当归多糖和黄芪多糖的提取工艺研究

当归多糖和黄芪多糖的提取工艺研究 天津大学 硕士学位论文当归多糖和黄芪多糖的提取工艺研究 姓名:许会生 申请学位级别:硕士 专业:制药工程 指导教师:赵广荣张铁军 20070601 摘要 当归和黄芪是两味常用的传统中药，本文主要探索了其有效部位当归多糖和黄芪多糖的提取工艺，建立了多糖含量测定方法，主要的研究内容和结果如下。 对苯酚(硫酸法和问羟基联苯法的线性和范围、精密度、稳定性和准确度等指标进行考察，为多糖质量控制 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的建立提供了参考。同时确立了多糖中蛋白质含量方法。用苯酚(硫酸法测定了当归和黄芪中的多糖含量，试验结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，当归和黄芪多糖的含量分别为,,(,,,和,(,,,。 通过单因素试验和正交实验，确定了当归多糖的最佳提取条件为提取温度,,,?，固液比为,:,,，提取,次，每次,,。当归多糖的乙醇沉淀最佳工艺为当归多糖的浓缩比为,(,,,生药,,,水，加入,倍体积,,,乙醇，静置,,,。脱除当归多糖中蛋白质的的最佳工艺为，,,,,氯乙酸，静置,,，处理,次。中空纤维膜超滤膜(截留分子量, ,,,)纯化当归多糖液的条件为,,?，,(,,,,,下操作。该新工艺制备的当归多糖中性糖含量,,(,,,，糖醛酸含量为,,(,,,，总糖含量为,,(,,，多糖得率为,(,,,。 采用了与当归多糖相同的方法确定了黄芪多糖的最佳制备工艺。提取条件为固液比为,:,,，,,,”,下提取,次，每次,,。醇沉工艺为黄芪多糖的浓缩比为,(,,生药,,,水，,倍体积,,,乙醇，静置,,,。脱除蛋白质的工艺为，,,三氯乙酸，静置,,，处理,次。在,,”(,、,(,,,,,下超滤，除去小分子杂质。由该工艺提取的黄芪多糖总糖含量,,(,,,，多糖得率为,(,,,。 本文研究方法规范可靠，摸索出当归多糖和黄芪多糖分离提取的优化工艺，为其进一步研究和工业化生产提供了试验依据和理论支持。关键词:当归;黄芪;多糖:提取工艺 ,,,,,,,, ,,,,,,;, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,, 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,,,,,,,,(,,,,),,,,,的干燥根，是一味常用的传统中药。当归性温，味甘、辛，具有补血、活血、调经止痛、润肠通便、扶正固本【,】之功效。近年来的药理研究表明，从其水溶性部分提取的当归多糖具有丰富的生物活性，通过激活补体【,,，对机体免疫系统、造血系统发挥作用，还具有抗肿瘤,,,、抗放射性损伤,,】和促进胃溃疡愈合,,〕等活性。因此，当归多糖在医疗、保健食品行业具有极其广阔的应用前景。,(,(,当归的预处理 由于当归取根部入药，其中含有大量的色素、脂肪酸等脂溶性成分以及单糖、低聚糖等无活性成分，对后续分离干扰很大，故须进行预处理。常用甲醇、乙醚和石油醚等脱脂，用,,,,,,,的乙醇除去单糖、低聚糖等杂质。刘云等【,】采用索氏提取法，依次用石油醚(,,,,,。,)、乙醚和,,,乙醇回流预处理当归，石油醚、乙醚可除去当归中脂溶性杂质，,,,乙醇提取可除去当归中所含的单糖、低聚糖及苷类等无活性成分。为了避免使用有毒有机溶剂，适合工业化生产的要求，也可用,,,乙醇直接回流处理佟,。另外，多糖是生物大分子物质，在高温条件下易降解，而采用,,,乙醇渗漉的方式有效地避免了这一点【,】，渗漉可以不断地造成浓度差，提高了浸出杂质的效率，也节省了能耗，但是其乙醇使用量远远大于回流操作。,(,(,当归多糖的提取 预处理后的药材，可用热水、稀酸、稀碱或稀盐作溶剂提取多糖【，,，，，〕。但目前的当归多糖多采用沸水回流提取四和恒温水浴提取俐的方法。沸水回流提取多糖，操作简单，过程易于控制，条件易于放大，但在,,,”,提取有可能造成多 笫?幸文献综述糖降解，进而影响其药理活性。而恒温水浴提取通常将温度控制在,,,,((,, ,;之间，因而能够避免多糖的降解，同时能减少提取液中杂质含量，有助„丁(提高多糖纯度。 