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解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶基因的克隆与表达

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解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶基因的克隆与表达大肠杆菌苹果酸脱氢酶的原核表达、纯化与酶活力测定 摘要:苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)普遍存在动物、植物、细 菌等多种生物体中,负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换,在细胞的多种生理活动中发挥重要作用,如C4循环、光合作用、TCA循环。本实验从实验室保存的DH5α重组菌中提取pET28b-mdh重组质粒,并对其进行双酶切鉴定。将重组质粒pET28b-mdh转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中,通过卡那霉素和氯霉素抗性进行筛选。挑取单菌落培养至菌体浓度OD600≈0....

解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶基因的克隆与表达
大肠杆菌苹果酸脱氢酶的原核 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达、纯化与酶活力测定 摘要:苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)普遍存在动物、植物、细 菌等多种生物体中,负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换,在细胞的多种生理活动中发挥重要作用,如C4循环、光合作用、TCA循环。本实验从实验室保存的DH5α重组菌中提取pET28b-mdh重组质粒,并对其进行双酶切鉴定。将重组质粒pET28b-mdh转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中,通过卡那霉素和氯霉素抗性进行筛选。挑取单菌落培养至菌体浓度OD600≈0.6时,用0.1 mM的IPTG诱导表达MDH蛋白,然后收集、纯化MDH蛋白并 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 其酶活力。结果表明,MDH在大肠杆菌中获得了高量表达,MDH还原草酰乙酸的活力为194.75 U/mg。 关键词:苹果酸脱氢酶;原核表达;活力测定 Expression and Purification of Malate Dehydrogenase from Escherichia coli and its Activity Determination Abstract: Malate Dehydrogenase is ubiquitous in animals, plants, and bacterias, which catalyzed the interconversion of oxaloacetate and malate linked to the oxidation/reduction of dinucleotide coenzymes, which play a key role in many metabolic pathways such as TCA cycle, photosynthesis, C4 cycle and so on. In this study, we extracted pET28b-mdh recombinant plasmid from DH5α, which was preserved in our laboratory, and examined the recombinant plasmid correctness through double enzymes digestion reaction. Then we transformed the recombinant plasmid into E.coli Rosetta(DE3) and screened the positive recombinant strain thought kalamycin and chloromycetin resistance. And then we cultured the individual colony until OD600≈0.6, then added IPTG to the finally concentration 0.1mM to induce the expression of MDH. We collected and purified the MDH and then analyzed MDH enzyme activity. The result showed that MDH can be highly induced to express in E.coli and its activity to reduce oxaloacetate is 194.75 U/mg. Keywords: malate dehydrogenase; prokaryotic expression; activity assay 1 1 前言 1.1苹果酸脱氢酶 苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH; EC 1.1.1.37)普遍存在于动物、植物和细菌等各种生物体中,是生物体糖代谢的关键酶之一。