质粒抽提的原理和方法

质粒抽提 所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点:如何去除RNA,如何将质粒与细菌基因组DNA分开,如何去除蛋白质及其它杂质。 【如何去除RNA】 去除RNA 相对比较简单,首先是使用RNase 消化(抽提中或者抽提后)。经过RNase 消化后,RNA 变得比较小了,其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得RNA,则需要更烦琐的操作。 【如何将质粒与细菌基因组DNA 分开】 基本上是采用两种办法:一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌,在抽提时只让质粒从细菌中释放出来,而不让基因组DNA 从细菌中出来,从而将质粒和基因组DNA 分开;二是利用NaOH/SDS 完全裂解细菌,让质粒和细菌基因组DNA 都从细菌中出来,再利用质粒和基因组DNA 在变性/复性过程中的不同表现,将质粒与基因组DNA 分开。 【去除蛋白质及其它杂质】 基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是,依据不同的细菌,不同的培养条件,以及操作时的精细程度等,杂质的残留量会不同。所以,通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。 经过上面的处理,沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验,如转染,则需要做进一步的纯化,如CsCl 超离心。 【实验前方法/试剂的选择】 首选方法是碱裂解法。如果有问题,或者是大质粒(>15 kb),则用温和的方法SDS 裂解法。详细情况见“分子克隆”。试剂盒几乎都使用碱裂解法,所以都有一个通病,抽提大质粒时效果不好。 【关于碱裂解法】 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广,快速,纯度高等特点。关于碱裂解法的原理,复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论,大家可以去看一下。这是一篇美文,非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点,也是非常有启发的。 当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性;不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就成为不可逆的了(电泳时在超螺旋前面一点点,如果有一条带,就是此变性的质粒。)。所以,要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间。(似乎可以做这么一个推理:在碱性条件下,质粒的两条链从一点或者几个点开始分开,随着时间的延长,直到完全分开。理论上讲,完全分开的两条链要很快地配对复性,成功率肯定不可能是100%的,而没有完全分开的两条链却完全可能100% 配对复性。) 碱裂解法不适合大质粒的抽提,原因也是因为该方法太剧烈,使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法,缺点是得率要低一些。现在得问题是,大质粒的拷贝数本来就低,如果抽提方法得率再不高的话,抽提起来就很费力了。 如果注意到在碱裂解法中,超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低,随着粘稠度的增加而减低这个现象,完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的:增加试剂的使用量,使加入NaOH/SDS 液后,溶液在 1 分钟内就能变得很清澈;立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过,但QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。 【质粒抽提的8 大窍门】 1:摇菌时间- 过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况。如果出现了问题,调整培养时间会有帮助:Nick 多,则增加培养时间;酶切出现问题,则减少培养时间。 2:起始菌体量- 大家习惯说“从多少ml 菌液中抽提质粒”,但一定要养成每次都观察菌体量的习惯,因为质粒毕竟是在菌体中,而且,抽提质粒所用的试剂量,都只与菌体量有关。 3:菌体的彻底悬浮- 如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在溶液II 加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块。这个团块在溶液III 加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源。 4:使用相对过量的试剂- 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是:稳定性好,纯度高,操作更简单。如果认为这样不经济,就少用一点菌体。 5:裂解时间- 加入溶液II 后,混匀,体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了,马上加入溶液III 中和。如果体系不马上变清澈,下次少用一点菌液,或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了,奇怪的现象也越来越多,而所有的奇怪现象,多与裂解时间有关。 6:中和的操作- 在 1.5ml 离心管中加入溶液III 后,先颠倒两次,使管底朝上,用指头弹击管底数次,再颠倒混匀。效果非常好。 7:中和后的离心去蛋白- 一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面,继续离心的效果并不好;而将上清倒入另外一个离心管中,再离心,效果要好许多。 【降低RNA 残留的方法】 RNA 的去除,首先是使用RNase 消化。在溶液I 中加入高浓度的RNase A (100ug/ml),或者用含25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒,都可以降低RNA 残留,但都不能彻底去除。幸运的是,RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除RNA 残留,可以用试剂盒,或者使用对 4 个碱基都作用的RNase。 【降低gDNA 残留的方法】 gDNA 的残留问题,必须在抽提过程中解决,否则,就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大,越难于复性,也就越容易被去除;所以,一定要尽可能不打断gDNA。裂解体系越粘稠,gDNA 越容易被扯断;操作手法越重,gDNA 也越容易被打断。温和操作,使用相对过剩的试剂,是降低gDNA 残留的最好方法。 【降低蛋白质残留的方法】 蛋白质的去除,主要是靠不溶解的K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于4C 一段时间,可以形成更多的该不溶复合物,从而使蛋白质残留更少,但实践证明这样做并不是必须的,除非是大量抽提。只要加入溶液I 后的悬浮,加入溶液II 后的裂解及加入溶液III 后的中和是均匀彻底的,蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平;而只有溶液的用量足够,甚至过剩,才能确保裂解和中和是彻底的。当然,试剂盒及苯酚的使用,是可以更进一步降低蛋白质的残留的。 【降低质粒Nick 的方法】 细菌收获时间,菌株的选择,抽提操作的剧烈程度是影响Nick 的三个主要因素。细菌收获过早,质粒还在复制过程中,Nick 的比例较高;过晚,细菌开始死亡,杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌,会出现较高比例的Nick。加入溶液II 及加入溶液III 的混匀操作,也可以导致一些Nick,但影响不会比前两者大。 【降低变性超螺旋的方法】 理论上,用碱裂解法抽提质粒,变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意,一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响,二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液,在加入溶液II 后,体系能在 1 分钟内变澄清,再快速加入溶液III,这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。(变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。) 