高级动物生物化学

高级动物生物化学 核酸的结构与功能 一、分布 (一)DNA的分布 1.真核:主要分布于核中，与蛋白质，少量RNA结合构成染色体或染色体DNA。 此外,线粒体、叶绿体也含有少量的 DNA，细胞器DNA。(细胞核DNA:大， 双链线状。细胞器DNA:双链环状，也 有线状、环形、网格状，无组蛋白，以 裸露的形式存在。人、牛的线粒体(m) DNA:16.5kb;甜瓜线粒体DNA:2600kb; 所以不同生物线粒体DNA数量相差很大。) 2.原核:主要:核区(类核)-染色体DNA(双链环状) 其次:胞质-质粒(小分子、环状{绝大多数}，极少数双链线形存在于螺旋体中) 酵母菌:2um质粒 质粒: (1)a:可整合到宿主染色体基因组当中的质粒叫做附加体(游离型质粒)，如(性)F质粒。 b:非整合型 (2)与宿主关系密切程度: a:严密型:非常密切，1-2个拷贝，复制与染色体复制有关(只有在复制期)，复制时需要DNA聚合酶?。 b:松弛型:不密切，10-200个拷贝，在整个细胞周期都可复制，复制时需要DNA聚合酶?。 (3)根据表型分类: a:降解性质粒:可降解特殊的物质，如甲苯。 b:R质粒(耐药性质粒):产生抗性。 c:F质粒(致育性质粒):存在可转移的基因。 d:coli质粒:可以表达(产生)大肠杆菌素(coliE1) e:毒性质粒:赋予宿主致病性。Ti质粒:根瘤菌、农杆菌。 (4)按特征分类: a:相容性 b:不相容性 (二)RNA的分布 1、真核:主要存在于细胞质-核糖体(粗面内质网{线粒体})，此外，线粒体(m)、叶绿体、核仁中也存在少量RNA。 2、原核:细胞质当中。 3、病毒:只有一种核酸，或者是DNA或者是RNA+蛋白质。 类病毒:只有小分子环状单链RNA，无蛋白质。 (RNA世界:生命的起源是RNA) 阮病毒:只有蛋白质，没有核酸。(由宿主体内的基因组) 二、DNA的结构 (一)、一级结构: 1、狭义:核酸分子中核苷酸的排列顺序。 广义:多核苷酸链的数目、连接方式、形状以及核苷酸的数量和排列顺序。 数目:双链、单链。 形状:线状、环状。 (1)单链线状:犬的细小病毒、牛的细小病毒、小鹅瘟。 双链线状:真核生物染色体。 (2) (3)双链环状:原核生物染色体。 (4)单链环状:Φx噬菌体。 174 2、序列测定: (1)化学法(Maxam和Gilbert)1975 32原理(步骤):对待测的DNA进行5’末端P标记—分离单链DNA?四个反映处理:(【1】G反应:硫酸二甲酯处理，使G的N7位甲基化。【2】G+A反应:88%甲酸处理:使嘌呤N9位质子化。【3】C+T反应:肼处理:使嘧啶开环。【4】C反应:在2mol/LNaCl存在时，肼只使C开环。)再用1mol/L吡啶 3290?30min，被修饰碱基处的磷酸二酯键断裂，产生大小不一的5’断带有P标记的核苷酸的片段?进行高压(4000V直流)变性(7mol/L尿素)PAGE?放射性自显影?读取序列。 (2)酶促法(Sanger)1977双脱氧末端终止法 DNA复制:DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、引物 32步骤:待测DNA(单链、双链均可)5’末端带有P标记的引物(变性、复 性)?引物与DNA模板复性?四个反应体系，加入dNTP，DNA聚合酶，及 32每个体系加一种ddNTP?进行酶促反应，产生终止相应5’端具有P标记的大的ddNTP的大小不一的片段?进行高压变性PAGE?放射性自显影?读取序列。 (3)自动法:(prober)1987:四种荧光染料标记ddNTP。 3、DNA顺序组织: (1)遗传信息:核酸分子中具有功能意义的核苷酸序列。 (2)基因:遗传信息最小的功能单位。 (3)结构基因:具有编码功能的基因。(蛋白质(mRNA)、RNA(tRNA、rRNA)、snRNA、scRNA) (4)非结构基因:不具有编码功能的基因。 (5)DNA顺序组织:功能不同的基因在整个DNA分子中的分布情况。 4、基因组: a:宏观:一个物种的单倍染色体数目。 b:微观:一个细胞中所有不同基因及基因间的DNA总和。 5细菌染色体基因组的结构特点: (1)染色体一般只有一条，双链环状。 6(2)DNA比较小，负载基因数目少(E.coli:4.6X10bp，3000-4000个基因) (3)结构简练，大部分是编码蛋白质。 (4)存在多顺反子，顺反子就是转录单位:从启动子?终止子的DNA片段就是顺反子。结构基因:一个结构基因是单顺反子，两个以上为多顺反子。 (真核:18s、5.8s、28sRNA基因为多顺反子，其它均为单顺反子。) (5)一些功能相关的基因往往是以操纵子的形式组织在一起的。 (6)结构基因的序列是连续的。(真核生物的结构基因多数为不连续的) (7)结构基因无重叠现象。(病毒有严重的重叠现象) (8)结构基因多数为单拷贝，但是rRNA是多拷贝的。 6.