根据不同的辅酶特异性,MDHs分为NAD-依赖性的MDHs和NADP-依赖性MDHs. 细菌中通常只含有NAD-MDHs,存在于细胞膜上。在真核细胞中,NAD-MDHs分布于细胞质和线粒体中,NADP-MDHs位于叶绿体。 NAD-MDHs一般不受代谢调节,NADP-MDHs间接受光调节[1]。MDHs为同源二聚体或四聚体,目前发现的真核生物MDHs都是二聚体,如猪心cyMDH和大米的cyMDH。大肠杆菌的MDH都是二聚体,但芽孢杆菌类类多为四聚体,如枯草杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的MDH。NAD-MDHs亚基分子量在32~37kDa之间, NADP-MDHs亚基分子量约42kDa[2]。MDH能催化苹果酸和草酰乙酸之间的转化: malate + NAD+oxaloacetate + NADH + H+ 该反应在三羧酸循环、光合作用和C4循环等途径中都有重要作用。 1.2 苹果酸脱氢酶的研究意义 在酸性土壤中铝毒是许多作物正常生产的主要限制因子, 虽可通过施用生石灰来改良土壤酸碱度但只能改善土壤表层,在实际应用中受到很大限制。紫花苜蓿作为一种非常重要的牧草饲料在酸性土壤条件下苜蓿生长缓慢甚至死亡[3]。研究表明,有机酸如柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、丙二酸、琥珀酸盐和醋酸盐[4]可以螯合土壤中的铝离子,降低铝对植物体的毒害作用[5]。 这些有机酸中,苹果酸是植物体内关键的代谢物。苹果酸含量提高的途径主要来自植物体合成的提高。MDH可以催化草酰乙酸的氧化作用已形成苹果酸盐,增加植物体内苹果酸的含量,从而显著提高植物体的耐酸、耐铝性。 同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。 1.3 苹果酸脱氢酶的研究进展 目前,人们已从原核生物、真核生物、真菌、植物哺乳动物等生物体内均分离提到纯化的MDHs[6]。对于植物苹果酸脱氢酶,根据辅酶特异性,亚细胞定位和生理功能,植物苹果酸脱氢酶可以分为5类:NADP-依赖的叶绿体MDH、NAD-依赖的线粒体MDH、NAD-依赖的微体MDH,NAD-依赖的叶绿体MDH和NAD-依赖的细胞质MDH。叶绿体、线粒体和微体的MDH已被广泛研究,而cyMDH目前研究较少[8]。 近些年来由于MDHs的工业应用价值,其受关注的程度日益上升。对其生理生化、分子遗传与进化进行研究已颇为深入。如目前已从水稻、玉米种筛选出苹果酸脱氢酶基因,并对其进行克隆、表达以及生物活性的研究,其中有相当一部分是关于西方蜜蜂苹果酸脱氢酶基因与配合力及杂种优势的研究,也有关于动植物的发育期间苹果酸脱氢酶的分析[9,10]。 2 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 2.1 菌株 DH5α/pET28b-mdh,Rosetta(DE3)均为实验室保存。 2.2 培养基的配制 LB液体培养基(50 ml): Peptone 0.5 g Yeast extract 0.25 g NaCl 0.5 g NaOH (1 mol/L) 50 μl LB固体培养基(50 ml): Peptone 0.5 g Yeast extract 0.25 g NaCl 0.5 g NaOH (1 mol/L) 50 μl Agar 0.75 g 在清洗干净的250 ml锥形瓶中加入50 ml的超纯水,再将上面各种物质加入瓶中,振荡摇匀后用纱布和牛皮纸及线绳将瓶口包扎起来,放入高压真气灭菌锅里进行灭菌(121 ℃,21 min)。(灭菌结束前十分钟左右将超净工作台的紫外灯打开灭菌,接下来的操作在超净工作台中进行)待LB固体培养基冷却到40~50 ℃左右,加入50 μL的30 mg/ml的Kan,和50 μL的25 mg/ml的Cam,使其终浓度分别达到30 μg/ml和25μg/ml. 然后倒平板,冷却凝固。第二天早上将DH5α/pET28b-mdh的菌株接种到培养皿上。 2.3 质粒的提取 1) 用接种环挑取保存好的菌种划线37 ℃过夜培养,菌体长势良好。第二天挑取单菌落于试管中过夜摇菌。 2) 将夜培养的1-2 ml细菌12 000 rpm离心15 s,彻底去除上清。 3) 加入SolutionⅠ100 μl,用枪头或震荡器充分悬浮细菌(悬浮不充分,裂解不完全); 4) 加入SolutionⅡ 200 μl,立即温和混匀(倾斜45度角,顺一个方向慢慢旋转离心管),使细菌裂解,室温放置2 min; 5) 加入SolutionⅢ350 μl立即上下颠倒5-10次使之充分中和,室温放置2 min; 6) 4 ℃, 12 000 rpm,离心5 min,留上清; 7) 将步骤5中得到的上清移到套放于2.0 ml收集管内的UNIQ-10柱中,8 000 rpm室温离心15 s; 8) 弃收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一收集管中,吸500 μl wash solution到UNIQ-10柱中,4 ℃, 10 000 