水液提取当归多糖符合“水煎中药”的传统习惯，但是不能保证多糖提取完全，因此应该积极尝试用稀酸、稀碱或稀盐等其它溶剂来提取当归多糖。另外，提取辅助手段如超声波、微波等技术已经成功应用于其他植物多糖的提取，它们的使用有效地提高多糖 的提取率和产品质量，并缩短了反应时间，这也是优化当归多糖提取的发展方向。,(,(,当归多糖的沉淀析出 多糖提取液经滤过、浓缩后，即以等量或数倍体积的甲醇、乙醇或丙酮等沉淀析出。当归多糖常用乙醇沉淀析出，只是最终乙醇浓度有差异。增高醇沉浓度，可以使多糖沉淀完全，提高当归多糖收率，然而乙醇浓度过高会导致低聚糖和杂质含量增加，进而影响多糖的纯度，增大后续工序的负担，适宜的终乙醇浓度应该控制在,,,，,,(,，,,,哺刃,。加入乙醇后，即将溶液,,,,?静置过夜，以便于当归多糖析出。析出的多糖沉淀可采用滤纸滤过的方式与溶液分离【(不，但是多糖往往粘在滤纸上不易取下来，因而近年来人们普遍采用离心的方法【,,?,,】。 用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收当归多糖的简单方法。在溶液中沉淀当归多糖时，多糖溶液浓度不宜太浓，否则沉淀的多糖易形成大块胶状沉淀;浓度过稀，多糖会沉淀为乳状，使分离变为不可能且消 因此应将当归多糖的浓度控制?诳刂圃谑室说姆段А,趸翊侄嗵切耗有机溶剂量大， 杈 锤慈芙庥氪嘉觯 娇纱锏浇 徊骄 频哪康摹,保 保 当归多糖中蛋白质的脱除 天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分共存，由于蛋白质的溶解性与多糖相似，溶于水，但不溶于乙醇等有机溶剂，且分子量分布范围相近，因此在水提醇沉过程中，会引入蛋白质杂质。另外多糖常常与蛋白质形成糖蛋白复合物，使蛋白质的脱除更加困难。可根据蛋白质的理化性质，选择性地使用多糖不沉淀而使蛋白质沉淀的试剂来除去蛋白质。,,,,,;法，,,，根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性失活的特点，按氯仿:正丁醇(,:,)或(,:,)比例加入试剂，混合物剧烈振摇,,蛩,,,,,,，使蛋白质变性而生成凝胶物，离心除去两相界面处的蛋白质。类似的试剂还有三氟三氯乙烷，多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌，多次处理后，离心收集上层为无蛋白质的多糖溶液。三氯乙酸是一种有机强酸，可使蛋白质变性而形成不溶的蛋白质盐沉淀。 当归多糖粗提物中蛋白质含量较高，目前实验室常用,,,,,法脱除蛋白质。 , 第，章文献综述为了避免使用有机溶剂也可采用反复冻融的方法除蛋白,,引，将多糖液浓缩后，(,,?室温反复冻融,,,次，离心除去蛋白质。另外，蛋白质在等电点时溶解度最小，用氢氧化钙饱和液,,周,,,,,,,可除去偏碱性的蛋白质，然后再用硫酸调,,,”,,,?,，可除去偏酸性的蛋白质，】,,。冻融和等电点沉淀除蛋白质操作简单，但多糖液里往往有低浓度的蛋白质残留，应与其它方法结合使用。,(,(,当归多糖中色素的脱除 植物多糖提取物中含有酚类化合物而使其颜色较深，可用吸附剂(纤维素、硅藻土、活性炭等)、离子交换柱(,,,,(纤维素)、氧化剂(,,,,)等脱除。活性炭比表面积大，吸附能力强，只需向当归多糖液中加入,(,,活性炭，煮沸后滤过即可完成脱色操作,,,。此法成本低廉，适合工业化生产。,,,,(纤维素是目前实验室最常用的方法，当归多糖液上离子交换柱后，分别用蒸馏水和碱溶液洗脱，分步收集，不仅达到脱色的目的，还可得水洗馏分中性多糖和碱洗馏分酸性多糖【, ,,。阴阳离子混合树脂,,,】和大孔吸附树脂【,,,,,〕也应用于当归多糖的脱色中。另外，,,, ,等,,,,采用了不同的方法处理东当归，他们将粗当归多糖用甲醇回流,,进行脱色(处理。,(,(,当归多糖中小分子杂质的脱除 小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性，需要进一步脱除，提高纯度。