分子标记技术

分子标记技术 模块八 分子标记技术 一、SSR技术 1.实验目的 利用现代分子生物学技术揭示DNA序列的遗传多态性即建立DNA水平上的遗传标记。为分子遗传图谱的构建、遗传多样性分析与种质鉴定、重要性状基因定位与图位克隆、转基因生物鉴定、分子标记辅助育种等研究奠定实验技能基础。 通过此实验了解和掌握利用SSR和AFLP分子标记检测植物基因组DNA的遗传多态性的基本原理和实验方法。 2. 实验原理 SSR:根据SSR两端保守的单拷贝序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，扩增每个位点的微卫星DNA序列，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的带型，就可检测到不同个体在某个SSR座位上的多态性。 3. 实验仪器 离心机、移液器(100-1000ul，10-50ul)、PCR仪、垂直板电泳设备。 4. 实验试剂 MgCl，引物，dNTP，10ХPCR缓冲液，DNA聚合酶，无菌去离子水。 2 5. 实验方法 (1)将200 µL离心管、 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA、引物、dNTP、10 × buffer、无菌去离子水和DNA聚合酶置于 冰上溶解。 (2)依次向无菌的200 µL离心管中加入如下成份，轻轻混匀，离心去除气泡。 模板DNA 20-60 ng MgCl2 15-40 nmol 引物(各) 2-8 pmol dNTP 1-5 nmol PCR缓冲液 1Х DNA聚合酶 1-5 U Total 20 µL (3)将离心管置于PCR仪中，按照以下程序进行PCR反应。 1 94 ? 2 min 94 ? 50 sec 50-65 ? 30 sec 35循环 72 ? 90 sec 72 ? 7 min 4 ? ? (4)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:利用聚丙烯酰胺凝胶检测SSR-PCR结果。SSR-PCR扩增产物可能 仅仅存在几个碱基的差异，通常采用聚丙烯酰胺凝胶(银染体系)电泳方法检测。相对于琼脂 糖凝胶电泳而言，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够更好的区分微小片断的差异，能够检出的等位基因 位点多，多态性信息含量值较高，因此适用于SSR标记的结果检测。两种银染检测体系是在聚 丙烯酰胺凝胶电泳结束后，用固定剂将核酸固定到凝胶上，使银染剂中的银离子与核酸牢固结 合，再通过还原剂将银离子还原而发生显色反应。 6. 实验结果 SSR-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 7. 注意事项 2+由于SSR技术是基于PCR的一种分子标记，所以模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg的浓度等因素会影响SSR的结果。如果参与反应的某些因子条件不适合，则会导致图谱弥散状背景的产生，扩增产物的消失以及电泳谱带位置的改变。改进反应条件的措施主要有: (1)保证DNA模板的质量。DNA模板的质量直接影响到PCR的效果，要求模板中的蛋白质、糖 及其它杂质含量低。 (2)不同引物的退火温度应根据引物的T略有变动。 m 2+(3)设置模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg的浓度梯度。 二、AFLP技术 1. 实验目的 学习和掌握AFLP分子标技术的原理、操作方法和实验注意事项，了解AFLP分子标记技术在分子辅助育种中的应用。 2 2. 实验原理 基因组DNA用两种限制性内切酶进行双酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段与有共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端序列和接头序列作为PCR反应引物的结合位点，通过PCR反应对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的;最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。 3. 仪器设备 离心机，培养箱，微量移液器，制冰机，离心机，PCR仪。 4. 实验试剂: MseI，EcoRI，10Х酶切缓冲液，MseI接头，EcoRI接头，T4-连接酶，MseI引物，EcoRI引物，dNTP，10Х PCR缓冲液，DNA聚合酶。MseI引物II，EcoRI引物II，dNTP，无菌去离子水。 5. 实验方法 (1)接头的设计 AFLP接头是双链的寡核苷酸，其设计遵循随机引物的设计原则，可采用primer premier 5.0软件设计。人工接头5?端去磷酸化，这样接头只有一端可以被连接到酶切片段的末端。 AFLP接头一般由二部分组成:即核心序列和限制性内切酶识别序列。通常采用EcoRI和MseI两个限制性内切酶进行酶切操作，设计的EcoRI接头和MseI接头如下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 所示。 