酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究

酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 中国人民解放军军事医学科学院 硕士学位论文 酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 姓名:曹安民 申请学位级别:硕士 专业:卫生毒理学 指导教师:廖明阳施畅 20060601 , ,,,,,, 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明 秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得至圭堕鲎盘鲎瞳或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字:,,鸵垦丛， 签字日期: 丝～～年—羔月旦日 军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解至主匡堂盘鲎瞳有关保留、使用学位论文的规定。特授权至圭匿堂盘鲎瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。 (保密学位论文在解密后适用本授权书)论文作者签字: 签字日期:指导教师签字: 猊芦逸业 签字日期: 年堕月盟日酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 摘要 摘要 酮康唑(,,,,;,,,,,,,，,,,)属于咪唑类抗真菌药物，对深部真菌和浅表真菌感染均有作用。,临床应用及动物试验均发现其具有一定的肝脏毒性，并对部分细胞色素,,,,(,,,,,,)亚型有一定的影响;艾迪康唑(，,,,;,,,,,,,)为在研的三唑类抗真菌新药，分子结构与咪唑类相比由三氮唑取代咪唑环，其对深部和浅表真菌感染的疗效均优于咪唑类。目前，酮康唑的肝损伤机理以及对,,,,,,的影响大小、具体亚型等尚不十分清楚，而艾迪康唑还处于临床前研发阶段，尚未展开系统的毒理学研究。本研究以整体大鼠和原代培养的大鼠肝细胞为实验材料，比较研究两药对肝细胞的功能、巯基状态、,,,,,,主要代谢亚型活性及细胞形态结构的影响，并对可能的致毒机理进行了探讨，为指导酮康唑临床合理用药及艾迪康唑的进一步研发提供毒理学依据。 大鼠整体动物试验中，量效关系研究发现，两药在,,,、,,,、,,,“,,,?,,。,?,。,剂量下连续灌胃,,，大鼠血浆生化指标和肝脏组织中巯基状态没有发生明显改变。酮康唑对大鼠肝脏微粒体,,,,,,的活性没有明显影响，而对,,,,,,、(,,,有诱导作用，对,,,,,有抑制作用，呈现明显的剂量反应关系;低剂量组抑制了,,,,,,、一,,,活性，高剂量组却诱导,,,,,,、(,,,活性升高。艾迪康唑诱导大鼠肝脏,,,,,，、一,,,、一,,,和一,,,活性明显升高，抑制,,,,,,、一,,活性，并且有明确的剂量反应关系。时效关系研究表明，两药,,,,(,,,?,,一?,。,连续灌胃,,、,,、,,后，仅酮康唑在给药,,时出现血浆,,,升高，其余各时间点血浆生化指标及肝组织巯基状态均未发现明显改变。酮康唑对,,,,,,、(,,,和一,,,有诱导作用;对,,,,,有抑制作用，呈现明显时问效应关系;酮康唑给药,、,,抑制,,,,,,活性，给药,,却诱导,,,,,,活性。艾迪康唑对,,,,,,、(,,,、一,,,和一,,,有诱导作用，具有明显的时间效应关系;对,,,,,,有抑制作用，给药,,、,,明显诱导了,,,,,的活性，但给药,,后，,,,,,的活性却被明显抑制。组织学检查发现，两药在,,,，,,,,,?,,,?,。剂量下，主要引起肝组织结构紊乱，肝细胞肿胀，细胞质红染，细胞核固缩。 体外原代培养 肝细胞实验结果发现，酮康唑和艾迪康唑对肝细胞有直接损伤作用，不仅引起肝细胞的存活率下降，胞内,,,、,,,、,,,、,,,泄漏，还引军事医学科学院毒物药物研究所酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 摘要起胞内总巯基、非蛋白巯基、蛋白巯基下降，上述变化均呈现明显的量效和时效关系，并且艾迪康唑对肝细胞的损伤比酮康唑更明显。