HIV感染窗口期检测技术研究进展

HIV感染窗口期检测技术研究进展 HIV感染窗口期检测技术研究进展 社区医学杂志2007年第5卷第23期 HIV感染窗口期检测技术研究进展 吴书志梁浩(广西医科大学公共卫生学院&艾滋病研究中心广西南宁530021) [摘要]人类免疫缺陷病毒(HIV)具有极高的突变性,且临床没有安全有效的治疗方法.目前主要措施以预 防为主,所以应尽早发现感染者,并控制其流行.然而,血清免疫学实验作为实验室诊断HIV的主要依据,窗口期的 存在给HIV检测带来了一定的困难.本文综述了实验室检测HIV血清学最新方法,聚合酶链反应的基因诊断技术, HIVP24抗原测定,以及病毒培养,流式细胞技术在窗口期的运用.进一步缩短了窗口期时间,对于防治艾滋病流行 有重要意义. [关键词]HIV;免疫缺陷;艾滋病;窗口期;检测技术 [中图分类号]R512,91[文献标识码]A[文章编号]1672—4208(2007)23—0026—03 获得性免疫缺陷综合征,简称艾滋病(AIDS),是由人 类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染 所引起的一种严重的传染性疾病.自1985年我国发现首 例AIDS病人以来,呈加速流行的趋势,疫情正在从高危人 群向一般人群传播.截止到2005年底,我国估测存活的 HIV感染者有65万;预计到2010年,如控制不力可能达到 1000万,疫情非常严峻…,由于目前尚无有效的预防疫苗 和根治艾滋病的药物,所以早期检测,早期治疗才能最大限 度减少对社会的危害.HIV抗体检测是HIV感染病原学检 测最常用的方法,但血清抗体的出现一般发生于病毒急性 感染后的第2周到12周,在抗体未产生之前或者没有 检测到抗体出现的这个时期称为感染后的"窗口期".此 期用一般的检测方法不能作出诊断.但在这段时间,感染 了HIV的人可将HIV传染给他人而自己没有任何病征,而 成为HIV的传染源;这样随着HIV的流行,在社会上会积 累越来越多的未被发现的传染源.所以,窗口期检测技术 的深入研究对控制艾滋病的流行尤为重要. 1抗体检测 窗口期包含两个方面的意义:一是在此期机体自身是 否真正针对HIV产生特异性的体液免疫而产生HIV抗体. 微生物感染机体后1周左右最先产生IgM抗体,随后出现 IgG;二是如果有抗体产生,但是所使用的抗体检测试剂敏 感度不够,仍检测不出抗体,也被归为处于窗口期.可见提 高检测HIV抗体试剂的敏感性对尽早关闭窗口期很有潜力 可挖,纵观HIV抗体酶联免疫诊断试剂的发展,20世纪80 年代初第一代诊断试剂的窗口期大约是3个月;到80年代 中期,由于使用重组活合成多肽抗原,敏感性比第一代试剂 有所提高,窗口期平均比第一代试剂缩短20.3天;为进一 步提高试剂的敏感性,1994年发展了第三代HIV抗体初筛 试剂,反应模式由第一代和第二代的问接法改变为双抗原 夹心法,酶标记物由抗人IgG改变为特异性HIV抗原,可以 检测HIV不同的抗体亚类,包括IgG,IgM,IgA等,第三代试 剂比第二代试剂检出HIV抗体的时间提前4,9天;90年 代末有了第四代试剂,同时检测HIV1/2/O抗体和p24抗 原,称为HIV抗抗体试剂,抗体部分检测的敏感性和特 异性与第三代试剂持平,由于加入抗原的检测可将窗口期 缩短7,9天.,所以随着抗体检测试剂的发展,窗口期 也在逐渐缩短,但是毕竟检测的是血清抗体阳转以后的"事 件",另外,出生18个月内的婴儿有来自HIV阳性母亲的 HIV—IgG抗体,若用抗体检测法检测出婴儿抗体阳性,也 不能判断婴儿是否感染HIV.因此,血清学抗体检测方法 . 虽是目前HIV诊断的金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,但也存在一定的不足. 2核酸检测 聚合酶链反应(PCt{)技术是一种以核酸生物学为基础 的分子生物学诊断技术,自1985年问世以来,已成为生物 医学领域最有价值的研究手段之,.随着这项技术的不断 完善,应用PCR技术检测HIVDNA或RNA已成为窗口期 检测技术的焦点.由于HIV独特的生物学特性和高变异 性,HIVDNA的扩增需要应用巢式PCR技术,从以前HIV 单一保守特异区段扩增,到现在发展至~~nsl,gag,pol三个保 守特异区同时扩增,大大提高了敏感性和特异性,这种方法 简便,快速.