第十章 基因工程药物

第十章 基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 药物 第十章 基因工程药物 第一节 概述 人类的遗传物质具有复杂的结构和功能。长期以来，人们为认识其特征以及变化规律，发展了众多的生物技术。生物学与物理、化学和数学相结合，产生各种技术方法，从不同水平来研究生命遗传的奥秘并服务于人类生存和发展的需要。70年代迅速发展起来的分子生物学技术使人们有可能来解剖人基因组以及单个基因的结构，分析其功能特征，了解其变化规律。在诸多现代分子生物技术中，其核心技术是重组DNA, 并由此产生了遗传工程。 一、重组DNA技术——基因工程 目前，在基因工程研究中经常使用的术语有“基因技术”、“重组DNA技术”、“基因拼接”、“基因工程”和“遗传工程”等，它们都是指从一个物种取得基因物质而与另一个物种的基因重新组合的技术。 基因工程技术就是将已知编码蛋白的基因导入生物环境中，使得蛋白质能够在其中大量表达。基因工程即重组DNA (recombination DNA)，又称基因克隆(gene cloning)。是指体外利用工具酶切割获得某一外来DNA片段, 然后与载体DNA分子重组连接，通过转化或转染方法将该重组子转入到宿主细胞，重组子随宿主细胞扩增而复制或者表达, 再经筛选能扩增该外来DNA片段的纯系宿主细胞进行扩增, 最后收获大量同一外来DNA分子或相应蛋白表达产物的过程。基因工程技术的进步使基因工程药物的研究成为最先起步的研究领域之一 二、基因工程药物 1973年，美国斯坦福大学医学院的Cohen教授及其研究小组的研究人员把大肠杆菌质粒DNA酶切后插入抗四环素基因，组成一个重组子，结果发现这个重组子能在大肠杆菌中复制，并表达出具有抗四环素及大肠杆菌质粒DNA的双抗遗传表型，因此，Cohen教授成了“第一个吃螃蟹的人”。1974年，在以前研究的基础上，Cohen教授与Boyer教授合作将非洲蟾蜍的核糖体RNA结构基因插入大肠杆菌质粒DNA，再转化入大肠杆菌，结果发现在大肠杆菌中有非洲蟾 蜍核糖体RNA结构基因的表达，这说明核糖体RNA的结构基因已在大肠杆菌体内永久居留下来，也就是说它具有遗传性。后来，这一著名的实验被科学界视为基因工程研究的里程碑。1977年，Hirose和Itakura用基因工程方法表达了人脑激素——生长抑素，这是人类第一次用基因工程方法生产出有药用价值的产 品，标志着基因工程药物开始走向实用阶段。 利用基因工程技术，生产厂家理论上可以获得无限量的活性蛋白和活性肽，这一点已经在许多地方得到了证实。随着基因技术的发展，基因工程治疗学在1982年应运而生。在基因药物的发展过程中具有里程碑意义的药物是人工合成胰岛素，即一种用于治疗糖尿病的肽类激素。现在已有大约几十种不同的肽类和蛋白质类的药物采用基因工程技术生产，而且还有不断增加之势。就胰岛素而言，过去几十年间都是从猪或牛的胰腺中提取而得的，而在基因工程生产胰岛素之前的基因工程产品并没有正式用于临床，原因是产量太低。基因工程技术的另一个用途是改变蛋白质特定位置上的氨基酸，既可以是氨基酸序列中某个点的变化，也可以是编码蛋白质基因中特定位置的突变，而这些变化可能导致其理化性质的改变，如溶解性、活性蛋白质的半衰期等，而且还可能引起进一步的变化。 基因工程技术也为药品研究和开发提供了强有力的工具，因此已广泛地应用于非肽类药物的研究，而且基因工程技术也有助于细胞和生物进化领域的研究，为疾病的治疗研究开辟了一条新的道路。 现今，在基因工程药物研究走向其辉煌发展的时代，基因药物的概念也远非仅仅表达某种药用产品，还包括了基因治疗、反义RNA、基因诊断试剂等。基因公司也如雨后春笋般地出现，美国已有上千家，其年产值也达数十亿美元。基因工程为现代医药带来了新的内涵和经济效益，也为未来的医疗手段带来新的契机和希望，前途不可估量。 三、基因治疗 80年代末到90年代初，随着基因工程技术的迅速发展，人们开始尝试用基因治疗来对付一些遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病和一些职业病，这些疾病都没有理想的治疗手段，而病因又都离不开基因缺陷、突变或表达异常。1990 年6月，美国国立卫生研究院(NIH)以双拷贝逆转录病毒为载体，将腺苷脱氨酶基因(ADA)以小基因(mini gene)插入其中，在5‘端LTR中的启动子调节下，将转染好的细胞注入1名4岁的ADA缺陷病儿体内，结果病情完全好转。基因治疗首次成功大大鼓舞了科学家们的信心，从此世界各地的科学家们纷纷开展这一新的治疗手段——基因治疗。