩液 分析与讨论 1、 鸡卵清蛋白调控序列 目前对于构建鸡输卵管特异表达载体所需要的ov调控元件尚无明确结论。Park等研究结果显示-900~+9区段调控的CAT表达量相对较高。宇丽等(1999，2001)克隆了约1.1kb的ov调控序列，也获得了外源CAT基因的表达。李银聚等(2009)构建了含1.0kb 5,端ov调控序列的重组载体，获得有活性IL-2。喻小亮等(2009)用1.3kb的5,端ov调控序列驱动人促红细胞生成素基因和GFP共表达。可见在起始位点上游约1000bp的序列包含了所有基本的调控元件，能使其下游基因得到表达。本研究参照前人资料，克隆得到约1.1kb的ov调控序列，包括了TATA框、NRE负调控元件和SDRE类固醇激素依赖性调控元件等基本调控单元。经测序，与NCBI上公布的序列有五处不同，这可能与鸡的种系不同和Taq酶的保真性有关，但皆不处于调控元件内，因此不影响ov的功能，克隆得到的ov序列可以使用。 2、激素的作用 激素既对输卵管细胞的增殖起促进作用 ,又对卵清蛋白的转录起诱导作用 ,也对卵清蛋白的翻译起正调控作用。在细胞培养中 ,细胞的增殖、卵清蛋白的表达依赖雌激素刺激的鸡血清中的许多因子 , 上述条件满足后 ,再加入雌二醇就能促进卵清蛋白合成。Sally等[2 ]用雌激素刺激的鸡血清培养输卵管细胞 ,只加雌二醇就能诱导合成卵清蛋白 ,但雌二醇的量为25~100nmol ,其量远远多于饱和受体的量;若加促生长因子样多肽和雌二醇可使卵清蛋白mRNA提高 10 倍。要获得与体内相同的卵清蛋白mRNA 水平 ,只加雌二醇是不够的 ,胰岛素、糖皮质激素、孕酮、雌激素也是必须的 ,而且发现皮质酮若单独加入不起诱导作用 ,当其生理性浓缩时能加强雌二醇的应答;若在培养液中加入雌二醇、皮质酮和胰岛素则能显著提高卵清蛋白mRNA的量。 3、真核质粒的制备 质粒DNA的克隆宿主是革兰氏阴性菌E.coli，其死亡或裂解时会释放出内毒素。用于细胞转 15 “丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 染或动物实验的质粒DNA必须有较高的纯度，尽量去除内毒素，避免引起试验动物的毒性反应。有商品化的去内毒素的抽提试剂盒，可方便提取较高纯度的无内毒素质粒DNA。质粒DNA的纯度一般用分光光度法检测，高纯度的DNA样品的A260/A280比值在1.8~2.0之间。否则，低于1.8说明样品中含有蛋白质等污染;高于2.0则样品中含有RNA。不够纯的质粒DNA可经聚乙二醇沉淀法或氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法(J.萨姆布鲁克et al，2002)纯化后，用于转染。但上述两种方法都较为繁琐。用碱裂解法大量抽提质粒DNA后，用聚乙二醇沉淀法纯化，所得的质粒DNA纯度不够，往往会有蛋白污染，浓度也有限。 本实验用商品化的去内毒素大量提取试剂盒抽提质粒DNA，经分光光度计检测，所获得的质粒浓度在300~500μg/mL之间，A260/A280比值在1.8~2.0之内，纯度较高，符合用于细胞转染和动物试验的基本要求。 本实验思路新颖，设计研制防治种鸡蛋传性疾病——鸡白痢沙门氏菌、霉形体感染的DNA药物和蜂毒肽药物。使我们多年对蜂毒肽的理论研究结果与养鸡业存在的蛋传病问题紧密结合，解决生产实践中蛋传病流行问题，使这一困扰养鸡业的流行病得到真正防治。同时该实验的成功达到了一举两得的功效，既可用于雏鸡感染鸡白痢沙门氏病，又能以蛋作为动物生物反应器，大量产生无毒高效的蜂毒肽药物。本课题研制的预防种鸡蛋传性疾病——鸡白痢沙门氏菌、霉形体感染的DNA药物，将成为一种有效的预防鸡感染沙门氏菌病的新型药物。使用适合我国国情、生产成本低廉的新型的蜂毒肽新型的DNA药物，能够显著降低生产成本，为进一步产业化打下切实可行的基础。该产品的开发具有非常广阔的应用前景和经济效益，有市场推广价值～ 参考文献: 中国家禽.2006,28(17):45~48 [1]Douglas Grieve.蛋鸡及鸡蛋中沙门氏菌的控制. 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