但是,由于需要开盖取样电泳,加之PCR方法 本身的敏感性极高,很容易导致"污染",出现假阳性结果. 另外,HIV基因的多样性,没有一套引物可以覆盖所有的 HIV序列,使检测的敏感性又受到限制.最近,荧光实时 PCR检测技术的应用使PCR的发展进人到一个新境界. 传统的PCR扩增以后,最后进行终点(endpoint)检测,而荧 光实时PCR,则可以进行实时(realtime)检测.其原理 是:使用荧光基团标记探针,5端标记荧光基团,3端标记 淬灭基团,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团 空间距离很近,使荧光集团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩 增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧 光标记的探针与模板结合的位置位于上下游引物之间,利 用Taq酶的5一3外切酶活性,将荧光探针水解而发出荧 光.进而被荧光探头检测到,这样就实现了"实时"检测.一h 述即为TaqMan探针.另外一种荧光检测方法是使用Syh,". Green荧光染料,SybrGreen可以和双链DNA结合,PCR扩 增得到的产物越多,则SybrGreen结合的越多,发出的荧光 越强,但是,SybrGreen染料并不能区别开目的产物和非目 的产物,特异性不如TaqMan探针好,所以现在广泛使用的 是TaqMan探针技术.荧光实时PCR检测技术的应用,可 以进行实时监控,以及定性,定量检测.样品中待测的DNA 或RNA越高,则S型扩增曲线出现的越早,根据已知拷贝 数的标准品,则可以得到未知样品的拷贝数.荧光实时 PCR检测技术的应用,使得血浆病毒载量的测定方法在原 来的RT—PCR,分支DNA技术(bDNA),核酸序列扩增系 26 社区医学杂志2007年第5卷第23期 统(NAS,BA)基础上,又增加了一种新的方法.该方法可 以检测血浆病毒载量,也可以检测血液中单个核细胞的前 病毒载量.一般来说,前病毒载量与血浆病毒载量是平行 的,具有相关性.但是,经过高效抗逆转录病毒 (HAART)治疗后,血浆病毒载量可能检测不到,前病毒载 量依然可以检测到.依据急性感染后病毒血症发生的机 制,荧光PCR检测技术即病毒载量检测完全可以作为窗口 期的检测技术.定量检测方法的敏感性可达100%,但是偶 尔会有假阳性结果(大约2%,5%),这样的结果一般低于 2000cp/ml,远低于急性感染通常很高的病毒载量,相同的 样本重复检测后一般会得到阴性结果.2006年,美国疾病 预防控制中心的首席研究员PragnaPatel博士在近期的《获 得性免疫缺陷综合征》杂志上报道说,在标准的HIV检测 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 中增加HIVRNA筛查可鉴别出相当数量的原先未被 发现的急性HIV感染者,从而带来重大的公共卫生效益. 我国的荧光PCR检测技术发展迅速,2002年4月国家药品 监督管理局(SDA)批准了第一个HIV荧光PCR检测试剂 盒,由深圳匹基公司生产. 3抗原检测 在窗口期,病毒抗体不能被检出,但可以检测到病毒相 关抗原或分离病毒.抗原能够在个体感染后先于血清转化 2,18天被检测到,因此,通过检测p24抗原可以作为早 期辅助诊断HIV感染的一种方法.HIVp24抗原检测主要 有酶联免疫分析(EIA),放射免疫分析(RIA),免疫荧光分 析技术(IFA),免疫吸附电镜法(ISEM)等技术.其中以 EIA为基础的测定p24抗原技术是检测HIV感染的常规方 法.随着技术的进展,检测灵敏度不断提高,p24抗原的检 测逐渐从主要用于在窗口期辅助早期诊断和进一步缩短窗 口期,发展到用于病毒载量测定.目前,p24抗原在以下几 方面都有重要应用:HIV一1抗体不确定或窗口期的辅助诊 断;HIV一1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断; 第四代HIV一1抗抗体ELISA试剂检测呈阳性反应,但 HIV一1抗体确认阴性者的辅助诊断;监测病程进展和抗病 毒治疗效果.但现有监测病程进展和抗病毒治疗效果均采 用昂贵,操作复杂的病毒RNA测定方法.