病毒基因组的结构特点 (1)只有一种核酸(DNA或RNA) DNA:双链:线:腺病毒、疱疹病毒 环:乙肝病毒、乳头瘤病毒 单链:线:小鹅瘟病毒、犬、牛细小病毒 环:Φx噬菌体 174 RNA:双链(线):流感病毒、脊髓灰质炎病毒 单链(线):轮状病毒 (2)分子小:负载基因数少 (乙肝:4个蛋白质基因，SV40:环形双链5224bp、5个基因) (3)存在有重叠基因:起始密码:AUG GUG (UUG) 终止密码:UAA UAG UGA 4)绝大部分是用来编码蛋白质，极少部分是不转录的 ( (Φx:5386b 不转录的只有217b;T4 DNA:5577b 不转录的只有282b) 174 (5)噬菌体的基因是连续的，但真核细胞的病毒基因不连续。 (6)功能相关的基因往往分布于基因组的一个或几个特定区域。 (7)反转录病毒的基因组为二倍体，其它的都是单倍体。 7真核生物染色体基因组的结构特点 (1)染色体不只一条:DNA分子大，承载的基因数目多 (2)存在重复序列。 根据重复频率可分为: a(高度重复序列:上百万次，重复序列占1-50%，平均占15%，长度不等，几个bp、几十bp、几百bp，碱基分布不是随机的。(主带、卫星带、随体DNA，高度重复序列最主要的特点就是不转录)。(人:Alu有300个碱基对，切开后变成两类130和170，在人体中重复占3-6%)。 b(中度重复序列:10-105次，组蛋白10-40%，肌动蛋白tRNA、rRNA，免疫球蛋白，角蛋白 c(低度重复序列:10次以下，其它蛋白基因，40-80%。(丝心蛋白、卵清蛋白都是由唯一的单基因编码的。) (3)同一基因或功能相关的基因往往是以基因家族形式存在的。 基因组当中，来源相同、结构相似、功能相关的一组基因被称为基因家族。 基因家族的分类: 根据成员多少及发育中是否受到调控 a.简单多基因家族:一个或少数几个相关基因的串联或是散在重复的形式分布于整个基因组中。(5SrRNA、18S-5.8S-28SrRNA)。 简单多基因家族 b.复杂多基因家族:由多个相关基因串联在一起作为重复单位，分布于整个基因组中。 c.发育调控中的复杂多基因家族:(血红蛋白:α基因簇、β基因簇统称为珠蛋白基因) (4)蛋白基因是单顺反子转录的，但个别的多肽类激素基因是多顺反子转录及翻译，而后经剪切生成的。 (5)多部分基因当中存在有内含子。 内含子(Intron):结构基因当中能够被转录，而后又被剪切掉的核苷酸(DNA)序列。 外显子(Exon):与成熟mRNA相对应的核苷酸序列。 断裂基因(割裂基因):真核生物的结构基因通常是内含子和外显子相间排列的断裂式结构。 断裂基因特点: a:不同基因拥有内含子的数量及大小相差悬殊。(胶原基因有40kb，40个内含子:50bp、2000bp，干扰素、组蛋白基因无内含子。) b:外显子和内含子的关系并不是固定的。 c:蛋白质基因的内含子以GT(为首)-AG(结尾)(主)、AT-AC(次)，称为“GT-AG”法则。 (6)高等真核生物基因组中存在假基因:每4个基因序列中就可能存在有1个假基因。 (7)高等真核生物染色体DNA中大部分不转录的，编码蛋白质部分仅占6-7%。 (二)二级结构 +双螺旋:右手:A(75%相对湿度，Na，RNA双螺旋、RNA:DNA杂交链)、B +(天然DNA，92%相对湿度，Na，作用力:氢键、碱基疏水力、离子键，转录活性最高)、C(66%相对湿度，Na+或Li+)„„(体外提取DNA:B型-C型-A型) 左手:Z(磷酸二酯键是锯齿状的，G的C8位于双螺旋外侧，不具有转录活性) (三)反向重复序列(回纹序列、回纹结构、并矢对称):双链DNA中，一条链的某一段核苷酸序列之后的互补链存在着与之序列完全相同，但方向相反的序列，这样的结构就成为反向重复序列。双链打开后，每条链会形成茎环结构，两条链合在一起，就称之为十字架结构。 (四)三螺旋DNA(三链DNA): 1.含义:双链DNA当中，若一条链为全嘌呤，及镜像重复或非严格的镜像重复时，打开的全嘌呤或全嘧啶单链插入到DNA双螺旋大沟中所形成的螺旋结构。 2.类型:(1)YR*Y:TA*T CG*C+(酸性条件下稳定:H-DNA)(2)YR*R(稳定需要二价金属离子*H-DNA):TA*A TA*G-非严格镜像 CG*G CG*A-非严格镜像(Y:嘧啶;R:嘌呤) 3.基本特征: a(在三链形成过程当中，双螺旋中的全嘌呤链与第三条链形成Hoogsteen氢键。 b(第三条链位于双螺旋结构的大沟中。 c(三螺旋中，化学性质相同的两条链呈现出反平行排列。 d(三螺旋中的双螺旋结构与B型DNA类似。 e(YR*Y在酸性条件下稳定，而YR*R型则依赖于二价金属离子，YR*Y三螺旋结构沿着螺旋轴上升0.34nm，旋转角度是31度，而YR*R三螺旋结构沿着螺旋轴上升0.36nm，旋转角度是30度。 (五)三级结构 真核生物染色体DNA:线性双链DNA-200bpDNA(146bp)要缠绕在八聚体(H2A、 )1 3/4圈形成核子体核心，与200bp(54bp)和H1形成的DNAH2B、H3、H4 连接纤维，形成核子体(6个)-螺线体(30nm)(20个)-超螺线体(5-6个)-染色单体。 三、RNA的结构 (一)mRNA 1.原核: (1)多为多顺反子的mRNA。 (2)5’端无帽结构，高等动植物病毒的RNA有帽子结构。