原子力显微镜检查发现两药均引起肝细胞表面出现大疱。 在体内和体外试验研究中，透射电镜检查发现两药均可引起肝细胞核扭曲变形，双层膜结构完整性受损，染色质边集、成团;粗面内质网扩张，内腔模糊，脱颗粒;滑面内质网囊泡变;线粒体高度水肿，嵴断裂，排列紊乱甚至消失，有的线粒体呈空泡化，有的则变形、扭曲，畸形变;细胞内空泡化的线粒体显著增多;出现大量次级溶酶体。 以上实验结果表明，酮康唑和艾迪康唑均对肝脏有一定的损伤作用，主要表现为肝细胞形态结构的改变和对微粒体,,,,,,的影响，而且两药对,,,,,,及其亚型活性的影响不同。在体内试验中，等剂量条件下酮康唑引起的肝损伤比艾迪康唑明显，而体外试验表明艾迪康唑对肝细胞的损伤比酮康唑明显，提示机体的内环境对两药的肝损伤作用可能具有一定的影响。两药导致肝损伤的机理与细胞质膜结构破坏、细胞内巯基状态的改变、细胞骨架破坏高度相关。 关键词:酮康唑;艾迪康唑;肝细胞;巯基;,,,,,,;光镜;电镜军事医学科学院毒物药物研究所 (,(酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 ,,,,,,;, ,,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,(,,,),, ,,, ,,,,,,,,, , ,,,, , ,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,; ,,, ,,,,,,,;,,, ,,;,,,,(,,, ,,,,,,,,,,;,,, ,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,;,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,;,,,,,, ,,,, ,, ;,,,,; ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,(，,,,;,,,,,,, ,, , ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, , ,,,, ,,,,;,,,,,;,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,; ,,, ,,,,,,,;,,, ,,;,,,, ;,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,;,,,,(,,, ,,;,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,;,, ,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,?, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,，,,,;,,,,,,, ,, ,,,,, ,, ,,,;,,,,;,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,,;,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,(，, ,,,,,,,,,，,,, ,,,,;,,,,, ,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,, 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多年来，肝毒性是药物撤出市场、被限用或被拒批的最重要的原因之一。从,,,,到,,,,年在法国、德国、英国、美国等国家，因肝脏毒性而撤出市场的药物占总被撤销药物的,,,川。肝脏损伤相关的不良反应报告占了所有不良反应报告的,(,,,,(,,，其中肝脏损伤致死案例占总致死案例的,,(,,〔,,。据,,,,,,及其同事的研究显示，美国肝炎患者中,,是因药物引起的,,,。