严格意义上的基因治疗就是以正常基因或基因片段 代替有遗传缺陷的基因，或通过基因表达的调控来降低一些异常基因的表达。1991年，有二十几项基因治疗开展于美、欧，我国在亚洲较早开展了与此相关的研究。在这些研究中以黑色素瘤的治疗居多，其次还有囊性纤维变性、镰状细胞贫血等。其中，在加拿大有一个患LDL即家族性血胆固醇过多症的病人，其病因是由于清除血液中LDL的基因有缺陷，使血中的LDL不能有效地被清除而堆积过多，引起心脏损伤，病人接受基因治疗5个月后，血中胆固醇水平下降30,,50,，最后稳定在较疾病严重时低17,-20,的水平上，基因治疗的这种惊人的效果大大推动了研究的进展。 四、遗传工程 1、动物遗传工程 早在1983年，美国一些科学家就开始转基因鼠的研究，他们把大鼠的生长激素(GH)基因与小鼠MT启动子一起构建成重组体，注入小鼠受精卵，再植入代孕雌鼠子宫内，结果发现生下的小鼠有超常的生长速度，并在短时间内长成“巨鼠”，这是转基因动物成功的典型例子。用此方法，1988年澳大利亚科学家分离得到猪的生长激素，并研制成功了“超巨猪”。目前研究者们除了研究产卵多的家禽、家畜外，还研究所谓的“动物药厂”，即利用动物加工生产人的基因药品，如英国PPL公司培育出的IX因子转基因羊，可以从羊奶中获取人a1-抗胰蛋白酶，最高表达水平可达60g/L羊奶，如每只羊每天泌乳4,5 L即相当于一个蛋白计算，如每年生产100万单位血红蛋白，其产值约达3亿美元。 2、植物遗传工程 首先进行的植物基因工程研究主要集中在植物的抗病毒方面，如将病毒衣壳蛋白基因移植到植物中，使之能产生抵御病毒侵犯的抗病毒株。 第二节 基因重组技术 DNA克隆的基本条件:1)具有对DNA特异切割, 连接等的工具酶2)具有能在宿主细胞中复制或表达的载体DNA分子3)能复制或表达载体DNA分子的宿主细胞4)拟扩增或拟表达的外来DNA片段。 70年代初出现了许多有突出意义的重组DNA技术新方法，此后这些技术虽然得到了进一步的完善 但最基本的工具还是酶、DNA载体、宿主细胞。 关键性的突破是发现了2种典型的酶，即限制性核酸内切酶和DNA连接酶。限制性核酸内切酶它能识别和切割特定的DNA序列，典型的为4,8个碱基对，产生特异性的片段，包括独立而完整的基因。限制性内切酶能从许多微生物中经分离而得，每一种内切酶都有特定的识别位点，多数可以在市场上买到，如限制性内切酶BamH I(从Bacillus amybliquefaciens H中分离得到的核酸酶)。连接酶没有特定的序列限制，它可以将多个DNA分子连接在一起。限制性核酸酶和连接酶的这些特性使体外切割和连接DNA成为可能。 基因克隆的实质是将具有遗传信息的DNA，与合适的DNA体外重组，然后将重组分子转入适宜的载体和宿主细胞中，否则外源基因很难进入细胞中进行独立复制和表达。所谓载体是指能在连接酶的作用下和外源DNA片段或基因连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。载体的设计和应用是基因工程中的一个重要环节。目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动植物病毒载体等。 为了克隆DNA分子，必须将其导入宿主细胞以使其能被复制。起始复制需要特定的序列存，而这些序列在DNA中是不存在的，只能由宿主细胞提供，另外一些参与DNA表达调控的元件，如启动子、终止子也被连接到载体上，这样拼接有外源基因的质粒DNA就会转入宿主菌大肠杆菌，此过程称为转化(transformation)。应使重组质粒能增殖到一定的拷贝数(一般为20,200个)，如 10在适当条件下所需时间大概为20,30min，在12h内有可能增殖到10个。因此这种宿主—载体系统将产生大量同样的质粒分子，使对特定基因进行进一步处理成为可能。重组DNA技术的原理和技术 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 如下图 获取目的基因 基因与载体拼接 导入受体细胞 筛选及无性繁殖 重组DNA技术常要经过以下几个环节: 目的基因的分离与制备——目的基因的体外重组——重组子导入宿主细胞——阳性重组子的筛选和鉴定——克隆基因的表达——基因表达产物的检测 一、目的基因的分离与制备 在基因克隆技术中，首先应制备并分离目的基因。