抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法 抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法 一、 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法) 1、试剂的配制 (1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8): A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4?12H2O(分子量358.14)71.7g; B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4?2H2O(分子量156.01)31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP(聚乙烯吡咯烷酮) 参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000:267,268。 (2)130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1.399g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托 (3)100μmol/L EDTA-Na2溶液:取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml; (4)100μM核黄素溶液:取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍 (5)750μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存; —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 酶液制备:取一定部位的植物叶片(视需要定，去叶脉)0.5g于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。 提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4?的冰箱里。 2、酶活性测定 2(显色反应 取试管( 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 透明度好)5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 39-1加入各溶液。 混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长)。 表39-1 各溶液加入量 试 剂(酶) 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶 液 蒸馏水 总体积 加核黄素时记得要快并且要避光， SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性: 用量(ml) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 终浓度(比色时) 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 空白和对照管加缓冲液代替 酶液 SOD总活性= 式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg蛋白表示; A0—照光对照管的消光度值; AS—样品管的消光度值; VT—样液总体积(ml); V1—测定时样品用量(ml); FW—样重(g); 蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。 用荧光灯20w照20min可以吗 不可以, 二、POD、CAT酶活性的测定 粗酶液制备同SOD。 1、 过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法) (1)试剂配制: 100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0):分别取A母液(Na2HPO4 ) 61.5ml 和B母液(NaH2PO4 ) 438.5ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0); (2)反应混合液配制: 取50ml PBS(100mmM，pH6.0)，加入28ul愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解，冷 (A0?AS)?VT A0?0.5?FW?V1 却后加入19ul 30,的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。 (3)样品测定: —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 称取1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。 取试管3支，一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零，两支取3ml反应液并加入1ml酶液，立即计时，在470nm测定，酶隔30s读 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 一次。测一个样加一个，不要全部加上。(边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大) (4)酶活性计算:以每min OD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。 POD=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.01×t) (u/g min) ΔA470:为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积;Vs为测定时取用酶液体积。 2、 过氧化氢酶(CAT)活性测定 (1)试剂配制: 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.0):取A母液(Na2HPO4) 61.0 ml 和B母液(NaH2PO4) 39.0 ml混合后至100ml。(加1gPVP) (2)反应液配制:吸取5.68ml 30%的H2O2(原液)稀释至1000ml，摇匀即可。 (3)样品测定:1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2,3ml 4?下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4?冰箱中静 置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧 化氢酶粗提液。4?下保存备用. 2.测定:取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白 管(加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后加入H2O2测定吸 光值)，按表40-2顺序加入试剂。 表40-2 紫外吸收法测定H2O2 样品液配置表 管 号 粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸馏水(ml) S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 S3 0.2 1.5 1.0 25?预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即 记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 调零用磷酸缓冲液(pH=7.8) 3.结果计算: 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。 过氧化氢酶活性(u/g/min)= A240×Vt/0.1×V1×t×FW 式中 A240 = AS0, (AS1+AS2)/2 AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值; AS1, AS2—样品管吸光值; Vt—粗酶提取液总体积(ml); —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ V1—测定用粗酶液体积(ml); FW—样品鲜重(g); 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u); t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min) 五、丙二醛含量的测定 1、试剂配制: 10%TCA:100g 三氯乙酸 ? 1L 0.6%TBA:0.6g硫代巴比妥酸 ,加少量氢氧化钠(1mol/l)溶解 ?用10%TCA定容100ml (避光) 1mol/l氢氧化钠;称4gNaOH用蒸馏水溶解定容100ml 3、 测定步骤: 称取剪碎的试材1g，加入2ml 10,TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心(4000r)离心10min，上清液为样品提取液。 3. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。 (2) 双组分分光光度法 按公式?可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。 用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量: MDA(μmol/g FW), —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ C2(umol/L)=6.45*(D532,D600),0.56*D450 C2,为MDA的浓度; D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。 七、可溶性蛋白含量的测定(考马斯亮蓝染色法) 1、试剂的配制 (1)考马斯亮蓝溶液配制:称取0.001g考马斯亮蓝，溶于50 ml 90,乙醇中，加入100 ml 85,(W/V)的磷酸(不懂)，85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是85%的磷酸，加入100ml就行。再用蒸馏水定容到1,，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。 (2)100μg/ml牛血清蛋白(BSA) 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液:称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml(也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液)。 2、样品可溶性蛋白含量的测定 (1)样品可溶性蛋白含量测定:称取鲜样0.5g, 用5ml蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。吸取样品提取液1.0Ml，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G,250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。调零管是用蒸馏水 样品中蛋白质的含量(Mg,g),C×VT/(V1×FW×1000)(2-2) 式中C:查标准曲线值(μg);VT:提取液总体积(Ml); ,W:样品鲜重(g); V1:测定时加样量(Ml)。 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 我就测这五个所以帮下我谢谢。 ——————————————————————————————————————