药物性肝病与抗生素、非甾体类抗炎药的使用有关，较为常见但又不为人所重视。虽然药物被批准前的临床试验的每一阶段都对血清中肝药酶的水平进行了监控，但是临床试验中出现的偶发转氨酶升高并不会促使人们终止该药的，艋床试验，只有出现几率较高，或者转氨酶升高的水平远超过正常水平，或伴有胆红素升高的迹象，才会放弃该药的进一步研发。 特异性的不良反应一般预测的发生率会低于万分之一，为了探测到发生率为万分之一的药物不良反应，至少需要,万名临床受试者。而?期临床试验的受试者通常为,,,,人，因此某些发生率较低的药物肝脏毒性反应很难在现行的临床试验中被发现。在新药上市以后，使用此类药物的人群的数目可能非常庞大，人群种类也比临床试验的情况要复杂很多，还包括病人使用药物的剂量、接受治疗时间的长短、病人的病理生理状况等，这样一些在，，，期临床试验中没有被发现的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 才会暴露出来。所以药物只有在上市后其疗效和安全性才能真正得到全面的评价。因此，医药工作者必须对药物引起的肝脏毒性保持高度警惕，对药物肝毒性的早期查明、及时停用，才能避免造成更大的危害。细胞色素,,,,酶系与药物的毒理学效应 药物在体内代谢均有酶的参与，与药物代谢关系最密切的是细胞色素,,,,酶系(,,,,,,,)，又称混合功能氧化酶(,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,)和单加氧酶(,,,,,,,,,,,,,)，其由三个组成部分为:血红素蛋白(,,,,)、黄素蛋白(,,,,,一细胞色素,还原酶)和磷脂(磷脂酰胆碱)。,,,,,,酶系主要存在于肝微粒体中，在线粒体和核膜内也发现其存在，并广泛的分布于肝、。肾、脑、肺、皮肤、肾上腺、军事医学科学院毒物药物研究所酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 ,,舀胃肠等多种器官和组织，在外源性 化合物(包括药物和毒物)的生物转化中起了十分重要的作用，它的活性决定药物的代谢速率，直接关系到药物的清除率，是药物代谢的第,相酶，因而又称为药物代谢酶。另外，,,,,,,酶还具有广泛的生物学意义，如与疾病、肿瘤易感性及机体耐药性的产生有着密切关系，自上世纪中期以来，一直是药物毒理学研究中的一个热点。 ,,,,,,是一组由许多同功酶组成的超基因家族，随着分子生物技术的发展和人类基因组计划的完成，人类编码,,,,,,的基因已基本明确，由,,个基因家族，,,个亚家族，,,个基因，,,个假基因组成”,。参与人类大部分的,,,,,,合成的基因共有,,个。其中有,个酶,,,,,,家族(,,,,、,,,,、,,,,)对肝脏的药物代谢最为重要。,,,,,,是一种由多环芳香烃诱导的,,,亚型，主要在肝脏表达，人类,,,,,,的含量约占肝脏,,,,,,,总量的,,,，其活性与药物的疗效或毒性及某些肿瘤的易感性密切相关。,,,,,,的活性个体差异较大，受非遗传因素的影响，且有明显的种族及性别差异。,,,等【副于,,,,年从人肝微粒体中分离出,,,,,,，是,,,,,家族的主要酶。,,,,,,约占成人,,,,,,,的,,，此亚型在胎儿期无表达。,,,,,是非常复杂的含有多种基因成份较庞大的亚族，占成人,,,,,,,总量的,,,左右”,，包括,,,,,,、,,,,,,、,,,,,,,年,,,,,,,,,，该亚族中的酶均可被诱导。,,,,,,在肝脏中占,,,,,,,总量的,,，在胚胎期即有表达〔”。由于,,,,,,基因的遗传多态性，其在体内活性有极大的个体差异和种族差异，其基因存在,,多种突变，从而影响了,,,,,,的稳定性和表达。,,,,,,在肝脏中占,,,,,,总量的,,【,】，是许多低分子有机化合物及药物在体内的主要代谢酶，,,,,,,在人胚胎期未发现有表达，但将人胚胎细胞培养,,后即可检测到该酶的活性。,,,,,,是成人,,,,,,,中最重要的成分，约占,,,,,,总量的,,,,,,,【,】，居第一位，该酶在许多内、外源化合物的代谢中起着重要作用，还参与部分前致癌物的活化。