CTCGTAGACTGCGTACC EcoRI-接头 5’- 5’ CATCTGACGCATGG TTAA- GACGATGAGTCCTGAG 5’- MseI-接头 5’ TACTCAGGACTC AT- AFLP接头构成示意图 (2)引物的设计 AFLP引物的设计主要由接头的设计决定，其长度一般为16-20个碱基，AFLP引物的5?端是与接头序列相对应的。AFLP引物的一个重要特征是所有引物起始于5?-G残基。值得注意的是，无论 65?端是何种碱基，dNTP浓度过低时容易产生双链结构。3?端选择性碱基一般不超过3个*，当引物带有1-2个选择性碱基时，引物的选择较好;当选择性碱基增加到3个时，引物的选择特异性仍可接受;当引物的选择性碱基增加到4个时，引物与模板的错配率增加，扩增特异性下降，会出现原 n指纹图谱中未出现的条带。对于双酶切反应而言，引物组合数共有(2)种，n为选择碱基的数目。 引物主要由3部分组成即5?端核心序列、酶切位点序列、3?端选择性延伸序列(以EcoRI引物和MseI引物为例，下同)。 3 AFLP接头构成 引物名称 5?端核心序列 酶切位点序列 选择性延伸序列 EcoRI引物 5-GACTGCGTACC AATTC NNN-3 MseI引物 5-GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3 (3)基因组DNA酶切 为了便于灵活的调节扩增片段的大小，一般采用两种限制性内切酶消化基因组DNA。一种是切点少的内切酶，如具有6碱基识别位点的EcoRI，它产生较大的DNA片段;一种是切点多的内切酶，如具有4碱基识别位点的MseI，它产生较小的DNA片段。由EcoRI和MseI酶切产生三种基因组片断，MseI-MseI片段，EcoRI-EcoRI片段，EcoRI-MseI，其中EcoRI-MseI为主要酶切产物。 ? 将200 µL离心管、模板DNA、MseI、EcoRI、10 × buffer、无菌去离子水置于冰上溶解。 ? 依次向无菌的200 µL离心管中加入各成份，加水至终体积为20 µL。轻轻混匀，离心去除气泡。 组分 DNA模板 Mse I EcoR I 10 × Buffer 用量 100 ng 2 U 2 U 2 µL ?37 ?恒温培养箱酶切2-4 hr。 (4)接头的连接 将MseI接头、EcoRI接头、T4-连接酶和无菌去离子水置于冰上溶解。依次向无菌的200 µL离心管中加入如下成份，加水至终体积为20 µL。轻轻混匀，离心去除气泡。 组分 酶切液 EcoR I接头 Mse I接头 T4-连接酶 用量 10 µL 50 pmol 50 pmol 6 U 37 ?恒温连接16 hr。 (5)DNA样品的预扩增 DNA样品预扩增是为了充分利用连接产物，同时获得较多扩增产物，为进一步筛选扩增引物提供保障。预扩增引物在设计时选择性碱基通常为一个。 ? 将MseI引物I、EcoRI引物I、10 × PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和无菌去离子水置于冰上 溶解。 ? 依次向无菌的200 µL离心管中加入如下成份，加水至终体积为50 µL。轻轻混匀，离心去除气泡。 4 连接后样品 5 µL 引物(各) 10 ng dNTP 10 nmol PCR缓冲液 1Х DNA聚合酶 2.5 U ? 按照如下程序进行PCR反应。 94 ? 2-5 min 94 ? 30 sec 56 ? 60sec 35循环 72 ? 60 sec 72 ? 7 min 4 ? ? ? 琼脂糖凝胶电泳检测:取20 µL预扩增产物和5 µL上样缓冲液混合后在0.8 %琼脂糖凝胶中检测 预扩增的效果，样品用0.1Х TE稀释20倍，-20 ?保存。 (6)DNA样品的扩增 预扩增产物需稀释到一定倍数才能进行选择性扩增，否则会产生类似“smear”的现象，具体的稀 释倍数视预扩增结果而定。 ? 将10 × PCR缓冲液、MseI引物II、EcoRI引物II、dNTP、DNA聚合酶和无菌去离子水置于冰上 溶解。 ? 依次向无菌的200 µL离心管中加入如下成份，加水至终体积为20 µL。轻轻混匀，离心去除气泡。 稀释的预扩增产物 5 µL 引物 各25 ng dNTP 4 nmol PCR缓冲液 1Х DNA聚合酶 1 U ? 按照如下反应条件进行PCR反应。 94 ? 2 min 94 ? 30 sec 12循环，退火温度65 ? 30 sec 每循环降低0.7 ? 72 ? 60 sec 94 ? 30 sec 56 ? 30 sec 23循环 72 ? 60 sec 5 4 ? ? ? 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。 6. 注意事项 (1)基因组DNA应具有较好的纯度。 (2)内切酶的选择应慎重。 (3)要确定适宜的酶切时间，酶切时间太长浪费时间，酶切时间太短则PCR产物大片段较多、带 型密集、不易分辨。必须保证基因组DNA酶切完全，否则会影响最终实验结果。 (4)制作聚丙烯酰胺凝胶时，胶平板应格外清洁，否则残留去污剂会导致银染时产生褐色背景或在 灌胶时产生气泡。从而影响DNA分子条带的形状(如使条带成锯齿形)与迁移方向。 (5)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，注意样品要变性完全。如若样品变性不充分，样品孔内会有很深 的条带。电泳前必须完全冲洗干净点样孔中的尿素和未聚合的丙烯酞胺。如孔中残留有尿素，跑 出的条带会发虚，丙烯酞胺的残留则会使带弯曲。 7. 作业 (1)AFLP接头的组成。设计接头时应考虑哪些因素? (2)选择内切酶要考虑哪些问题, 6 7