分离基因是极其复杂的，这是因为生物物种的基因种类繁多，例如最简单的生物病毒就含有数十个基因，而阵和生物的基因数可达数万种，而且每种基因均由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶四种核苷酸组成，用一般的理化方法很难分开。同时细胞中的基因含量较多而且大多数基因是氮拷贝的，因此必须采用有效的分离基因的技术和方法。在此仅介绍常用的。 1、聚合酶链反应定义和原理 1985年，美国PE Cetus 公司人类遗传研究室的Mulis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(poymerase chain rection , PCR)。这是分子遗传学在技术上的一次革命，为研究和分析基在提供了一种全新的方法，并且在医学、农业、环境保护、考古学等领域得到广泛的应用。Mullis博士也因此荣获了1993年度诺贝乐化学奖。 为了从生物材料中获得某一特定的DNA顺序或进行DNA的序列分析和鉴定，按传统的方法要经过DNA酶切、连接、转化等步骤以构建含目的的基因的DNA克隆，然后导入细胞进行扩增，再经过核素标记探针的筛选，虽然传统方法在技术上已无难点、但操作复杂，一般需要数周到数目的时间。PCR技术可以数小时内对仅有几个拷贝的基因放大几百万倍，大大简化了分子克隆技术，从而能比较容易地对目的基因进行研究。 聚合酶链反应是一种体外酶促反应，由高温变性，低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，经过n个周期循环以后，理论上可以获得2n的双链DNA分子，达到DNA特定区段大量扩增的目的。PCR技术实际上是在模板DNA，引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 2、聚合酶链反应的过程 PCR反应分3步进行:?变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，解链形成单链DNA;?退火(annealing):当温度突然降低时由于模板分子结合较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA的量大大多于模板DNA。使引物和与其互补的模板在局部形成杂交链。而模板DNA双链之间互补的机会较少;?延伸(extension);在DNA聚合酶的4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下下，5’?3’的聚合酶催化以及引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步构成一个循环，每一循环的产物都可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达 672×10~2×10个拷贝。 经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的DNA以,n-2n的量堆积。,,,扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定的。在反应的最初阶段，原来的DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而为主要模板，因而，绝大多数扩增产物将受到所加引物5’末端的限制，最终扩增产物是介于两个引物5’末端之间的DNA片段。 聚合酶链反应已成为非常重要的克隆工具，PCR技术是基于特定DNA的体外酶扩增反应，为通过扩增目的DNA或特定模板而得到大量产物的过程。如下图: 在一个有cDNA模板与特定结合位点的DNA引物、含有4种脱氧核苷酸混合物的缓冲液中，在DNA聚合酶Taq的催化下不断合成DNA，引物必须设计成能与cDNA的一个末端结合，而另一个引物能与互补链的另一个末端结合，当引物与目标片段退火后两个链都能在DNA聚合酶的作用下得到复制。每个循环都包括模板链的分离、引物退火、DNA聚合酶催化等步骤，大约经过20个循环后目的基因就能扩增到200多万个。 已知模板DNA序列有助于设计可与其结合的引物，如已知蛋白的氨基酸序列也有助于引物设计。大量已有的基因数据显示，编码同一功能蛋白的基因所组成的基因家族具有很长的同源性序列，只要设计出能与基因家族中的保守序列相结合的引物就可以很容易地扩增得到基因家族的新成员。这一技术已取得很大的成功，并使有关基因家族的研究迅速增多。 