在联合用药中，药物对,,,,,,酶的抑制和诱导是导致药物相互作用的重要因素，其中,,,由酶的抑制引起，酶的诱导所致的相互作用约占,,,，其它则占,,。 与,,,,,,有关的药物毒性形成的机制主要有,种:第,种机制是由于过量未代谢药物的蓄积导致,,,,,,的活性降低。常用剂量下，这些药物一般被转化为无毒性的代谢产物。迄今为止，上述机制是药物毒性产生的最常见的原因。业已 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ，军事医学科学院毒物药物研究所酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 前言药物产生此种毒性必须具备下述条件:(,)药物必须有较低的治疗指数，即原始药物产生药理作用的剂量与引起副作用的剂量相近;(,)药物必须表现出“固有的毒性”，即药物必须具有潜在的毒性;(,),,,,,,的活性必须显著低于正常;(,)药物不能被,,,,,,酶家族的其它成员或其它的酶系(例如，第二相酶系)代谢成无毒性产物。 药物毒性形成的第,种机制是,,,,,,与药物作用后生成的亲电子或氧自由基代谢产物与细胞膜或其它的细胞成分起化学反应而产生的。,,,,,,产生的亲电子代谢产物包括醌及环氧化物，这些亲电子化合物可与内质网膜内或膜上的巯基结合或与含巯基的酶结合。研究表明，结合到重要膜巯基上的某种药物代谢产物能打破钙离子平衡。由于很多生理过程与钙离子有关，所以这种作用能破坏细胞，引起胞内钙离子浓度增加，最终导致细胞死亡。亲电子产物的另一种结合靶位是,,,分 子，,,,与亲电子产物共价结合后导致,,,损伤，破坏细胞结构，使酶失活或异常，诱发基团突变或抑制一些基团的表达，造成细胞损害，诱导程序性死亡(,,,,,,,,,, ,,,,,)，甚至激活癌基因，导致细胞癌变。 第,种机制是由于,,,,,,的代谢产物与,,,及各种蛋白质分子结合，诱导自身抗体产生，引起免疫病理损伤所致。现已证明，许多药物经体内代谢可产生一种或多种代谢产物，少数代谢产物可作为半抗原与机体组织蛋白共价结合并修饰被结合的蛋白质，使之成为抗原性物质，触发自身免疫反应，从而导致肝脏的免疫病理损伤，这些代谢产物几乎都是由,,,,,,酶系产生的。这类药物包括氟烷、肼肽嗪及乙醇。,,,,,,也可与其自身的代谢产物结合，诱导自身抗体产生，导致酶自身的破坏。由于,,,,,,的代谢产物与机体组织蛋白结合刺激机体所形成的抗体能肽た乖 从Γ 鹣赴 屏鸭跋赴 劳觯 蚨 谘 貉 分锌煞?终攵裕茫伲校矗担懊负推渌 蜗赴 鞍椎淖陨砜固澹 饪赡苁悄承??锍鱿痔匾煨苑从Φ闹饕 颉?体内有几种物质能与,,,,,,的有毒代谢产物形成化合物而保护机体。主要的保护性物质是谷胱甘肽(,,,)，其它具有保护性的物质包括生育酚(维生素,)和抗坏血酸，它们均能与亲电子物质结合。通常情况下，这些保护性物质的含量足以灭活,,,,,,产生的具有潜在毒性的代谢产物，但是如果这些毒性代谢产物的含量异常增高，保护作用就显不足，从而导致组织损伤。军事医学科学院毒物药物研究所酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 前言药物肝毒性研究的主要试验模型 药物肝毒性的试验方法主要分为整体动物体内试验和体外试验，其中体外替代性试验是近几年研究的热点。传统的动物体内试验可以进行药物毒作用的动态观察和慢性的毒作用研究，但也存在一些不足之处如难以区分原发性肝损伤和继发性肝损伤;动物试验结果外推至人体存在一定难度;耗时长，消耗动物数量多，花费大等。与体内试验相比，体外试验除了能控制环境因素，可排除相互作用的系统如免疫、神经内分泌系统的影响，较快速经济，试验间误差较小以外，最大的一个优点是可用人肝细胞或组织进行试验，从而略过从试验动物结果向人外推的环节，而且可以从组织、细胞、分子不同水平研究外源性化学物致肝损伤机制，因此体外试验在肝脏毒理学研究中的作用日趋重要。肝脏毒理学研究中较常用的体外试验模型有:?离体肝脏灌流;?精确切取的肝组织切片;?分离的肝细胞，包括肝细胞悬液和原代培养肝细胞;?肝细胞系;?分离的细胞器，如微粒体、线粒体、细胞膜等;?遗传工程细胞。这些体外试验模型各有优点和局限性，在毒理学研究中也存在一些不足，如毒性反应从体外向体内外推的问题，体外毒性试验难以预测慢性毒性等。