对于当归多糖，可选用截流分子量, ,,,的透析膜，通过逆向流水透析除去小分子杂质峭,。使用时，透析袋要 留一半以上的空间，以防透析袋涨破。另外，透析操作周期长，往往需要,,,天，常温操作有可能造成多糖的霉变，必要时可加入少量防腐剂或在低温条件下进行。透析法简单易行，技术成熟，但是透析除杂的效率不高。膜分离技术发展很快，选择适宜孔径的膜可有效去除小分子杂质，缩短牛产周期，因此研究使用膜分离技术无疑是当归多糖脱除杂质的一条新途径。,(,(,当归多糖的干燥 经过以上提取纯化步骤得到的多糖液体，干燥后得到当归多糖的半精品，可满足常规药理实验、分析试验以及某些制剂的要求。当归多糖常用的干燥方法有真空干燥法和冷冻干燥法。真空干燥法需先用乙醇使多糖沉淀，并用无水乙醇或无水乙醚洗涤以取代残留水分，将吸干后疏松的多糖物质迅速置于装有五氧化二磷的真空干燥器中减压干燥,,,。冷冻干燥法无需乙醇沉淀，将多糖液冰箱预冷后， 第„章文献综述直接放入冻干机冻干十),,耳,可。冻干法制出的多糖分散性好，水溶性强，因而成为近几年来当归多糖干燥的常用方法,,】,,(，(,当归多糖的分级制备 采用上述方法提取的多糖通常是多糖的混合物，不同的分子量的多糖免疫活性相差很大„烈，，凶而需要对多糖进行分级分离，以达到纯化的目的。可按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、凝胶柱色谱等)，也可按分子所带电荷密度的不同分级(如电泳、离子交换色谱等)〔,,】。,(,(,(,季铵盐沉淀法 季铵盐的阳离子可与酸性多糖形成季铵络合物，此络合物在低离子强度的水溶液中不溶解而产生沉淀。若提高多糖液,,值或加入硼砂缓冲液，也可使中性多糖沉淀分离。常用季铵盐有十六烷基三甲基季铵盐的溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。商澎等【,】向总多糖液中加入等体积,,十六烷基三甲基溴化铵(,,,,)，沉淀用,,,，溶液溶解，加入,倍体积预冷的,,,乙醇，收集白色沉淀得到酸性多糖，含有较高的糖醛酸。,,,,处理后的上清为无色清液，加入,,,,,,,(,, ,(,)，沉淀用,,,,溶液调,,为, ,(,，得到乳黄色果冻状沉淀，再用乙酸调,,为,(,后，用,,, ,溶液溶解，最后用冷乙醇沉淀，离心收集沉淀得第二组分。第二组分提取后的上清液用乙酸调,,为,(,，加乙醇,”,静置过夜，便得到中性多糖。应用此法制得的三个多糖组分仍为多糖混合物，需要经过进一步的柱层析方可得到单一多糖组分。,(,(,(,离子交换层析法 离子交换层析柱的吸附力与多糖所带电荷的多少有关，若多糖分子中酸性基团增加，则所带电荷量多，吸附力也随之增加，因而可以对电荷性质不同的多糖进行分级。离子交换层析柱同时也有分子筛的作用，合理的应用离子交换葡聚糖凝胶分离当归总多糖，可以得到单一的多糖组分【,,,, ,,。将多糖溶解于蒸馏水后，用,,,,(,,,,,,,, ,(,,对当归多糖复合物进行柱层析，先用蒸馏水洗脱，再分别用,(,、,(,和,(, ,,,?，。的醋酸缓冲液依次洗脱，可得四种单一的多糖组分。水洗脱峰产物为中性多糖，分子量是,,, ,,,，结构为: ，,,,;,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,，;,,〕,,,,，;,,斗 , ， , ,,,, ,,(,,醋酸缓冲液洗脱峰产物由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸组成，分子量为,,, ,,,:,(,,和,,醋酸缓冲液洗脱峰产物由相同的单糖按不同 , 第。章文献综述比例组成，分子量分别为,, ,,,和,, ,,,。,(,(,(,离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法 当归多糖成分复杂，除中性多糖外，还含有,,,左右的糖醛酸悼,，因此往往两种不同性质的色谱柱联用才能得到单,多糖组分。张林维等,,,,采用,,, ,(纤维素和葡聚糖凝胶柱联用分离当归总多糖。多糖液通过,,,,一纤维素柱，分别用水和氢氧化钠溶液洗脱而得到的水洗馏分和碱洗馏分，水洗馏分为中性多糖，碱洗馏分为含糖醛酸的酸性多糖。