一、 目的基因的体外重组 在选择了合适的的载体并获取了足够的目的基因后，就可以进行体外重组了，DNA分子的体外重组实际就是DNA分子之间的连接过程，这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应，DNA连接酶的性质和功能已在前文进行了详细介绍。在进行DNA连接反应时，与通常的生化酶促反应一样，底物浓度即DNA分子浓度对反应有显著影响，当DNA分子浓度高时，分子末端数也高，连接几率增加，反应产物的产量随之上升;DNA分子浓度也影响反应体系中的产物构型。通常在两种构型产生:?线性DNA分子，不同DNA分子之间首尾相连形成线状结构;?环状DNA连接物，同一分子的两个末端或多个分子首尾连接形成的线性分子的两端发生连接反应，形成环化分子。重组DNA分子的构型对后续的转化过程有显著的影响，例如用λ噬菌体载体构建的重组子在线性结构时，更适用于包装成成熟的病毒颗粒而有效地转染细胞，而质粒载体则应形成环状结构才有利于转化细菌。 二、重组子导入宿主细胞 带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖，才能够获得大量的纯一的重组体DNA分子。这样一种过程习惯上叫做基因的扩增(amplification)。由此可知，选定的寄主细胞必须具备使外源DNA进行复制的能力，而且还应该能够表达导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的原则与鉴定。 将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化(或转染)转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转化和转导主要适应于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞 三、阳性重组子的筛选和鉴定 在DNA重组完成并转化了相应的宿主细胞以后，必须对其进行筛选和鉴定。这是由于选用的载体、宿主细胞的差异所决定的，同时在转化过程中，常出现多种结果，例如非重组子转化、野生载体转化、外源基因多拷贝转化等结果。这些均与阳性重组子的转化不易区分，因此需要根据不同的载体、宿主及外源DNA的性质，选用不同的筛选和鉴定方法。 四、克隆基因的表达 基因表达是基因工程中的主要内容，包括目的基因的转录、翻译以及蛋白质产物的加工等内容。因此将某一目的基因克隆后，再将其导入到适宜的表达系统中，才能获得相应的蛋白产物。而基因表达系统包括载体和相应的宿主细胞两部分。目前，基因工程中将载体分为克隆载体和表达载体。在克隆载体中通常仅带有一个松弛型复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。而表达载体除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点、转录起始信号、转录终止信号、翻译起始密码子和终止密码子等一系列调控序列。在基因工程中除了选择合适的载体以外，还要选用相应的宿主细胞，一起组成表达系统。常用的表达系统主要有原核和真核表达系统。原核表达系统主要有:大肠杆菌系统和枯草杆菌系统等。真核表达系统主要有:酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统、昆虫细胞(杆状病毒)系统和高等植物系统等。下面主要介绍利用大肠杆菌细胞表达外源基因的原核系统和在酵母菌中表达外源基因的真核系统。 1、大肠杆菌作为表达宿主 1977年，研究者第一次成功地在大肠杆菌中表达了人类生长激素释放抑制因子，此后，大量的真核生物基因在此系统中得到表达。这些细菌没有真核生物所具有的翻译后的修饰作用，因此该系统特别适用于没有修饰或只有有限修饰的蛋白质的合成。该表达系统处理容易，使用安全，虽不能将蛋白质加工成熟完全，但也成为这些蛋白质的重要表达宿主。许多基因重组蛋白产物都已在大肠杆菌中成功表达，如生长激素、胰岛素、干扰素和白介素2，这些蛋白在体内都是分泌型的蛋白质，因此在分泌过程中可发生有限的翻译后修饰，如肽键的断裂、二硫键的形成等。在以大肠杆菌表达时，为获得正确形式的蛋白质，许多有创意的方 法被设计出来，必要时还可在体外进行最后的修饰。 为得到高水平表达，人们致力于研究在表达载体中插入适当片段的方法。有人采用高转录效率的细菌基因启动子，通过组合型启动子或改变生长环境(温度、化学物质等)的方法可使调控型启动子开启或关闭。例如来自于乳糖操纵子PI.或噬菌体启动子PR的lac启动子，其优点是:只有当相对密度达到一定的水平时，重组蛋白质的合成才开始，且在很短的蛋白质合成期间就能产生足够所需量的蛋白。 