(RNA病毒科的(+)小RNA病毒{口蹄病毒}无帽子结构) (3)3’无尾巴结构或仅有少数几个A(腺苷酸)(10个以下)。 (4)分子中无修饰核苷酸。 (5)细菌的mRNA: a(除了以AUG作为起始密码外，还可以以GUG(UUG)作为起始密码。 b(AUG(GUG)上游7-12核苷酸序列存在有AGGAGG中至少三个连续核苷酸，称为SD序列(也叫核糖体结合位点)。(5’为上游，3’为下游)。与16SrRNA3’端CCUCCU序列反向互补(或相识别)。 2.真核: (1)单顺反子。 7(2)5’端有帽子结构:mG5’ppp5’N(A、G)PN。(单细胞只有0类帽子， m(m) 多细胞的生物85%至少要有1类帽子，10-15%有2类帽子) 帽子的作用: a(有利于mRNA从细胞核向细胞质的转变。 b(使mRNA免遭核酸酶降解、 c(使mRNA无核糖体小亚基结合，从而进行肽链合成起始。 e(能被蛋白质合成的起始因子所识别。 (3)3’端有PolyA结构:30-200A。加尾信号:在PolyA的上游10-25个核苷酸处，存在AAUAAA序列，以及PolyA下游存在GU或U丰富区。 尾巴的作用: a(mRNA从核向细胞质转运所需要的结构。 b(提高mRNA在细胞质当中的稳定性。 c(以mRNA为模板通过反向转录为cDNA，以oliog(dt)作为引物。 6(4)近5’和3’端的非编码区存在有mA(氮6甲基腺嘌呤)。 (5)Kocak序列:在AUG上游存在ANN，ANNAUGG(Kocak序列)，这就是核糖体的结合位点。 (二)tRNA 1.一级结构 (1)一般为74-95核苷酸，多为76核苷酸，4s。 (2)有较多修饰(稀有)核苷酸或碱基。 (3)3’端有CCA。 (4)5’端多为G，少数为C。 (5)约20左右位置的核苷酸是固定或半固定的。 (6)53-57位存在有GA2ΨCG(与5srRNA相识别区域，5s原核，5.8s真核)序列，在真核生物的起始tRNA中GA2ΨCG或GAUCG能取代。 2.二级结构:三叶草(主)，二叶草(牛线粒体中SertRNA) 3.三级结构:倒“L”型。 (三)rRNA 1.5s rRNA 从结构上:a 真核型:120个核苷酸，高等动植物116-118个核苷酸。 b 古细菌型:121Nt。 - c G型:120Nt + d G型:116-117Nt (1)E(col:a 120Nt b 2个保守区域:43-47位:CGAAC序列。 c 67-80位:GCGCCG(A)AUGGUAGU系列，与23srRNA143-154 位相识别。 (2)真核:a 无CGAAC b 在45位附近有GAUC序列，与起始tRNA相识别。 2.5.8s rRNA (1)约160Nt (2)含有核苷酸。 (3)存在CGAAC序列。 3.16s rRNA (1)1475-1544Nt(E，coli 1542Nt) (2)含有修饰核苷酸。 (3)E(coli:a 3’端存在ACCUCCUUA与SD序列反向互补(或相识别)。 b 3’端有一段与23s rRNA相识别区域。 4.18s rRNA (1)约1900Nt，酵母:1789Nt。 (2)3’端与16s rRNA具有同源性，但是没有CCUCCU序列。 5.23s rRNA E(coli:(1)2904Nt fMet(2)1984-2001位:与tRNA相识别序列。 (3)143-154位:与5s rRNA67-80位相识别。 (4)3’，5’端存在着与其它真核生物5s rRNA相对应的序列。 6.28s rRNA (1)5000Nt 四、核酸的性质 (一)溶解性:微溶于水或不溶于水，但其盐易溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙醇和异丙醇来沉淀RNA和DNA。50%的乙醇DNA沉淀，75%的乙醇RNA 沉淀。 (二)紫外吸收性:260nm，光程=1cm，定性和定量，(双链DNA浓度50ug/ml，OD值=1;RNA浓度50ug/ml，OD值=1.1)。纯度:DNA:OD/OD=1.8时纯260280度可以。(酚紫外吸收大，小于1.8有蛋白质和酚存在。) (三)碱水解性:RNA(0.3-1mol/lL的KOH(NaOH)+HO)?2’3’-环苷酸2 (+HO)?2’或3’核苷酸DNA(不+HO)?抗稀碱 22 (四)颜色反应 1.DNA(在酸性条件下，加热发生水解，首先作用糖苷键，然后作用磷酸酯键)?脱氧核糖(酸条件，加热，脱水)?ε-OH-γ-酮-戊醛(加二苯胺，加热)?兰 2.RNA(在酸性条件下，加热发生水解)?核糖(酸条件，加热，脱水)?糠醛()(3，5-二羟基甲苯，FeCl为催化剂，加热)?绿 3 (五)与溴化乙锭作用。小分子，插入核酸的碱基对之间，在紫外的照射下，产生橙红色的荧光。 (六)催化性质 1.脱氧核酶(deoxyribozymc) 作用:(1)切割RNA (2)切割DNA (3)具有激酶的活性 (4)连接酶的活性 (5)卟啉环化金属螯合反应 2.核酶(ribozyme):具有催化功能的RNA。 分类:催化反应种类: (1)?类内含子的自我剪接型核酶。