两组分再分别过,,,,,,,, ,(,,,柱进一步纯化，得到的水洗主峰为单一的葡聚糖，分子量为,, ,,,。碱洗主峰由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖组成的杂多糖，分子量为,, ,,,。 也有人用离子交换琼脂糖凝胶和琼脂糖凝胶联用分离当归总多糖【,,?,,,，将多糖液进行,,,,—,,,,,,,,, ,,(,,柱层析，依次用起始缓冲液、,,, ,,,,?,(, ,,,,溶液梯度洗脱，分部收集，可得三个多糖组分，其糖醛酸的含量依次升高，分别为,(,,,、,,(,,,和,,(,,,。对于第一组分和第三组分再分别经,,,,,,,,, ,,(,,柱层析，用,,,,溶液洗脱，分部收集，结果表明，第一组分的一个产物为葡聚糖，分子量为,,, ,,,，另一个产物为阿拉伯半乳聚糖，分子量为,, ,,,。第三组分的产物是果胶类多糖，主要含半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖以及少量的葡萄糖和甘露糖，并含有较高的糖醛酸，其分子量为,, ,,,。,(,(,(,三种层析柱联用 ,,,掣,,墚用离子交换葡聚糖凝胶柱、丙烯葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用进行了分离当归总多糖的尝试。先进行,,,,(,,,,,,,, ,(,,柱层析，用蒸馏水洗脱，得到,个水洗脱组分。水洗组分进一步用,,,,,;,,, ,,,,,柱层析，得到主要组分再用,,,,,,,, ,(,,,柱层析，最后得到两个单一的多糖组分，一个是由(,,?,)(,(,(,,;组成的线性葡聚糖，另一个是由(,,?,)(,(,(,，;和(,叶,)…,, , ,,;按,:,比例组成的多糖。 凝胶柱层析是分级制备当归多糖的常用方法，进行大量制各时应充分考虑装柱的最大负荷，即极限负荷。加样体积越小，多糖之间分离效果越好:制备时样品量的加大，易造成分辨率下降，使收集的多糖组分出现混合交叉而纯度不够的情况。因此，在分离量较大时则应考虑采用其它方法，如先进行分级沉淀，尔后再通过凝胶柱分离。另外，超滤法是一种快速、简便、高收率的分级纯化方法，在纯化的同时还可以进行多糖的脱盐、多糖溶液的浓缩和多糖分子量的测定，是一种很有发展前途的纯化当归多糖方法。 第„章文献综述,(,黄芪多糖的提取工艺研究进展 黄芪是豆科植物蒙古黄芪,,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,(,,,;,),,,(,,,(,,,,,,,,;,,(,,,(),,,,,或膜荚黄芪,,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,(,,,;,),,,(的干燥的根。原名黄耆，始载于《神农本草经》，列为上品，迄今己有两千年应用历史。黄芪性甘、微温，入肺、脾经，有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌等功效。黄芪中的活性成分种类繁多，已报道的有多糖、皂成、黄酮、氨基酸、微量元素、核黄素、叶酸、香豆素、有机酸、胆碱等。而其中多糖、皂甙和黄酮类等是黄芪的主要活性成分。目前临床常用制剂有:黄芪多糖冲剂、黄芪多糖注射液、黄芪注射液、黄芪水煎液和黄芪合剂等。黄芪多糖的提取方法主要有水煮醇沉法、碱浸提法、微波提取法、超滤法、酶法提取等，其中水煮醇沉法应用最广。不同学者对影响黄芪多糖得率和含量的因素进行了考察，研究结果存在较大差异。,(,(,水煮醇沉法 封士兰等,,,,通过正交实验得出黄芪多糖水煮醇沉的最佳工艺:药液比重为,(,,时用,,,乙醇沉淀，喷雾干燥。该方法得到的黄芪多糖不仅含量高，而且灰分低，水份低，粒度小，不需要粉碎。 陈芳艳等【, ,】以黄芪为原料，采用水煮法提取黄芪多糖，并用苯酚(硫酸法测定提取液中黄芪多糖的含量，结果表明:最佳的提取时间为,, ,,,，提取温度,,,,,，浴比,:,，提取两次的效果较好。倪艳等,,驯则得出黄芪多糖水煮醇沉的最佳工艺为以加,,倍量水，提取,次，每次,(,,。