rpm室温离心30 s; 9) 重复步骤7一次; 10) 弃收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一收集管中,10 000 rpm室温离心30 s,以彻底去除wash solution; 11) 将UNIQ-10柱放入新的洁净的1.5 ml离心管中,加50 μl Elution Buffer 室温放置2 min后,10 000 rpm室温离心1 min,离心管中的溶液即为所提取的 质粒DNA; 2.4 重组质粒鉴定与转化2.4.1 双酶切鉴定重组质粒双酶切反应体系: pET28b-mdh Nde I Xho I 10×tango buffer 20 μl 2 μl 2 μl 6 μ1 37 ℃酶切4小时 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 1) 称取0.2 g 琼脂糖,置于50 ml锥形瓶中,加入20 ml 1×TAE,加热使其全部溶解; 2) 稍冷后加入1.5 μl EB溶液,混合均匀,铺板,安放梳子; 3) 琼脂糖凝胶凝固后,拔去梳子,放入电泳槽中;倒入1×TAE,淹没胶面; 4) 用移液枪吸取适量的DNA样品加于点样孔中; 5) 110V恒压电泳,待溴酚蓝电泳至凝胶边缘还有1 cm左右时,停止电泳,紫外灯下观察并拍照。 2.4.3 感受态细胞的制备 1) 用接种环挑取保存好的菌种划线过夜培养,第二天于5 ml液体培养基中接种Rosetta(DE3)单菌落,37 ℃振荡过夜培养。 2) 取1 ml过夜培养物接种到50 ml LB(Kan, Cam)液体培养基中,37 ℃药瓶培养2-3 h至对数生长期(OD550≈0.350); 3) 将培养液分装到30个EP管中,冰浴10-15 min(每管1.5 ml菌液)。 4) 于4℃,4000 rpm离心10 min, 弃上清。 5) 三管合一,第一管加1 ml冰预冷的CaCl2, 混匀,加入第2管,如此将三管合并,冰浴30 min。 6) 于4℃,4000 rpm离心8 min, 弃上清。 7) 菌体用200 μl/ep, 0.1 ml CaCl2/20%甘油保存,立即用于转化或-80 ℃保存(最好在-80 ℃下过夜后再转化)。 2.4.4 转化 1) 从80℃冰箱中取出一管100 μl的Rosetta(DE3)感受态细胞,冰上复苏10 min(冰水浴); 2) 将2 μl的重组质粒加入到100 μl复苏的感受态细胞悬液中,充分混匀,冰浴30 min; 3) 42 ℃热休克90 s; 4) 立即水浴5 min, 加500-600 μl LB培养液(不加抗性),37 ℃轻微震荡1 h 左右; 5) 取50 μl左右涂布于Kan和Cam筛选平板上,放入37 ℃恒温培养箱中, 先正面向上放置半小时待菌液完全被吸收后,再将平板倒置培养16-24 h; 2.5 MDH诱导表达 1) 预培养:挑取转化平板上的单菌落到5 ml LB(Kan, Cam)液体培养基中过夜培养; 2) 将试管中过夜培养的菌液转接1 ml于50 ml LB(Kan, Cam)的锥形瓶中扩大培养, 37 ℃培养2-3 h至OD600=0.6; 3) 向锥形瓶中加入5 μl 1 mol/L IPTG,使其终浓度达到0.1 mM/L。37℃诱导表达6-8小时。 4) 提前将冷冻离心机打开使之降温到4℃, 将诱导表达后的菌液倒入50 ml 的已经灭过菌的离心管中,配平后,在4℃下5 000 rmp离心6 min, 用5 ml的LEW buffer洗涤两遍后,菌体保存在-80℃冰箱中,等待破碎。 2.6菌体破碎与蛋白纯化 1) 将-80℃保存的菌体取出放入冰中解冻10 min,加入10 ml的LEW buffer(Lysis/Equilibrium/Washing buffer)混匀悬浮菌体,转入15 ml的已经灭过菌的塑料离心管中进行破碎。 2) 使用超声波破碎仪进行细胞破碎。破碎1 s,暂停2 s,全程破碎时间21 min。破碎过程注意用冰水浴降温。 3) 4℃,10 000 rmp离心20 min,收集上清,弃沉淀,用于纯化。 4) 纯化 a. 平衡树脂:用4 ml 的LEW buffer平衡再生过后的纯化柱中的树脂。 b. 蛋白质的结合:将破碎液离心收集的上清液加入到柱中进行过滤。 c. 洗柱:用10 ml LEW buffer洗柱子,目的是洗去杂蛋白。 d. 洗脱目的蛋白:用10 ml的elution buffer洗脱,用ep管接洗脱液,每管 接1 ml。 2.7 SDS-PAGE分析 1)制胶 12%分离胶配方10 ml: ddH2O 3.3 ml 30% Acrylamide 4.0 ml 1.5 M Tris-HCl(pH8.8) 2.5 ml 10% SDS 100 μl 10% 过硫酸铵100 μl TEMED 4 μl 5%浓缩胶配方5 ml ddH2O 3.4 ml 30% Acrylamide 0.83 ml 1.0 M Tris-HCl(pH6.8) 0.63 ml 10% SDS 50 μl 10% 过硫酸铵50 μl TEMED 5 μl 2) SDS-PAGE电泳 凝胶凝固后,加入SDS-PAGE电极缓冲液,待测蛋白质样品加入等量的加样缓冲液,沸水浴加热 5 min,每个上样孔上样30 μl。将凝胶板放入1×Tris-Gly buffer,连上电源,先恒压80 V 电泳,待溴酚蓝完全进入分离胶后转120V 恒电压直至溴酚蓝前沿玻璃板下沿1-2 cm处结束电泳。 