真核:mRNA、rRNA、tRNA;真菌(含 2+2+量丰富);植物的线粒体(含量丰富)、叶绿体。需要金属酶:Mn、Mg。需要鸟苷类化合物(鸟苷、GMP、GTP、GDP)。 (2)?类内含子的自我剪接型核酶。植物线粒体、叶绿体，真菌中。需要 2+Mg，不需要鸟苷类化合物。形成套索状内含子，内含子内“A”的z’-OH进攻外显子与内含子的连接处，外显子的3’端产生-OH，A的2’-OH与内含子的5’端的磷酸形成2’，5’磷酸二酯键。 (3)自我催化剪切型核酶。植物类病毒，植物病毒当中的卫星RNA中，肝类δ病毒RNA。 (4)异体催化剪切型。Rnasep，tRNA前体加工。 2.核酶 分类: 应用: (1)建立一套限制性内切核酶(4个碱基，特异性比DNA限制性内切酶{6个以上碱基}低)。 (2)作为抗病因子。 (七)反义RNA 1.概念:能与特定的RNA主要是mRNA互补结合，能抑制特定基因复制和表达的RNA片段，称作反义RNA。 2.作用方式及位点 (1)复制水平:与引物结合 (2)转录水平:抑制基因表达。作用于mRNA或其前体抑制完整mRNA的转录。 (3)转录后水平:抑制mRNA的加工成熟。 a 5’端的帽子形成位点 b 3’端polyA的形成位点。 c 作用于外显子与内含子的连接位点。 (4)翻译水平:作用于核糖体的结合位点(SD序列、kozak序列)。 a 作用于mRNA5’端的非编码区-SD序列。 b作用于mRNA5’端的非编码区-kozak序列。 c 作用于mRNA5’端的AUG序列。 3.作用特点: (1)既可以在细胞核中起作用，也可以在细胞质中起作用。细胞质中作用于5’端的反义RNA比3’端的作用强。 (2)对细胞内外源基因均起作用。 (3)具有种属特异性。 4.应用 (1)用于在分子生物学领域研究某种特定基因的生物学功能。 (2)用于疾病的治疗。 (3)在动植物育种上进行品种改良。 五、DNA的复制 (一)复制起点、方向与速度 1.起点:位置是固定的。特定的核苷酸序列:富含A=T且含有重复或反向 重复序列。(A=T丰富具有什么特点)(E.col:84分钟处是复制起点，起点有245bp长，其中有13bp重复3次，9bp重复4次) 2.方向 (1)双向等速:绝大多数DNA。 (2)双向不等速:枯草杆菌DNA。 (3)单向复制:少数，腺病毒DNA、真核生物环状DNA。 (二)复制的主要方式 1.双链线性DNA:(眼型或泡型) (1)单一起点的单向复制:腺病毒。 (2)单一起点的双向复制:T噬菌体。 7 (3)多个起点的双向复制 4.线状DNA末端的复制 (1)T、T噬菌体。末端存在重复序列(160bp) 47 (T7 DNA 的复制:a 线性DNA3‘端的不完全复制。b 多联体的形成及复制的完成) (2)痘病毒:双链末端为突环结构。 (3)腺病毒:双链的每一条链的5’端存在末端结合蛋白，而且两末端存在有反向重复序列。 (4)真核生物染色体DNA:端粒。 (1)端粒:真核生物染色体末端的序列，其生物学功能是维持染色体的稳定以及决定细胞的寿命。 端粒的结构:是十分简单的串联重复序列。(人和脊椎动物:AGGGTT。四 膜虫:GGGGTT、GGGGTTTT。面包酵母:GT、GA。均富含G) 1-31-8 (2)端粒酶:能够使端粒延伸的含有RNA的蛋白质复合体，其所含的RNA的长度大约150Nt，其中含有1-5个拷贝的CA序列作为合成端粒TG链yxxy模板，因此端粒酶是一种反转录酶。 (3)端粒的合成:只有生殖细胞中端粒酶有活性，体细胞的端粒酶中没有活性。 端粒的合成过程: (1)杂交与聚合:端粒酶通过其内部的RNACyAx序列与端粒的TG链互补结合，然后根据模板RNA的碱基序列使TG链延伸。 (2)移位杂交，再聚合:当端粒的TG链延长一个拷贝重复序列后，延伸的TG链回折，以Hoogteen(G=G)碱基配对形成发夹结构即尺hu结构(模型)，从而使端粒酶移位。端粒酶内部的RNACyAx序列再与TG链配对或杂交，进而进一步延伸TG链。如此循环使端粒不断延伸。 (3)CA链的合成:当TG链延长一定长度后，末端回折形成发夹(尺hu、颈环)结构，从而使末端成为合成CA链的引物，在DNA聚合酶的作用下，以TG链为模板，合成CA链。 (4)端粒的成熟:由核酸内切酶、连接酶等参与，使端粒成熟。 2.双链环形DNA的复制。 (1)θ型:E.coli (2)滚环型:Ψx174噬菌体(单链环状5386bp)(RF?、RF?) (3)D环型:线粒体(环)、(双链线型:四膜虫:染色体DNA双向复制、草履虫:3’端5’端连上，作为起点，复制完再切开，属于单向复制)。 3.真原核生物DNA复制的区别: (1)真核生物DNA复制时有多个起点(多个复制子)，原核生物复制起点只有一个(单复制子)。真核生物复制时包含组蛋白的合成。 复制子:能够独立复制的基本单位。 (2)真核生物染色体DNA在尚未完全完成复制之前，不能重新开始新的复制。而原核生物在快速生长期(对数生长期)，可以有一个复制起点，但有多个复制叉。 (3)真原核生物在复制的速度、RNA引物的长度、冈崎片段的大小均有差异。 