2、酵母菌作为表达宿主 酵母菌是主要以单细胞生存的真菌，作为真核生物酵母菌能在人体内进行翻译后修饰，这点对中等复杂度的蛋白质和多肽的生产是很有用的，但非常复杂的蛋白质要在更高级的有机体内表达。食品生产中一直采用酵母为工具，这为将其应用于蛋白质药物的生产提供了方便。许多生物学家认为，现在使用的酿酒用酵母(面包酵母)是一个较好的表达系统，并已经在基因水平和分子水平上进行了广泛的研究。将来，其他的酵母类型如Pichia pastoris、Hansenula Polymorph和Yarrowia lipolytica也许都会用于药物生产。迄今为止，只有S.cerevisiae(啤酒酵母)生产出的药物已用于人体，如胰岛素和乙型肝炎疫苗。 像大肠杆菌一样，S.cerevisiae也含有自然质粒(2μm质粒)，连上选择性标记后可作为载体。含有突变的酵母基因经常用于质粒的选择，而不采用抗性基因标记，这一方法也可用于大规模抗生素的筛选。 作为真核生物，酵母细胞有分泌通道，这一通道很像哺乳动物细胞的分泌过程，它经常用于分泌型重组蛋白质的生产，原因有两点:?分泌型蛋白翻译后的修饰在分泌过程中进行;?易于纯化。但是在分泌过程中常常会出现一些不太令人满意的情况，例如N-连接、O—连接、糖基化修饰的缺失、糖基化侧链的形成等在酵母与人细胞中不同。酵母产生的糖蛋白对人有免疫源性，因而糖蛋白不适合在酵母中生产。 五、基因表达产物的检测 一种克隆的外源基因，是否能够在新宿主细胞中有效地表达，需要通过一定的实验才能作出正确的判断。如果我们事先已经知道克隆基因编码的蛋白质或RNA组成，就能够据此设计出适当的实验，检测基因在新宿主中的表达情况。 例如，化学合成的激素和胰岛素基因，可用敏感的放射免疫测定法检测;5S RNA可用适当的探针进行杂交检测，对于某些酶产物，可以通过同适当的营养缺陷突变型宿主间的互补作用予以检测。目前，检测基因表达的方法以及分析被检测基 因在细胞中转录和翻译的情况有下列方法; 1、Northern杂交 检测细胞中是否含有特定的mRNA，测定特定mRNA在总RNA中的比例，由此获得目的mRNA的转录情况。 2、斑点杂交 用特异性探针检查mRNA，并估计表达过程中mRNA的转录强度。 3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平。如表达水平很低，可用同位素作为放射性标记，如35 S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸进行代谢标记，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，或在Western杂交中用特异性单克隆抗体或多克隆抗体分析目的蛋白质存在与否及其含量。 4、免疫学方法 利用特异性抗体与目的蛋白质进行反应，经免疫沉淀、ELISA等免疫学方法，检测表达蛋白质。例如，免疫沉淀法可用于检测并定量分析多种蛋白质混合物中的靶抗原。这种方法很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白质。当与SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。放射性标记靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列几个步骤:?靶蛋白的放射性标记;?裂解细胞，?特异性免疫复合物的形成;?免疫复合物的收集及纯化;?放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析。 第三节 基因工程技术在药物研究中的应用 一、细胞膜受体作为药物研究的靶点 药物的基本作用部位是酶、受体、离子通道和活性转移复合物，这些作用部位都是蛋白质，它们能通过克隆或相关基因表达的方法而得到，这一点对于非肽类药物的研究和发展有深远的影响。研究者可采取纯的靶位来检验药物和靶位的相互作用，这在以前是不可能的。下面就举一个细胞膜受体的例子来阐述基因技 术对药物发展的影响。总的来说，任何一个在生理过程中扮演重要角色的蛋白质 都能作为药物研究的靶点。 前几年，膜受体的药理学研究局限于经典的功能或配基类型的研究，大量的膜受体被克隆与分析，研究结果大大扩充了其结构信息，也提供了器官和组织中的受体定位信息，同时还发现许多先前被认为是同一受体而实际上是由相关受体家族组成。