我国HIV/AIDS 病人绝大部分是在基层,检测一次病毒载量需要上千元(约 1500元),很难在基层普及,对疾病的治疗和控制很不利. 高灵敏度p24抗原检测方法的建立成为在发展国家使用 的病毒载量测定方法的一种选择.近几年国外对建立高灵 敏度检测p24抗原的研究一直没有停止,如为了提高检测 血清中p24抗原的敏感性,将血清中免疫复合物解离后再 进行测定,发展了ICDp24抗原测定法,即免疫复合物解离 (immun—complexdisassociate,ICD).2003年Sutthent等 将免疫复合物热解离后通过TSA信号放大系统使用ELISA 进行检测,使p24抗原检测的最小检出值由原来的10pg/ Hll降低到0.5ps/ml,在HIV一1抗体阳性母亲所生婴儿早 期的诊断中与RNA检测相当,与HIV核酸检测具有可比 性,具有重要的实用价值.2006年,来自于美国和罗马尼亚 的研究人员在近期出版的《医学病毒学杂志》中刊文报道 说,免疫一复合一解离(ICD)HIVp24抗原的平均水平对于 在青少年中预测HIV感染的进程具有决定性意义;这一结 果有可能成为一种替代HIVRNA和CD4细胞计数标准测 定法的廉价方法.美国研究员ClaudiaKozinetz博士及其同 27 事对此指出,为更好地协助那些资源有限的国家对抗艾滋 病的传染,人们应着眼于易被当地医疗工作者使用的技术. ICDp24抗原检测法并非最新,最好的技术,但用于资源有 限的国家要比那些在发达国家使用的高耗费技术更实用. 4病毒培养 病毒培养是检测HIV感染最精确的方法,一般采取培 养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断. 细胞培养的方法检测HIV_l专一性强,不会出现假阳 性,对于确认那些抗原/抗体检测不确定的个体和阳性母亲 新生儿是否感染HIV有着重要的意义.但是病毒培养的方 法必须要有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病 毒来",因而敏感性差,操作时间长,操作复杂,必须在特 定的P3实验室中才能进行,并且费用较高(每次培养需要 约200,500美元),所以很少用于窗口期的检测. 5流式细胞检测技术 在HIV急性感染后,会有短暂而显着CD4+T淋巴细 胞数降低,随后细胞数逐渐升高,但通常不会再达到正常水 平.相反,CD8+T淋巴细胞数从一开始就会升高,因此会 导致CIM+/CD8+<1.所以在有条件的实验室,对有高 危行为的人员进行CIM+,CD8+T淋巴细胞计数检测有助 于发现窗口期感染者". 综上所述,窗口期的各种检测技术有助于?V感染者 的早发现,早诊断,早治疗,以遏制艾滋病的流行,减少艾滋 病对个人,家庭及社会的危害. 参考文献 [1]ChenP.MeasuresneededtostrengthenstrategicHIV/AIDSpreven? tionprogrammesinChina[J].MeasuresAsiaPacJPublicHealth, 2007,19(1):3—7. [2]余勇,肖庚富,李敏,等.人类免疫缺陷病毒一1进人细胞的分 子机制及相关药物的研究[J].生物化学与生物物理进展, 2003,30(1):161—166. [3]ConstantineNT,ZinkH.HIVtestingtechnologiesaftertWodee? adesofevolution[J].IndianJMedRes,2o05,121(4):5l9— 538. [4]WeberB.Anewautomatedfourth—generationHIVscreeningassay withsensitiveantigendetectionmoduleandhishspecificity[J]. 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(收稿日期:2007—10—17) 医疗机构和社区应对流感大流行的 感染防护措施概述 汪滢'曾光(1.北京协和医学院公共卫生学院2005级硕士研究生北京100730;2.