复制速度:原核生物105bp/min;真核5x102-3bp/min。 RNA引物:原核生物40-50Nt;真核(哺乳动物):10Nt。 (果蝇:有几千个起点，2-3min一代。 E(coli:一个起点，40min一代。) 冈崎片段:原核1000-2000bp;真核:小于等于200Nt 六、反转录(1970年) (一)反转录病毒RNA:二倍体(两条相同的RNA分子)，70S，+RNA，但不能作为模板。5’端:帽子结构。3’端:polyA结构。5’端依靠非共价键结合)，此外还含有tRNA(4S)(作用:反转录的引物)。 (二)反转录过程:RNA:5’端3’端有重复序列及类似重复序列。以RNA为模板合成的双链DNA就是前病毒，可以整合到宿主的染色体DNA中。 七、转录 (一)转录单位(顺反子) 转录单位:从启动子到终止子的一段DNA序列。 启动子:能够被RNA聚合酶识别负责转录起始的特定的核苷酸序列。 终止子:能够被RNA聚合酶识别负责转录终止的特定的核苷酸序列。 不对称转录:一个转录单位中。只有一条链作为模板合成RNA，该链模板链(无意义链)，则另一条链称为编码链(有意义链)，这种转录方式称为不对称转录。 (二)原核生物DNA的转录 1、RNA聚合酶:只有一种αββ’ωσ。α负责酶的装配，β酶的催化中22 心所在，β’酶的结合中心(与底物结合)，σ识别启动子。 2、启动子的结构: 1)-10区(-7—-10区):TATA盒(Pribnow box)，序列为TATAAT。 ( (2)-35区:TTGACA。Sextama框(盒)。 (3)+1区:90%以上是嘌呤，常见的序列为CAT，(A为+1的位置。) 3、启动子的特点: (1)对于一个启动子而言，-10区、-35区序列与上述序列一至，就是一个强启动子，通过改变一至就叫上升突变，通过改变差异越来越大就叫下降突变。 (2)-10区与-35区间距一般为16-19b(90%)。 (3)间距17?1b，增大或减小两者的距离，启动效率均下降。 4、终止子的结构: (1)强终止子:不依赖ρ因子的终止子。特点:存在不含G?C的反向重复序列(7-18b)，两者间隔6-12b，其后为连续的4-8个T。 (2)弱终止子:存在反向重复序列，但G?C不丰富，其后也无连续的T。 (ρ因子是四聚体的寡聚蛋白。作用:打开杂交链;NTP酶的活性(水解NTP【主要是水解ATP】，跟踪RNA聚合酶);结合到新合成的RNA链的5’端，通过水解NTP供能，在RNA链上移动，跟踪RNA聚合酶。) 5、抗转录终止作用:由于不同的生理需要在转录过程中，RNA聚合酶遇到终止信号时，将其忽略，继续进行转录，这种作用叫做抗转录终止。 作用方式: 1)破坏终止子的茎环结构:色氨酸操纵子里的衰减子。 ( (2)依赖于蛋白质因子的抗转录终止:λ噬菌体，编码一种N蛋白，同时 4需要E.coli中的蛋白:NusA、NusB、S、2.5×10蛋白，在转录终止子的10 附近有一个NuS位点:CGCTCTTA(box)。N蛋白识别反向重复序列(终 4止子)的茎环结构并与之结合，NusB、S、2.5×10三者要结合于NuS位10 点上。NusA(两个结合位点)一个与N蛋白结合，另一个与RNA聚合酶结合，使RNA聚合酶变构，从而继续转录。 6、产物的加工: (1)mRNA的特点: a、多顺反子:3000-8000Nt 单顺反子:150Nt b、半衰期:细菌只有几分钟。外切酶从5’端开始降解。 c、转录与翻译是偶联的。 d、除个别(E.coli、T、Φ)外，转录和翻译是不需要加工的。 480 (2)tRNA的特点: a、多个tRNA基因串联?前体tRNA。 b、与rRNA基因串联?前体RNA。 Tyr(3)tRNA前体加工:tRNA a、从tRNA大前体中切出tRNA前体。 b、由RNaseF(核酸内切酶F)切除3’端冗于序列。 c、由RNaseD(外切酶)切除3’端多余核苷酸(7b)。 d、由RNaseP(内切酶)切去5’端多余序列。 e、由RNaseD(外切酶)切除3’端多余核苷酸(2b)，暴露3’端CCA结构。 f、核苷酸的修饰:碱基的修饰、糖的修饰。 g、无CCA则需要由tRNA末端转移酶催化，2CTP、1ATP在tRNA3’端加上CCA。 (4)rRNA前体的加工: 特点:与tRNA串联。 加工: a、由RNase?(双链RNA，产生粘端的酶)从原始转录产物中切出。 b、再由相应的rRNA成熟酶M、M、M负责加工成熟。 16235 c、核苷酸的修饰。 (三)真核生物 1、RNA聚合酶:三种: 分布 产物 α-鹅膏蕈碱 金属离子 -32+RNA 聚合酶? 核仁 18s-5.8s-28srRNA 不敏感>10M Mg -9-82+RNA聚合酶? 核质 mRNA(HnRNA)SnRNA 非常敏感10-10 Mn 2+RNA聚合酶? 核质 tRNA 5srRNA SnRNA 中度敏感 Mn 2、顺式调控元件:与结构基因串联的对基因转录的精确起始和活性调节，起着举足轻重作用的特定的DNA的保守序列。 3、反式作用因子(转录因子):是指位于不同或者相同染色体上相距较远的基因所编码的通过与顺式调控元件和RNA聚合酶相互作用，调节基因转录活性的蛋白质因子。 (1)种类: 1RNA聚合酶?:UBF、SL 11? 2RNA聚合酶?: ? 基因分为两类: a、当家基因(在所有组织细胞都表达，没有区别。TF?A-F、S)。 b、可调节基因(在某种特定细胞或发育阶段表达的基因【白蛋白-肝细胞】)。 3RNA聚合酶?:TF?A(5srRNA基因特有)、TF?B、TF?C。 ? (2)结构域(基序) 1与DNA结合的结构域: ? a、锌指结构:约23个氨基酸残基由Cys、His组成的四面体中镶嵌“2n”，两个锌指的间距7-8个氨基酸残基。锌指可以插入双螺旋的沟中。 b、螺旋转角螺旋(HTH):两个α-螺旋(含碱性氨基酸)借助β-转角连接。 2与蛋白质结合的结构域: ? a、螺旋-环-螺旋(HLH):40-50个氨基酸残基中存在两个双亲的α-螺旋，两者之间为一段连接肽，其中靠近N端的α-螺旋的附近存在碱性氨基酸的区域。 b、亮氨酸拉链:N-端约30个残基，含有碱性氨基酸。这30个氨基酸之后每隔6个氨基酸残基含有一个亮氨酸形成α-螺旋，亮氨酸侧链位于同侧。两个如此结构的肽链相作用，亮氨酸以肩并肩形式排列，如同拉链一样。 3转录激活域 ? a、酸性结构域:富含Asp(D)、Glu(E)。 b、Gln结构域:富含Q。 c、脯氨酸结构域:富含P。 4、RNA聚合酶?的转录作用: (1)启动子的结构:近启动子(决定转录起始的精确位置):-40—+20;远启动子(决定转录起始频率):-170—-110。富含G、C且两者的同源性高达85%以上。 (2)转录的启动程序: 1UBF(单体蛋白)各一分子与近、远启动子结合。 1? 2SL(寡聚蛋白)各一分子协助UBF与启动子结合，并延伸了DNA的覆盖11? 区域。 3RNA聚合酶?与近启动子结合。 ? 从而转录可以起始了。 5、RNA聚合酶?的转录作用: (1)启动子的结构:(2转录精确起始，3-5影响转录起始频率) ??? 1+1:大多数为A，少数为G。若干嘧啶-嘌呤(+1)-若干嘧啶。 ? 2-25区(-20—-30区):TATAT(A)AT(A)，Hogness。(转录精确起始) ? 3-75区(-70—-80区):CAAT序列，全序列为GGT(C)CAATCT。 ? 4-80—-110:GC盒(不是所有基因都有，只有当家基因中才有)。GCCACACCC? 或GGGCGGG。 5八聚体元件:ATTTGCAT(TATA盒)。 ? 6有的含有增强子:能够强化转录起始的序列称为增强子(强化子)。 ? 增强子的特征:序列一般比较大;可以离所作用基因很远，有时可以相距几千个碱基对再起作用;没有方向性;位置不固定，可以在所作用基因的上游或下游或基因内部，大多数在上游;具有组织特异性;具有相位性(与DNA双螺旋的空间方向性有关);顺式调节，只对同一染色体上基因起作用。 (2)启动子程序: 6.RNA聚合酶?的转录作用: (1)5sRNA基因的启动子结构。 1A盒:+50—+60 AGCCAAGCACG ? 2C盒+61—+83 GTCGGGCCTGGTTAGTACTTGGA ? (2)tRNA基因启动子的结构 1A盒:+9—+18 RRYNNARYCG(R-嘌呤，Y-嘧啶，N-任何碱基) ? 2B盒:+53—+61 GTTCRANNC ? (3)SnRNA基因的启动子结构:mRNA有着相似启动子的结构。内部的A盒。 (4)转录启动程序 1转录因子:3种(TF?A-C)(A:5srRNA基因特有:既可以与启动子序? 列相识别与结合，又可以与5srRNA序列CCUGG序列结合，可以通过5srRNA的量来自我调节5srRNA基因的转录;B、C共同) 25srDNA的转录 ? 3tRNA基因的转录(4sDNA) ? (5)终止子结构:在连续寡聚T(3个以上)的两侧为G、C丰富区。 7.转录产物的加工: (1)tRNA前体的加工: 15’、3’端冗余的序列由核酸内外切酶切除。 ? 23’端无CCA，则由tRNA末端核苷酸转移酶催化加上CCA。 ? 3内含子的剪切与外显子的连接 ? 内含子的剪切:内含子通过自身的空间二级结构进行自我剪切产生5’端的外显子的3’端为2’3’环核苷酸，而3’的外显子的5’端则为羟基。 外显子的连接: a.5’端外显子的3’端由磷酸二酯酶催化，3’磷酸酯键水解，产生3’羟基。 b.3’端的外显子由激酶催化ATP，使5’端磷酸化。 c.RNA连接酶在于ATP作用形成连接酶-AMP复合物，然后AMP要与3’端外显子的5’端磷酸相连，形成ADP-外显子的复合物，继续再由连接酶催化3’端外显子5’端外显子的3’-OH与5’磷酸相连,这样外显子就连接在一起了。 d.由磷酸酶催化水解掉外显子上2’磷酸。 4碱基或核苷酸的再修饰 ? (2)rRNA前体的加工(18s-5.8s-2.8srRNA是多顺反子转录) (3)mRNA前体的加工 15’端加帽:pppNpNpN„„(在磷酸酶的作用下水解掉一个磷酸)?? ppNpNpN„„(鸟苷酸转移酶的催化下GTP?ppi)?GpppNpNpN„„(在 5’甲基转移酶催化下SAM?SAC)?mGpppNpNpN„„(在甲基转移酶催化下 75’SAM?SAC)?