3)剥胶,染色,脱色 当溴酚蓝电泳至分离胶的边缘并且有部分溢出时,终止电泳。剥下分离胶于培养皿中使用考马斯亮蓝染色液染色2~4 h, 脱色液脱色1~3 h, 观察电泳结果。 2.8 MDH的粗酶活力测定 测定MDH还原草酰乙酸的能力: 反应体系终浓度 Tris-HCl 100 mM NADH 0.14 mM OAA 0.75 mM 2.9 纯化蛋白浓度的测定 用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,以0.125 mg∕ml,0.25 mg∕ml,0.5 mg∕ml, 0.75 mg∕ml,1.0 mg∕ml BSA为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 样。在595 nM,25℃条件下使用测定标准样蛋白质浓度绘制标准曲线。在相同条件下测定MDH蛋白质样品的浓度。 3 结果与分析 3.1双酶切鉴定重组质粒 如图1所示,将提取的pET28b-mdh重组质粒用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定,得到目标产物mdh基因(936 bp),证明了重组质粒的正确性。 图1. 重组质粒pET28b-mdh的双酶切鉴定 Fig 1, Restriction digestion of the recombinant plasmid pET28b-mdh M, DNA Marker DL2000; lane 1, recombinant plasmid digested by Nde I and Xho I 3.2 SDS-PAGE分析 图2. SDS-PAGE分析MDH蛋白的表达与纯化 Fig 2, SDS-PAGE analysis of the expression and purification of the MDH protein M, protein molecular weight marker; lane 1, protein extract of Rosetta(DE3) containing pET28b; lane 2, protein extract of Rosetta(DE3) containing pET28b-mdh; lane 3, purified MDH 如图2所示: M泳道是蛋白质分子量Marker. 1号泳道是含有pET28b空质粒转化菌的蛋白质粗提取液。2号泳道是pET28b-mdh重组质粒转化菌的蛋白质粗提取液。3号泳道是纯化以后的MDH。可见其分子量大小略小于35 kDa,于理论大小34.3kDa是相符的。 3.3 酶浓度测定 待测定的MDH重复三次测得的数据分别为0.868 mg/ml,0.873 mg/ml,0.859 mg/ml,取平均值得0.8667±0.0071 mg/ml。 3.4 酶活力测定 图3 MDH催化反应示意图 Fig 3, Schematic diagram of the reaction catalyzed by MDH 按照2.7反应体系测定MDH的酶活,重复四次取三次接近值计算平均值。图3是MDH催化反应示意图。酶的比活力是按照下面的公式计算: OD/min×Vt×df 酶的比活力(U/mg) = ε×1.0×V E×C E Vt反应体系的体积(1 ml),V E为反应体系中粗酶的体积,C E为粗酶的浓度,ε为NADH在340 nm处的摩尔吸光系数(6.22 mM-1cm-1),1.0为比色杯内径。 按照公式计算,粗酶比活力为194.75U/mg。 4实验讨论 依赖NAD(P)的苹果酸脱氢酶(L-MDH)以及依赖NAD的乳酸脱氢酶(L-LDH)形成一个很大的超家族[11,12]。这两种酶起源于早期的基因重复,而非同一个基因。该超家族可分为三个组:L-LDH,类L-MDH, 以及二聚体L-MDH。每个组内均发生各种各样功能的改变。其进化方向通常表现为向两极分化, 即进化为底物特异性的酶分子,以及底物 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 不严格的酶分子[12]。MDH 为多聚体酶, 是由相同或相似亚基组成的二聚体或四聚体, 亚基的分子量为30-35kDa[6]。两类不同辅酶的MDH一级结构的相关性很低,但其某些催化关键部位、辅因子结合部位、以及亚基表面结合部位有较高的同源性。与催化功能有关的三维结构组成元件高度保守且其三维立体结构十分相似。 苹果酸脱氢酶是一种广泛分布的氧化还原酶,一级结构的氨基酸序列显示苹果酸脱氢酶在系统发生上主要分为两大类。多种苹果酸脱氢酶的氨基酸序列也显示,除了核苷酸结合部位,催化部位以及亚基结合面等几个重要部位,其他一级结构的相似度是很低的。尽管几种苹果酸脱氢酶的氨基酸序列同源性很低,但是他们的三维结构却非常相似。苹果酸脱氢酶的辅酶特异性可以因为单个氨基酸残基的改变而改变,底物特异性也可以发生类似变化[1]。苹果酸脱氢酶的和具有相似结构的乳酸脱氢酶拥有类似的催化机制。单个氨基酸残基的替换使得乳酸脱氢酶转变成了苹果酸脱氢酶,但是在苹果酸脱氢酶中一个类似的氨基酸残基的替换使得其对OAA的高特异性有所降低。了解掌握苹果酸和乳酸脱氢酶的三维结构使得我们对酶的改造有了依据而不在是随机的突变,在商业领域将产生重要作用。而本实验所做的工作也是为后续的辅酶改造试验做准备。 参考文献: [1] Gorward C R, Nicholls D J. 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