中 国疾病预 防控制中心北京100050) 【中图分类号】R511.7【文献标识码】A【文章编号】1672—4208(2007)23—0028 —04 流感潜伏期短,起病急,经呼吸道飞沫传播容易实现, 流感病毒抗原易变异,人群的特异性免疫状况不稳定,对变 异株普遍易感,因此流感流行常呈周期性,并容易迅速导致 世界性大流行,对人群健康和社会稳定产生重大影响…. 在流感大流行期间,疑似病例和确诊病例会去医院和社区 卫生服务站就诊,他们会在不同的社区居住,迁移.虽然接 种疫苗是预防流感,限制传播的基本措施,但众所周知,流 感病毒在不断变异,从发现流感新的病毒株到研制出一种 新疫苗一般至少需要3,6个月的时问J.而在1918, 1919年的流感病毒株,短短3个星期就传播至美国全 境J,如果此传播速度再现,人类将没有足够的时间去生产 和接种疫苗,可见我们不能单纯依靠疫苗来控制流感大流 行的发生.防治流感病毒传播速度和强度的有效防护措施 是在医疗机构和社区中限制感染人群的活动和创建良好的 卫生条件. 1背景 1.1流感病毒的传播模式流感病毒主要通过空气中的 液滴直径>5m)传播J,在流感病人和隐性感染者的呼 吸道分泌物中均含有大量的流感病毒,随说话,咳嗽和打喷 嚏时喷出的液滴散布在空气中,其传染性可保持30分 钟--.病毒液滴不会在空气中停留很长时间,通常只是在 短距离内漂浮(小于或等于1米).由液滴蒸发后的液滴核 有可能远距离扩散.病毒可以直接感染眼粘膜,口鼻粘膜 或呼吸道.另外,手在病毒的传播过程中也扮演了重要的 角色,一方面病毒有可能附着在手上造成直接感染,另一方 面,手也有可能因为接触其他被病毒污染过的物品而造成 间接感染J,因此也曾发现通过被污染的餐具,茶具或 玩具而传播的证据J.在室外环境中,湿度,通风,紫外线 照射等条件都会对病毒在空气中的传播造成影响,因此病 毒更容易在室内传播.流感病毒能在坚硬,无孔的物体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面存活24—48小时,在布质,纸质,棉质物品表面存活8— 12小时.相比之下在手上存活的时间要短得多(大概5分 钟).虽然流感病毒在不同传播模式下的相关作用和 临床意义还未知,但是流行病学研究提出流感病毒最具传 播力的模式是通过密切接触传播".潘锋等认为j,虽 然在咳嗽和打喷嚏时通过大量的飞沫传播被认为是主要的 流感传播途径,但是通过受污染的手传播同样可能是一个 重要的传播途径.掌握这些要点非常关键,它说明适当的 社交距离和隔离措施,良好的手部卫生,个人防护装备的应 用(尤其是口罩)可有效阻止流感病毒传播,比负压病房和 空调的应用更为重要. 1.2人群传染期人群感染流感病毒后一般经1—3天的 潜伏期J,甲型流感病毒H5N1潜伏期可能更长些,大概2 — 4天(可到8天)"J.病人的传染期是12岁以上人 群为7天,学龄儿童为14天,学龄前儿童为21 天'".个体可能从症状开始出现的前一天即具有传 染性,症状出现时传染性最强.研究表明,排毒量和排毒时 间与病情轻重呈正比关系,而且流感的某些症状有利于病 毒的排出与扩散.因此,重症病例的排毒量大,时间长,传 染性强,作为传染源的意义最大….在鸭子和家禽的粪便 中可发现H5N1病毒,在被H5N1感染的病人粪便中也能发 现病毒,但病毒数量要低于呼吸道分泌物. 2感染防护的原则和措施 2.1医疗机构WHO的高级官员和技术专家认为,医 院内感染是一个全球性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,既影响发展中国家,也影响发 达国家.据估计,全球有超过140万人因医院内感染而引 起严重疾病,其中发达国家约为5%至10%的住院患者受 到感染,而在一些发展中国家,这一比例可超过25%.流 感病毒是一种人们熟悉的医院内病原体.瑞士日内瓦 大学医院感染控制规划主任DidierPittet教授认为只要 采用适当的预防措施,各医疗机构的医院内感染控制都可 取得显着效果,能最大限度地减少医院内感染.在香港 1997年的H5N1甲型流感暴发期间,液滴和接触防护成功 地防止了疾病在医院内的传播,WHO建议人隔离防护 措施:在液滴+接触传播基础上,增加呼吸防护,如 N95f. 2.1.1基本防护原则和措施在流感大流行期间,医务人 员应该特别警惕避免用污染的手接触眼睛,口量.我们所 戴的手套常会造成错误的安全感,实际上它可能通过接触 易感粘膜表面而传播病毒.如果防护装备或环境表面被污