(1类帽子)mGNmpppNpNpN„„(继续甲基化)?(2类帽 755’’子)mGpppNmpN„„ 2加polyA(由polyA合成酶催化(30-200A)) ? 加尾信号:polyA上游10-25处AAUAAA，下游GU或U丰富区。 3内含子的剪接 ? 主要GT„„AG(在AG上游20-50个核苷酸内有个A，为分支点。) 次要AT„„AC 剪接过程: a、组装剪接体 *1、UsnRNP中的U与5’端剪切位点结合，保护了内含子5’端15个碱基配11 对变成双链。 *2、UsnRNP，UAF(UsnRNP的辅助因子)与分之点下游的嘧啶区域结合形222 成复合物E。在UAF的协助下，UsnRNP就结合于分支点，形成A。 22 *3、U、U/U三者的复合物要结合于复合物A上，形成的复合物叫B。此时5461内含子的5’端和3’端就带到了一起。U也能够和3’端剪切位点配对，此时1 U、U、U、U、U都结合到前体上，组装完成。 12456 b、内含子剪接 *1、U与5’端剪切位点的外显子作用。 5 *2、由ATP水解供能，使U与5’端剪切位点的碱基配对解开，U就离开了11剪切体，形成复合物B，U与mRNA前体的碱基配对延伸至5’端剪接位点内。 25 *3、U和U的碱基配对解开释放出U的催化活性。 466 *4、U与内含子5’端剪切位点配对，同时还与U配对，U和U就构成了剪6226切体的催化中心。 *5、分支点A的2’-OH攻击5’端剪接位点释放出5’端外显子，5’端外显子的3’-OH在攻击3’端剪接位点，从而把两个外显子连接在一起。 *6、连接在剪下来的套索状内含子上的U、U和U被释放出来，剪接到此256结束。 643’、5’端非编码区:A?mA ? 5RNA编辑: ? a、碱基的改变(碱基的替换):C?U、A?I。 b、碱基的插入或缺失:阅读框(ORF)的改变。模板连续C或G，造成G或C的插入或缺失。 八、RNA复制 九、转录的抑制剂 1、概念:抑制转录的物质。 2、种类 (1)嘌呤、嘧啶的类似物:(6-SH-嘌呤;8-N-鸟嘌呤;5-F-U;S-G;2、6-二-NH-嘌呤)嘌呤核苷酸的从头合成 2 1抑制NTPs生成。 ? 2可掺入核酸分子中形成不正常的核酸分子。 ? (2)与模板DNA结合 1放线菌素D:以非共价键形式结合于相邻的GC对间，低浓度时抑制RNA? 的合成，高浓度时抑制RNA复制。 2远霉素、纺锤菌数:H链、静电引力与DNA合成，抑制RNA、DNA延伸。 ? 3吖啶类:插入DNA相邻的碱基对之间，抑制RNA链合成，还可造成基因? 突变。 4溴化乙锭:插入DNA相邻的碱基对之间，抑制RNA链合成，还可造成基? 因突变。产生橙红色荧光，造成碱基插入、缺失的危险。 5环磷酰胺、苯丁酸氮芥:两个烷基化合物，使双链DNA交联，妨碍双链? 解链。 3)与RNA聚合酶结合的抑制剂: ( 1利福平、曲张链菌素:作用于全酶，与β亚基的非共价键结合。妨碍了? 第一个NTP的插入(起始)。(抗结核药物) 2利链菌素:与β亚基结合，作用于核心酶，抑制RNA链的延伸。 ? 3α-鹅膏蕈碱:优先作用于pol?、其次pol?、pol不敏感?。 ? 蛋白质的生物合成 一、 蛋白质的合成 1、 氨基酸的活化 2、 肽链的起始 3、 肽链的延伸 4、 肽链的终止 5、 折叠和加工 ?、切除N-甲酰甲硫氨酸(脱甲酰酶)或甲硫氨酸(甲硫氨酸氨肽酶) ?、二硫键的生成(二硫键异构酶) ?、肽键中脯氨酸所在的肽平面需由脯氨酰顺-反异构酶催化形成順式结构 ?、氨基酸的修饰 ?侧链修饰 A、 磷酸化:Ser,Tyr,Thr, B、 糖基化:Asn,Cys,Ser,Thr,OH-Pro,OH-Lys C、 甲基化:Arg,Lys,Asp,Glu D、 乙酰化:Lys E、 羟基化:Pro,Lys F、 与脂肪酸形成酯键:Ser,Thr,Cys G、 羧基化:Glu,Asp H、 硫酸化:Tyr ，I、 ADP-核糖化:Glu,NAD J、 泛酰化:Lys ?、N-端 A、 乙酰化 B、 甲基化 C、 泛酰化 D、 转氨基酸 E、 葡萄糖胺基化 F、 豆蔻酰化 ?、C-端 A、 甲基化 B、 引入酰胺基团 C、 ADP核糖化 ?、切除新生肽链中功能非必需的肽段 ?、信号肽约15,30氨基酸N-端 ?、非必需肽段:自蛋白质N-端5,6个氨基酸 ?、内含子的自我剪接 ?、空间结构的折叠，亚基间的聚合，辅基的结合 二、 蛋白质合成的抑制剂 (一)、四环素类(四环素、土霉素、金霉素) ——抑制延伸氨酰tRNA进入“A”位 (对真核生物无抑制作用，不能通过真核生物细胞膜) (二)、氯霉素:能与原核生物50S大亚基、真核生物线粒体50s亚基结合，阻断肽链形成 (三)、链霉素、卡那霉素、新霉素 ——干扰起始胺酰tRNA与30S小亚基结合，抑制肽链的起始。造成遗传密码子的错读(mRNA模板) (四)、嘌呤霉素 ——结合到核糖体“A”位，成肽后形成羧基端为嘌呤霉素的肽链，从核糖体上释放出来，肽链的合成提早终止。 (五)、青霉素和红霉素 ——与50S大亚基结合，阻止成肽和移位 (六)、志贺氏毒素 ——使28S核糖体RNA上的4324位的“A”的核苷键断裂，导致60S大亚 基失活。 (七)、白喉毒素 ——特异地抑制真核生物肽链延长因子?活性 (八)、蓖麻毒素 ——A链与60S大亚基结合，间接抑制延长因子?，B链凝集素 (九)、干扰素 ——?在有双链RNA存在的条件下、使蛋白激酶变构(无活性-有活性) 使启始因子eIF磷酸化，抑制肽链合成起始。 2 ?激活2、5-腺苷酸合成酶，催化多个ATP以2、5-磷酸二酯键合成2、5多聚腺苷酸(2、5A)使RNaseL激活(无活性——有活性)，使mRNA，tRNA水解。 分子伴侣(分子伴娘、伴随分子) 1、 含义:能够帮助新生肽链折叠成正确的空间结构，而本身却不 是最终功能蛋白质分子组成成份的蛋白质分子。 2、 种类 (1)、从结构划分:Hsp40,Hsp60,Hsp70,Hsp90,钙联结蛋白， TriC,SHsPS (2)、是否受刺激诱导 热休克蛋白:Hsp40，Hsp70，GrPE 伴侣素:Hsp60, Hsp10, 3、 特征: ?、同类分子伴侣的基因在所有生物体内具有广泛的同源性(进化保守) ?、所有基因既可以在受胁迫的细胞中表达、也可以在未受胁迫的细胞中表达 ?、分子伴侣在行使其功能的时候，需要ATP功能来改变构象，释放底物 ?、能识别暴露的未折叠部分或部分变性的蛋白质的结构域，且能与多种不同的肽链作用(无特异性)，靠疏水表面与新生肽链或未变性的蛋白质疏水结构域，防止疏水区之间形成疏水作用力。 4、 功能 ?、胁迫保护 ?、转运蛋白 ?、调节DNA的转录、复制 ?、组装细胞骨架 ?、激活CTL细胞，参与免疫应答 基因表达调控 (一)、基因表达 DNA上遗传信息 DNA?RNA?蛋白质 (二)、原核生物转录水平 1、方式 ?、诱导型的转录水平调控 ?、阻遏型 ?、衰减子(弱化子) ?、代谢降解物活化蛋白所进行的调控 (CAMP-CAP-调节?正调控 ?、PPETPP调控(四磷酸鸟苷) ?、严格反应——在严峻的营养条件下，细胞最大程度的节约使用营养，最小限度的进行生命活动，直到营养条件改善为止，这种现象称为严格反应。 ?、PPGPP产生信号 2、操纵子调控 (1)、乳糖操纵子 ?、P、O:7bp重复 ?、O基因:-7,，28 ?、阻遏蛋白:-1,，21 ?、CAMP、CAP结合位点:-55,-68 (2)、Trp操纵子 ?、P1、O:大部分重叠，P受阻遏调节 ?、P1是主要启动子，P2是次要的(不受调控) ?、L1的形成茎环结构，其中两个连续Trp密码子位于原3、4区段形成的茎环为强终止子(衰减子) 调控: ?、Trp过量时，Trp与操纵基因外75分钟表达处?基因结合表达阻 遏蛋白。 ?、衰减子调控:启动L基因的转录，核糖体很快离开1区，进入2区，2、3区不能形成茎环结构，3、4区形成强终止子结构。 ?、Trp没有或不足的时候，O基因开放，RNA聚合酶使L转录，2个连续的Trp密码子停在1区，2、3区配对形成茎环结构，3、4区不能形成强终止子结构，转录连续。 (3)、His操纵子 ?、启动子的调控 ?、衰减子 (4)、半乳糖操纵子(gal) ?、结构 A、 有两个“O”基因:一个在“E”基因内，另一个在“P”基因的 上游 B、 有两个启动子:P1、P2(两个碱基对重复) C、 CAMP-CRP结合位点:-50,-24 ?、调控: A、 负调控;在无gal时，阻遏蛋白R基因的产物与“O”结合，使 O”处于关闭状态，结构基因不能转录。 “ 在G、gal共存时，gal与阻遏蛋白结合，该复合物不能与“O”结合，使“O”开放，CAMP-CRP不形成复合物，RNA聚合酶此时由于G存在，结合于“P2”上，对结构基因进行转录，进行本底水平转录，永久性的。 B、 正调控:仅有gal存在，gal诱导“O”开放，CAMP-CRP结合于 -24,50位置，结合于“P1”上，结构基因转录起始频率加快， 高效转录。 (5)、阿拉伯糖操纵子 ?、结构 ?、双重调节、C基因——调节蛋白 (6)、rRNA操纵子 ?、P1是强启动子(受调控，四磷酸鸟苷，严格反应条件下进行)，P2是弱启动子(不受调控)对数生长期，靠P1转录。 (7)、核糖体蛋白S1操纵子 (8)、DNAQ蛋白操纵子 ——是DNA聚合酶的一个亚基、修复复制过程中产生的错误的亚基 P1是强启动子，受RNA聚合酶活性的调控，RNA下降，P2进行转录，随着RNA聚合酶活性上升，P1上升，由低到高。 P2弱启动子，溶解性。 真核生物基因表达调控 1、 DNA水平调控 ?、基因丢失:举例尖毛虫2个核，大核:丢失很多，有转录活 性，小核:不具转录活性，有种系 ?、基因扩增:举例非洲爪蛙软骨细胞，需要大量rRNA 形式——多线染色体存在;游离;重复染色体 ?、基因重排 ?、染色体(染色质)结构: A、 组蛋白，负调控，与组蛋白结合的区域，基因不具有转录活 性 对组蛋白进行修饰(磷酸化;甲基化;乙酰化) B、 非组蛋白，与H竞争，正调控 C、 染色体(质)结构:松弛型，常染色体具有转录活性 、外源基因的插入 ? ?、专座子转座 ?、DNA甲基化 2、 转录水平 (1)、组蛋白:组蛋白表达特异性转录因子大量增长 (2)、热刺激蛋白质:Hsp70 (3)、类固醇激素