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人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察.doc

人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察

我不会让你看见我流泪
2017-12-11 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察doc》,可适用于综合领域

人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察西北国防医学杂志(MedJNDFNC)Aug()人胎儿毛乳头细胞在聚羟基乙酸真皮支架上的生长特性观察王洪涛,陈璧,陶克,汤朝武,胡大海(第~V医大学西京医院烧伤外科,陕西西安)论着摘要:目的:观察人胎儿毛乳头细胞(FDPC)在生物可降解材料聚羟基乙酸(PGA)支架材料中的生长情况探讨其作为组织工:将二步法培养的FDPC接种于PGA支程皮肤种子细胞和真皮支架的可行性方法架材料上并在体外立体培养,记录不同时间点的细胞数量分别用相差显微镜,石蜡切片和扫描电镜观察细胞的生长状况以及细胞和组织的黏附情况结果:PGA材料浸提液对于FDPC生长没有抑制FDPC与PGA的黏附率为细胞在支架上三维立体培养符合正常生长曲线HE染色和电镜显示细胞生长良好,形态正常,黏附牢固结论:FDPC与PGA具有良好相容性和黏附性,可进一步研究以PGA作为真皮支架构建组织工程皮肤关键词:人胎儿毛乳头细胞聚羟基乙酸生物相容性组织工程中图分类号:R文献标识码:A文章编号:()o一OExperimentalstudyongrowthcharactersoffetaldermalfolliclecellsinpolyglycoHcacidWANGHongtao,CHENBi,TAOKe,eta(DepartmentofBum,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,,China)Abstract:Objective:Tostudythebiocompadbilityofpdygty'colicacid(PGA)scaffoldswithfetaldermalfolliclecell(FDPC)anditsgrowthcharactersinPGA,thenprovidethepossibilityforfabricatinglivingtissueengineeringskinwithhairfollicleandPGAMethods:FDPCswereculturedinPGAscaffoldsCeUadhesionrateandproliferationweredetected,andthemorphologicalcharacterswereobservedwithmicroscopeandSEMafterseedingResults:CeiladhesionrateofFDPCinPGAwasandthecellsattachedandgrewwellonthePGAscaffoldsConclusion:TheresultsshowthatPGAhasagoodbiocompatibilitywithFDPCanditmaybefeasibletodeveloptissueengineeringskinKeywords:FetaldermalfolliclecellPolyglycolicacidBiocompatibilityTissueengineering种子细胞和种子细胞所赖于存在的支架材料是体外构建组织工程皮肤研究过程中的两大核心技术而在支架材料研究中,人工合成的生物降解聚合物因其来源广泛,机械性能良好,没有免疫源性而成为研究热点本文就人胎儿毛乳头细胞(FDPC)在可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)上的生长特性进行了观察,探讨其组建构成组织工程化皮肤的可行性材料和方法主要材料和试剂:可吸收性聚羟基乙酸材料收稿日期:作者简介:王洪涛(一),男,医师,助教,Tel:Email:htwcncorn(商品名:Neoveil)是由日本郡是有限公司生产,为非编织的修补用毛毡标本为,月胎龄终止妊娠人流胎儿头皮(家属知情同意)DMEM(GIBCOUSA),胶原酶(GIBCOUSA),胰蛋白酶(SIGMAUSA),胎牛血清(杭州四季青公司),MTr(SIGMAUSA),$扫描电镜(HITACHI,JAPAN),CO孵箱及超净工作台等FDPC的分离培养及传代:按丁国斌方法,用剪刀将头皮下组织层剪下,相当于毛根中下段至毛球水平,得到包括毛球,毛球内毛乳头,毛干下端及周围结缔组织鞘的结构,PBS洗涤次,加人gL胶原酶cI=消化,h,终止消化,用PBS反复离心洗涤,得到的组织中包括分离的毛乳头,毛西北国防医学杂志(MedJNDFNC)Aug()干下端及残存的部分外根鞘,置含mlL新生牛血清DMEM培养基中培养,接近融合时(含EDTA)胰酶消化,传代培养本实验所使用的为代细胞浸提液对FDPC细胞生长的影响:将PGA材料切成ll'Lrn×mm小块,放人六孔培养板内,加入含FCS的DMEMml浸泡h,提取浸提液用孔板培养FDPC,每~LJJtl×ml细胞悬液l,,CO,湿度下培养隔日换液,其中对照组为新鲜培养液,实验组为浸提液分别于换液后,,h后吸取上清l弃去,每孔加入MTr溶液(gL)置于C孵箱中继续培养h,终止培养小心吸弃培养液上清,每~LJJn人二甲基亚枫l震荡min显色,在nm波长下,酶联免疫分析仪测吸光度OD值FDPC在PGA材料中的生长曲线测定:将PGA材料剪成直径mill小块置于孔细胞培养板底部,加入DMEMl,孵箱中过夜,吸出培养基每孔加入×