同一家族血型具有相同结构和功能特征，但是对克隆后血型的分离表达和药理分析表明不同的受体血型具有不同的配基亲合力。这是一个非常重要的发现，因为它打开了发展选择性药物的大门，使选择性药物特异性地优先与单一受体血型作用。已发现在血型受体分布中具有明显的组织特异性，血型特异性药物将具有更高的选择性，而且比同时作用于几个受体血型的药物具有更小的副作用。 人们现在可以用经典的药物筛选方法从大量的纯化合物中筛选或从复杂提取物中筛选纯受体，这在现实中被证明是可行的。这一筛选方法用于全细胞表达的克隆受体纯受体的制备，或是用于从化合物中纯化后的受体，因为要筛选成千种物质必须用很长时间设计筛选方法，故基因技术则很自然地被采用，这些筛选方法的确立是药物发展中的一大进步。 受体筛选 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的另一个应用就是寻找非肽类和肽类激素，目前它们只能作为注射药物，因为若口服后就会在胃中被消化。这些筛选方案就是寻找能口服或吸人给药的类似物，一旦前导化合物被发现，通过设计循环就可以设计出最优的化合物 二、转基因动物 转基因动物可用来生产活性蛋白质药物，但是转基因动物用作疾病模型比用作生产工具更具重要性。在转基因技术出现之前，仅有有限的动物模型可用，这些疾病模型可自发产生或通过复杂的实验产生。现在只要在实验动物中导入或剔除基因，就可以更直接和有效地创建疾病模型。转基因鼠被广泛用于疾病模型的建立，就是因为它们易于产生和繁殖。 最简单的转基因鼠模型是在失控的条件下表达外源蛋白，虽然可以在一部分或全部器官中，但是为了达到某种目的必须限制其在某些器官中表达，因此，要使用组织特异性调控因子。但是没有必要将外源基因插入染色体的特定位点，就 像前面提到的那样，可以通过向受精卵中注射外源基因来产生转基因动物。 比较成熟的转基因模型就是特定基因被剔除的动物，如剔基因小鼠，这种剔除是通过基因打靶技术来完成的。这一技术非常耗时，简而言之就是将一个带有选择标记的基因克隆到特定的链中而使其断开，此选择标记一般为新霉素抗性基因，将断裂基因引入培养的胚胎干细胞中，带上上述标记的细胞能在新霉素存在的介质中生长。在一定条件下，基因并不是插入基因组中任何位置，而是通过基因重组替换其同源序列，因为这种情况发生很少，必须建立筛选此类细胞的方法。采用另一种选择基因，通常是对其他药物敏感的基因，如hepers simplex virus(HSV)，以及对更昔洛韦敏感的胸腺激酶基因，来替换载体附近的断裂基因，同整个载体随机结合的细胞除了具有抗新霉素的基因还含有胸腺激酶基因，因而对更昔洛韦也敏感，只有发生重组的细胞能抵抗新霉素和更昔洛韦。大约100万个细胞中只有一个细胞发生预期的替代，但由于这些细胞能被选择和繁殖，如此低的替代率也能满足需要。将这些干细胞移植人早期胚胎，就会生出所谓的转基因小鼠，在这些小鼠中部分细胞带有干细胞所具有的基因替换。现已发现这些小鼠的种系细胞具有断裂基因，这些小鼠用作繁殖带有断裂基因的小鼠。总之，产生一个基因剔除小鼠需要1年时间，在这一方法中也可用野生基因代替突变基因。在一个单纯的剔基因小鼠中，目标基因在所有细胞中都是灭活的，而在某些情况下这一点是致命的。近期发展了一个成熟的模型，就是目标基因在特定组织中被调控开启或关闭，这些系统使用了完全不同的特征性控制机制，最终，转基因小鼠带有许多外源基因。 转基因小鼠模型用作许多疾病的模型，包括单基因和多基因的疾病。前者如囊性纤维化(CF)，研究表明此病是由于一个编码大的膜蛋白基因缺陷所致，这个蛋白质是中性纤维化膜转运调控因子，通过单独剔除此基因就可以产生一个与人体有共同症状的小鼠，即肺中粘液蓄积。这一模型已用作临床治疗方法的实验，包括体细胞基因治疗，这种方法非常有前景，已经用于临床实验阶段。另一种CF治疗方法也成功进入?期临床实验阶段，就是用重组DNA酶I，一种能降解DNA的酶，这种方法是很有效的，因为在病人肺粘液中DNA占大部分，并且是导致其高粘度的主要原因。多基因疾病的例子是癌症和动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是一种复杂的疾病，是由基因和生活方式两方面因素导致的，其中血脂升高 看起来是决定因素。目前许多脂类转运蛋白已经被研究清楚了，并明确了其在动脉粥样硬化发展中的影响。这些基因过多表达或表达不足的转基因鼠也已研制成功，且与人类流行病学的临床结果有很好的相关性，特定的转运工具如胆固醇转运蛋白(CETP)，当其过量表达时就会促进动脉粥样硬化的发生。