因此结果评定时要充分考虑方法本身的特点和局限性，并与体内试验结果结合进行。唑类药物肝毒性的研究概况 唑类药物是临床常用的抗真菌药物，其对深部真菌和浅表真菌感染均有一定疗效。按化学结构大致可分为两类:咪唑类和三唑类。早期开发的咪唑类药物，以克霉唑和酮康唑为代表，药效机理主要是通过竞争性抑制真菌细胞色素,,,,,,,,使羊毛甾醇蓄积，细胞膜结构功能组成成分麦角甾醇生物合成缺乏，破坏质膜的完整性，引起真菌细胞膜通透性增高，进而发生细胞坏死而起药效作用【,】。动物试验及临床应用中均发现咪唑类具有一定的肝毒性，并对,,,,,,部分亚型有一定的诱导或抑制作用，致使其在临床的应用受到限制。近年来开发的三唑类抗真菌药物以氟康唑和伊曲康唑为代表，三氮唑取代眯唑环后，其与哺乳类动物,,,,,,的结合相对较弱，对固醇激素的合成也无明显的抑制 作用，而对真菌的,,,,,,却有高度的亲和力，因此其以活性高，毒性小，可口服、能适用于全身性深层真菌感染而逐渐地占据了主导地位。军事医学科学院毒物药物研究所酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 ，,,,舌 酮康唑，商品名:里素劳，英文名:,,,,;,,,,,,,，,,,，又名力素劳，尼唑啦，霉康灵，,,,,,,,,等。,,,,年首先由比利时杨森制药有限公司人工合成，,,,,年应用于临床，,,,,年已载入《美国药典》第,,版。被美国,,,评为,类广谱抗真菌药，是第一种口服的咪唑类抗真菌药。 艾迪康唑(，,,,;,,,,,,,)是第二军医大学自主研发的新一代三唑类广谱抗真菌药，己获得中国发明专利授权(专利号:,,,,,,,,,,(,)。药效资料证明其对深部和浅部真菌感染均具有很好的疗效，目前对该产品正在研发之中。其分子结构与酮康唑相比，主要特征为三氮唑取代了咪唑环(见图)。 , 含 ?,仑。?奴。 , 酮康唑分子结构式 艾迪康唑分子结构式 ? 分子式:;,,,,,,,,,,,, 分子式:,,,,,,,,，,,, ?分子量:,,,(, 分子量:,,,(,, 临床上应用酮康唑治疗真菌感染尤其是大剂量、长期用药时，常常会出现一过性的肝脏转氨酶升高、黄疸、乏力和血肌酐升高，轻者仅出现轻度可逆性肝脏转氨酶的升高而无明显症状，重者可能发生较严重的肝脏损害，甚至出现暴发性的肝功能衰竭。通常情况下，肝损害分为肝细胞损害型、胆汁淤积型和混合型三种类型，但以肝脏实质细胞损害为主。当肝实质发生弥漫性损伤时，肝细胞出现坏死，大小不一，胞浆混浊，空泡及颗粒变性，小叶内可见点状坏死、桥接坏死或多小叶坏死，门脉及门脉周围有单核细胞浸润。由于肝小叶第三区(,,,, ,)肝药酶浓度最高而肝窦内血氧含量又最低，因此，酮康唑引起的肝坏死主要发生于该处,,, ,。 研究表明，酮康唑可抑制某些,,,,,,酶～,,,,,,,,等的代谢，从而有可能增加由这些,,,,,,酶代谢的药物血浆浓度，减缓药物在体内的清除，产生一定的毒性反应。但是对于其确切效应和机制并不清楚。军事医学科学院毒物药物研究所酮康唑和艾迪康唑肝毒性研究 前言 艾迪康唑是在研的新一代三唑类抗真菌药，疗效确切。毒理学试验中，艾迪康唑对,,只小鼠连续灌胃,,天，除两只小鼠在短期内(给药后约,,,)有站立不稳、走路摇晃等症状外，其余小鼠未观察到任何毒性反应，其毒理学资料尚不完善，尚未见到对,,,,,,影响的报道。本课题的研究内容及其目的意义 酮康唑药理机制为竞争性抑制真菌细胞色素,,,,,,,,使羊毛甾醇蓄积，麦角甾醇合成缺乏，破坏质膜的完整性，导致真菌细胞坏死而发挥药效作用。基于真菌和哺乳类动物的,,,,,,具有交叉重复性，酮康唑在对真菌起作用的同时也可能会对哺乳类动物的细胞产生毒性作用，动物试验及临床应用中均证明了这一点，但其具体的毒作用机制仍不清楚。此外，酮康唑对主要参与药物代谢的,,,,,,亚型活性的影响尚不完全清楚，还需要进行进一步的探讨。艾迪康唑尚处于早期研发阶段，对其一般毒性、毒作用靶器官以及毒作用机制尚未进行系统研究，已进行的部分预试验毒性结果对艾迪康唑的毒性评价和开发前景尚难以给出明确的定论。鉴于其结构与药理机制均与酮康唑具有一定的类似性，有必要对这两种药物的毒性.