【关于质粒多聚体】 QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察:从有些宿主菌中抽提质粒(pT Z19),电泳能发现很多条带;但使用单酶切后,仍然变成一条带,大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察,可以推理如下:那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的,而不是我的一条链与你的一条链复性在一起;第二,这种“粘”只是部分的,否则酶切会有问题;第三,这种“粘”是脆弱的,线性后的刚性足以打破它。如果是这样,质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关,可以不管它(也管不了),因为它不影响酶切,或者说,即使质粒多聚体切不动,也不会影响太大。总之,碰到这种情况,不要简单地认为有问题,而是应该一步一步往下做,但一定要做完一步,检测一次,看一看结果与预期的吻合程度。 【提高得率的方法】 利用氯霉素抑制染色体的复制,而不抑制质粒的复制这一特点,在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。 从质粒抽提谈起 --------复旦大学生化与分子生物学实验室 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了,几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀 学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因,我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤,而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多,甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书,“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说,你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住,考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化,那么科学是不能在中国真正扎根的,它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验科学,它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了,那我想问有哪位神仙看看书就会骑自行车了?或者听听体育老师的讲解就会滑冰了?可是光动手不思考,不就成了一个工匠?一个合格的生命科学研究者,需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者,是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。每个曾经用碱法抽提过质粒的同学,希望你看本文后能有所思考,让中国的未来有希望。 为了方便理解,这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液: 溶液I:50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0; 溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS; 溶液III,3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液,是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢?说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢?大家知道EDTA 是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是:抑制DNase的活性,和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA,无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢?实话告诉你,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH,即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下),自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS 当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS也是碱性的,只是弱了点而已。很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问,既然是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合(象对待女孩子一样),不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA 的断裂会带来麻烦,后面我再详细 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 。 每个人都知道,溶液III加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉淀的本 质。最容易产生的误解是,当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑,往1%的SDS溶液中加如2 M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现,显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀,那会不会是遇盐发生的沉淀呢?在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl,你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate PDS),而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀。如此看来,溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA 自然容易被PDS给共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢?是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了,这是天大的误会,因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的,DNA分子的变性其实是个副产物,与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III 加入并混合均匀后在冰上放置,目的是为了PDS沉淀更充分一点。不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了,其实还有很多蛋白质不能被沉淀,因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的,这里做个全面的介绍。酚(Phenol)对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液(比如4M的异硫氰酸胍),离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加,其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到-20℃,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子,因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀,就用70%的乙醇多洗几次,每次在室温放置一个小时以上,并用tip将沉淀打碎,就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase(50 ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下你能看到三条带,但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而 排序,分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是20-100 kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是,有时候抽提到的质粒会有7-10条带,这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。这里暂不深究。