mlFDPC细胞悬液,空白孔同时加入l×mlFDPC细胞悬液l作为对照,oC,CO:,湿度下培养分别于,,,,,,lld各取出一块培养板,吸出培养基,PBS洗涤次,加入(含EDTA)胰蛋白酶p,l消化rain,吸出细胞悬液,加入DMEM洗涤一次,收集细胞悬液,镜下记数,画细胞生长曲线FDPC在PGA上的生长情况:将PGA浸泡于含的FCS的DMEM培养基中h后,吸出上清,按l×ml细胞密度滴加,oC,CO,湿度下培养,每日观察细胞生长增殖,细胞形态及与支架的黏附清况接种d和d后,取出材料,PBS洗涤次,浸泡于质量浓度为的甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋,HE染色超微结构观察:在细胞接种PGA材料d,d后取出材料,PBS洗涤次,浸泡于戊二醛溶液中固定,常规脱水,包埋扫描电镜观察支架材料内细胞黏附及生长情况结果原代培养的细胞以毛乳头为中心呈放射状排列,细胞以三角形,多角形为主,渐成梭形,传代后以梭形细胞为主对数生长期在d细胞周期分析与成纤维细胞无显着差异,见图lFDPC在PGA浸提液和对照组中随着培养时间的延长,均出现增殖,并符合FDPC的生长曲线,在培养不同时间里两组细胞MTr值无明显差异,见表表FDPC在PGA浸提液中的生长情况(MTTOD值)FDPC接种PGA支架后h的黏附率为,d左右进入对数生长期,生长曲线与对照组相当但生长速度较对照组快,d以后进入平台期相差显微镜观察:FDPC接种于PGA材料后细胞成圆形,折光性强h后可见部分细胞黏附于支架中,细胞伸展成多角形h可见部分细胞形成梭形d可见细胞扩增,聚集,沿PGA纤维长轴伸展d左右可见细胞相互融合,见图图lFDPC原代培养h可见毛乳头贴壁并有细胞生长(X)图FDPC接种PGA后d可见细胞沿支架纤维成梭形生长(×)石蜡切片观察:FDPC在PGA支架上体外立体培养d后常规HE染色可见支架内散在细胞生长,d后HE染色可见支架内细胞数量增加,细胞与材料黏附生长,见图电镜观察:FDPC接种支架材料后h扫描电镜观察见细胞已完全伸展,细胞间出现连接,细胞周西北国防医学杂志(MedJNDFNC)Aug()围可见基质分泌培养d后,细胞呈梭形,有伪足包裹PGA纤维,细胞间连接紧密,与材料附着比较牢固,见图图FDPC接种PGAd后石蜡切片)可见细胞与支架材料黏附生长(×图FDPC接种PGAd后电镜下可见细胞与支架材料黏附生长(×)讨论组织工程技术发展新月异,目前研制开发很多组织工程皮肤,而且有些已经商品化,应用于临床后取得了较好的临床效果J,但目前的组织工程皮肤面临着共同的难题,即缺乏毛囊,皮脂腺等附属器以及免疫排斥等J韩军涛等分离培养了胎鼠表皮干细胞并利用毛乳头细胞体内诱导干细胞形成新生毛囊,为构建功能性组织工程皮肤提供新的思路本文分离培养FDPC细胞,并以此作为种子细胞,在三维真皮支架上立体培养,以此为进一步研制具有毛囊结构,免疫排斥低的组织工程皮肤奠定基础细胞外基质即支架材料的研究是组织工程研究中最重要的组成部分之一,其形态和功能直接影响到所构成组织的形态和功能而PGA在体内可以完全降解,其降解产物为聚乙酸,是人体血液内本身所固有成分,不会引起病理反应J目前广泛应用于可吸收缝线,生物粘补材料等DrewaT等将成纤维细胞接种于PGA,成功修复鼠腹部巨大缺损创面模型本实验检测了FDPC在PGA浸提液培养基中的生长情况,结果显示与对照组无明显差异,证明PGA无细胞毒性,对细胞生长无抑制作用通过FDPC在PGA支架上的生长特性观察证明FDPC在支架上生长良好,符合细胞的生长规律但在支架生长过程中,细胞形态与二维培养有一定差异,细胞胞体较大,可能与支架材料表面结构有关,是否功,细胞能有所改变尚待进一步研究在接种h后黏附率相对较低(),而且在移出PGA支架后可见培养板底有大量细胞贴壁生长,可见支架材料的孔隙率过大是导致黏附率低的直接原因另外,材料表面的疏水性也是一项重要原因这些可以通过材料的改性和预铺胶原等方法加以改进虽然黏附率相对较低,但细胞在三维支架中生长速度较快,可能与细胞生长过程中没有接触抑制有关本实验中我们对细胞支架复合物进行了HE染色和电镜观察,均显示FDPC与PGA具有良好的黏附性,细胞生长形态正常,未见凋亡和分化的细胞因此可以以FDPC作为种子细胞,以PGA作为真皮支架体外构建组织工程皮肤参考文献:丁国斌,陈璧,汤朝武,等组织工程皮肤中毛乳头细胞体外培养条件的优化J中国临床康复,,():,BannaschH,FolmM,UnterbergT,etaSkintissueengineeringJClinDermatol,,:MasonCTissueengineeringskin:aparadigmshiftinwoundcareJMedDeviceTechnol,,():韩军涛,陈璧,张晓辉,等胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究J中华烧伤杂志,,():BolandED,WnekGE,SimpsonDG,etaTailoringtissueengineeringscaffoldusingelectrostaticprocessingtechniques:astudyofpoly(glycolicacid)JJMacromolSci,,:DrewaT,GalazkaP,ProkuratA,etaAbdominalwallrepairusingabiodegradablescaffoldseededwithcellsjJPediatrSarg,,():GuopingChen,TakashiSato,HajimeOhgushi,etaCulturingofskinfibroblastsinathinPLGAcollagenhybridmeshJBiomaterials,,():

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