孙瑞敏等,,州改进了传统水煮醇沉从黄芪中提取多糖的方法，在,,，,,(,,。,之间进行提取，避免将多种物质同时提出，使提取物的组成单一，提取物的纯度能达到,,,以上，提取收率可达到,,,。杨德勇等〔,,,以浸提液中的总糖含量为指标，试验研究浸提工艺参数对黄芪多糖水提效果的影响，试验结果表明，黄芪颗粒粒度、浸提温度对黄芪多糖浸提效果影响显著，,,?,,?,,”,浸提温度下的黄芪总糖含量最高，物料粒径,,(,,,(,,目)时浸提液中的黄芪总糖含量,,,,,?,,一;浸提,, ,,,后浸提液中黄芪总糖含量达到平衡状态;液固比对黄芪多?墙 嵝Ч 挠跋觳幌灾 ,跤 龋桑辏欤识曰栖纬 ?邸?栖纹胀ù址鄣亩嗵翘崛×拷 辛瞬舛ǎ 峁 獾没栖纬 ?邸?址鄱嗵堑奶崛?史直鹞 矗 叮梗ズ停 ?劢洗址鄱嗵翘崛?侍岣吡耍?,,(,,,。,(,(,碱浸提法 李玻 保叮ィ 红民等【,,,分别用水、氧化钙水溶液和碳酸钠水溶液提取法制备黄芪多糖粗 , 第„章文献综述提物，以苯酚(硫酸法测定多糖含量。结果,,,水溶液提取收率最高(,,(,,)，是水提取法收率(,(,,)的,(,,倍，是,,,,,,水溶液提取收率(,(,,)的,(,,倍。田洛等【,,】采用醇碱法提取黄芪多糖，利用单因素实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 得到醇碱提取法提取黄芪多糖的最佳条件，研究表明:料液比为,:,,，,,,,,的,,碳酸钠乙醇溶液，,,?提取,,,,,，提取率为,,(,,,，残渣中多糖成分的残留量最低，提取效果较好。,(,(,超滤法 研究发现水煮醇沉法提取的黄芪多糖粗提物，含量均在,,,右，含量偏低，而得量较超滤法高，说明杂质多;而用截留分子量, ,,,以上中空纤维超滤处理的超滤法较水煮醇沉法提取的多糖粗提物，收得率低，而含量高，达,,,左右，较水煮醇沉法增,,,,,左右,,,,。,(,(,酶法 郑立颖等【,,】为了提高黄芪有效成分的提取率，分别用,(,,、,(,,和,(,,纤维素酶预处理后用常规水提法，结果表明:黄芪有效成分的提取过程加入不同浓度的纤维素酶，能够显著提高黄芪多糖的收率，其中黄芪多糖的收率较对照组分别增加了,,,(,,、,,,(,,、,,,(,,。陈学伟等【,,】采用纤维素酶提取黄芪多糖，通过正交实验确定了酶解的最佳条件为,,, ,,,，酶用量,(,,，酶解温度为,,?，提取多糖得率为,(,,,，总糖含量为,,(,,。与传统水煮醇沉法相比，黄芪多糖的提取率有较大提高。,(,(,微波提取法 王莉等,,,,将微波设备应用到黄芪多糖提取中，将盛有黄芪粗粉的烧瓶放入,,,(,型连续微波反应器中，依次用石油醚、乙醚和,,,乙醇回流提取，调整功率,,,,、,,,,、,,,,、,,,,，反应时间,,,,,，处理两次。减压浓缩至一半体积，加入活性炭脱色，过滤，滤液加入,,,乙醇使溶液含醇,,,，静置过夜，过滤，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，得黄芪多糖。该方法的提取反应时间比常规方法缩短了,,倍，多糖得率为,(,,,。龚盛昭等【,,】以水为提取剂，研究了微波辅助提取黄芪多糖的工艺，得到了微波辅助提取黄芪多糖的最佳工艺条件:液料质量比为,,:,;用饱和石灰水调节,,,,;微波功率,,, ,时提取,次，每次提取,, ,,,。该方法提取得到黄芪粗多糖产率为, ,(,,，纯度为,,(,,，与直接加热提取法相比，微波辅助提取能缩短提取时间，降低提取剂用量，并能提高黄芪多糖产率。 , 第?幸文献综述 另外，戴述诚等【,,】应用,,,一澄清剂及其助剂提取黄芪多糖溶液，并与传统的醇沉法工艺作了比较，实验结果表明，,,,(澄清剂及其粉末助剂，完全可取代乙醇对黄芪多糖溶液进行提取处理，并且具有比醇沉法工艺短、成本低、不用增加回收设备、还不损失有效成份多糖等诸多优点，显示了其无比的优越性。,(,本课题研究的目的和主要内容,(,(,本课题研究的目的 本课题研究的主要目的是建立一种简单、快速、有效的当归多糖和黄芪多糖提取纯化方法，同时探讨多糖质量控制中糖含量和蛋白含量的测定方法和对该方法进行评价。该研究为其进一步药效学研究和多糖结.