这些转运工具的抑制因子就可以用于治疗，如果抑制因子在体外实验有效，就可以在人体实验之前用转基因模型进行研究。这种转基因模型的最大好处是可以假定2种不同的 疾病起源，并且可以测定不同的干扰作用。 第四节 常用的基因工程药物 表1列出了迄今为止我们了解到的已上市的重组蛋白质药物。以前只有很少的药物是通过非基因重组的方法生产出来的，如胰岛素，但至今重组蛋白质药物已有很多，从激素、细胞因子、酶、血液凝集素到疫苗。 表1 品名 分类 适应证 上市时间 胰岛素 激素 糖尿病 1982 生长激素 激素 生长缺陷 1985 IFN-α 细胞因子 肿瘤 1986 IFN-γ 细胞因子 肿瘤 1990 IL-2 细胞因子 肿瘤 1989 G-CSF 细胞因子 白细胞减少 1989 GM-CSF 细胞因子 白细胞减少 1991 EPO 细胞因子 贫血 1989 纤维蛋白溶酶原活化因子 抗溶血素 血栓形成 1987 因子VIII 胶原因子 血友病 1989 α1抗胰蛋白酶 酶抑制剂 α1抗胰蛋白酶缺陷 1992 DNA酶I 酶 / 1994 乙肝亚单位疫苗 疫苗 预防肝炎 1988 现在大约有150种新型蛋白质药物用于临床实验，其中约100种是真正的全新药物，在医疗上没有先例。大部分属于细胞因子家族，但是激素、抗血栓打靶、抗体和疫苗等也在研究中，其中一些是天然蛋白质的副本，而另一些为设计的重组蛋白。 据估计，大约有2 000种药物是用基因工程技术生产的，其中包括蛋白质药物和非蛋白质药物，而这仅仅是在发展的早期阶段。在非蛋白质药物中，反义核 酸分子提供了新的治疗方案。反义核酸分子是由小分子的DNA或RNA组成，它们能同目标mRNA互补，因为这种互补作用，反义核酸分子能结合到目标上并抑制其翻译成蛋白质。为了在体内发挥高效作用，反义分子必须进入细胞中，并相当稳定，具有特异性，至今这些条件只能部分满足。现在反义方法活跃于逆转录病毒研究中，但是也可应用于许多疾病治疗领域，反义治疗的效果酷似于基因损伤的结果，因此选择性地用于以基因灭活为目的的基因治疗。基因治疗开辟了另一个非蛋白的治疗领域。它将有可能引起新的药物开发浪潮，并且可能在很长一段时期后代替蛋白质和其他治疗方法，这一点是无可置疑的，就像基因拼接这一科学发现在短期内即给药物发展带来深刻的影响一样，在可以预见的将来这 种影响仍不会减少。 一、干扰素 干扰素最早由英国科学Isaacs和Lindemann于1957年发现的。他们在研究病毒干扰现象时，将56?C加热,h灭活的流感病毒加入到鸡胚绒毛尿囊膜碎片中，孵育后发现此膜能抵抗活流感病毒的感染，并且向外周释放具有活性干扰的因子，离心后吸取的上清液能使别的鸡胚绒毛尿囊膜碎片获得对病毒的抗性，他们将该物质称为干扰素(interferon,IFN)。此后，1965年发现了白细胞干扰素，1969年发现了致敏细胞干扰素。从此，关于干扰素的研究便红红火火地展开了。 1973年Cohen将两种不同的,,,分子进行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉价制备单组分干扰素成为可能。1980年，利用基因工程成功的获得了IFN-α和IFN-β的cDNA ,标志着第2代干扰素的诞生，1982年又获得了IFN-γ的cDNA 。用高表达质粒在大肠杆菌中进行表达，得到每升菌液中含2.5亿, 的IFN-α，相当于从100,人血中获得的提取量，尤其诱人的是用多角病毒载体将IFN-在家蚕中表达，每ml体液中可获得,亿,的产物。因此基因工程干扰素引起了许多研究者的注意。1987年，,种干扰素的生产开始工业化，并大量进入市场。中国预防医学科学院病毒学研究所、卫生部上海生物制品研究所、卫生部长春生物制品研究所和中国药品生物制品检定所等单位联合研制了基因工程IFN-Ib，并由长春生物制品研究所投入工业化生产，成为我国第一个进入工业化的基因工程药物。 干扰素作为较早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物质，虽然在基因 的调取、构建、表达方面仍有许多的工作在进行中，但研究的热点已经转移到了 临床应用及临床前的动物实验方面，并且在许多疾病的治疗方面取得了进展。 1、抗病毒 目前的研究主要集中于抗各类肝炎病毒方面，在抗HIV、抗HSV等方面也有较多的研究。 2、提高免疫系统机能 在小鼠实验中重组IFN-γ对NK细胞的活性、吞噬细胞的溶解性、丝裂原诱导的母细胞化均有促进作用，同时减少外周血及骨髓量。在牛体内的实验表明，IFN-可以增强免疫抑制动物的免疫系统活性。 3、抗肿瘤 通过与糖基化的淋巴细胞毒素嵌合，IFN-γ可以提高小鼠对HT-1080纤维肉瘤、G-361恶性黑色素ZR-75-1乳腺瘤等肿瘤的抗性。在临床前研究方面。重组IFN-γ与重组IFN-α联合用于肿瘤治疗也已完成 = 1 \* ROMAN I期临床工作。 二、促红细胞生成素 促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是第一个被发现并应用于临床的造血生长因子。早在1906年，Caront等发现兔失血后在外周血中产生一种可作用于造血系统以加速红细胞生成的物质，由此提出存在一种体液因子以反馈方式调节血细胞生成的观点。时隔30多年以后此观点才得以证实，这种因子被命名为促红细胞生成素。促红细胞生成素又称血细胞生成素、红细胞刺激因子，属酸性糖蛋白，是调节前体红细胞增殖、分化以及保持外周血中红细胞数量处于正常生理范围内的最主要激素。它可与红细胞前体细胞表面的EPO受体结合促进其血红蛋白的合成使之增殖分化成红细胞，从而调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。EPO是一个强有力的造血生长因子，体外分析显示在0.05U/ml的浓度时即具有剂量依赖效应。EPO可刺激红祖细胞(BFU-E)和早幼稚红细胞(CFU-E)形成成熟的红细胞集落。EPO除了可能作用于骨髓巨核前体细胞外，对其它造血细胞均无作用，是迄今认为作用最单一的造血生长因子。当然，对红细胞造血过程的完整调节，除了EPO外还需要其它因子的协同作用，包括Multi-CSF和IL-1，这些因子促使干细胞变成BFU-E，并联合刺激使红细胞早期增殖，随后才是EPO的增殖作用。 1977年，Miyake等从重症再障贫血病人的尿中提取得到了EPO的纯品，由于起始来源的匮乏，很难得到大量纯品以充分研究其生物学和分子学性质。1984年，科学家们首次以人肾癌细胞的EPOmRNA为摸板，经逆转录合成cDNA 并在大肠杆菌中得以克隆并表达，在此基础上获得了EPO的完整基因并在真核细胞中进行高效表达，为深入研究EPO的生物学效应并将之应用于临床奠定了基础。现在国外已能用基因工程方法生产重组人EPO(rhEPO)，并用于临床治疗多种红细胞减少症，具有很好的疗效。1989年，美国FDA批准rhEPO投放市场并用于治疗肾衰引起的贫血，我国也正加紧这方面的研究和开发。 自1985年rhEPO问世以来，它作为一种替代因子和药物应用于临床成为现实。1986年，Winearls等对rhEPO治疗肾衰贫血进行的 = 1 \* ROMAN I, = 2 \* ROMAN II期临床研究取得了良好效果。此后，大量关于rhEPO治疗肾衰贫血的 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 均肯定了其疗效。近年来，rhEPO的应用领域不断的扩展并取得了一些成熟的经验。EPO在成年健康男子中静脉给予，一次量为3600U时，就能见到网织红细胞增加;如隔日以1800U剂量连用,次，亦见到造血促进效果，血红蛋白增加，铁蛋白减低，网织红细胞上升。单次静脉给予rhEPO，测定其半衰期,1800U者,.3h,3600U 者为,.2h 。在临床上主要用于: 1、 肾性贫血 由肾功能衰竭所导致的贫血。 2、 癌性贫血 肿瘤引起的贫血或肿瘤化疗、放疗引起的贫血，用EPO每周静 脉注射3次，每次150U/kg体重，数周后，病人血细胞比容水平显著提高， 病情改善，无任何副作用。 3、 结蒂组织性贫血 类风湿关节炎和红斑狼疮(SLE)所致的贫血病因不清， 一般难以治疗，大剂量(300U/kg以上)输注重组EPO有明显疗效，且无不 良反映。 4、 骨髓增生异常综合征性贫血 这种病人主要靠输血维持生命。用重组EPO 能促使骨髓造血状况改善，如红祖细胞分化，红细胞形成集落单位增加，病 人贫血状况好转，输血依赖性减少。一般需要大剂量才有疗效。 5、 难治性贫血 在我反应性贫血、再生障碍性贫血等难治性贫血病人体内， EPO量并不减少，从理论上讲，用外源EPO不能促进造血反应。但于再生 障碍性贫血动物模型和遗传贫血W/Wv小鼠中，应用EPO后有贫血症状的 改善。因此，现已应用EPO来治疗再生障碍性贫血、无反应性贫血等思考题: 1、 解释名词: 重组DNA技术;PCR;转化 2、 DNA克隆的基本条件有哪些, 3、 在PCR反应中，每一个循环要经过几个步骤, 4、 基因工程中常用的原核表达载体和真核载体有哪些, 5、 重组DNA技术常要经过几个环节, 6、 试举出一种常用的基因工程药物并说出其在临床上的应用。