分子杂交技术

分子杂交技术 [编辑本段] 概述: 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法,多使用甾类化合物地高辛配基(digoxigenin，DIG)标记。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 [编辑本段] 核酸探针标记的方法 核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 一、双链DNA探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。 双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。 1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶?就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'?3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶?的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。 材料: 待标记的DNA。 设备:高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂: (1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。 (2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris?Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。 (3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。 (4) E.coli DNA聚合酶?(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris?Cl(pH7.5)中。 (5)DNA酶?:1mg/ml。 (6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。 (7)10mol/L NH4Ac。 操作步骤: (1) 按下列配比混合: 未标记的dNTP 10μl 10×切口平移缓冲液 5μl 待标记的DNA 1μg [α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl E.coli DNA聚合酶 4单位 DAN酶 I 1μl 加水至终体积 50μl (2) 置于15?水浴60分钟。 (3) 加入5μl EDTA终止反应。 (4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。 [注意] 1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。 2、DNA酶?的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶?活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。 2. 随机引物合成法 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是:(1)Klenow片段没有5'?3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。 材料:待标记的DNA片段。 设备:高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂: (1)随机引物(随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA)。 (2)10×随机标记缓冲液:900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。 (3)Klenow片段。 (4)20mmol/L DTT。 (5)未标记的dNTP溶液:dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。 (6)[α-32 P] dATP:比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。 (7)缓冲液A:50mmol/L Tris?Cl (pH7.5); 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0); 0.5% SDS。 操作步骤: (1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。 (2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物: 20mmol/L DTT 1μl 未标记的dNTP溶液 1μl 10×随机标记缓冲液 1μl [α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl ddH2O 1μl (3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。 (4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。 (5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20?下备用。同时计算放射比活性。 [注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多;反之，则可获得较长片段的探针。 2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。 二、单链DNA探针 用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。 1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。 材料:已制备好的单链DNA模板(方法参见第十章中有关内容)。 设备:高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂: (1)10×Klenow缓冲液:0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris?Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。 (2)0.1mol/L DTT溶液。 (3) [α-32 P] dATP:3000Ci/mmol, 10μCi/μl。 (4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。 (5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。 (6) Klenow片段(5单位/ml)。 (7)适宜的限制酶，如EcoR?、Hind?等。 (8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。 操作步骤: (1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液: 单链模板(约0.5pmol) 1mg 适当引物 5pmol 10×Klenow缓冲液 3ml 加水至 20ml (2)将eppendorf管加热到85? 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37?; (3)依次加入: DTT 2ml [a-32P]dATP 5ml 未标记的dATP 1ml dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml 混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。 (4)加1ml(5单位)Klenow酶室温下30分钟。 (5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。 (6)68?加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。 (7)加入20单位限制性内切酶(如EcoR?, Hind?等)酶切1小时。 (8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。 (9)用电泳方法分离放射性标记的探针。 2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。 反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料:已提纯的RNA或mRNA 设备:高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂: (1)合适的引物:随机引物或oligo(dT)15-18。 (2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。 (3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。 (4)反转录酶(200000单位/ml)。 (5)100mmol/L DTT。 (6)250mmol/L MgCl2。 (7)1mol/L KCl。 (8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。 (9)10% SDS。 (10)RNasin(40单位/ml)。 操作步骤: (1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂: RNA或mRNA 10.0ml 合适的产物(1mg/ml) 10.0ml 1mol/L Tris?Cl(pH7.6) 2.5ml 1mol/L KCl 3.5ml 250mmol/L MgCl2 2.0ml 5mmol/L dNTP 10.0ml [a-32P]dCTP 10.0ml 0.1mol/L DTT 2.0ml Rnasin 20U 加水至 48ml 反转录酶(200000单位/ml) 2ml 混匀后,稍稍离心，37?保温2小时。 (2) 反应完毕后加入下列试剂: 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml (3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68?保温30分钟以水解RNA。 (4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris?Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。 (5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。 三、 末端标记DNA探针 现以Klenow片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。 1、材料:待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。 2、设备:高速台式离心机，水浴锅等。 3、试剂: (1)3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。 (2)合适的限制酶。 (3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。 (4)Klenow片段(5U/ml)。 (5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。 4、操作步骤: (1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。 (2)按下列成分加入试剂并混匀: 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml (3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。 (5)70?加热5分钟,终止反应。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。 [注意] 1、利用本方法可对DNA分子量 标准 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许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是: RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。 噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。 用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。并且用来合成RNA的模板能转录多次，可获得比单链DNA更高产量的RNA。 反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶?处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。 另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase;另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。 [编辑本段] 几种常见的杂交 分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类: (1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 (2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。不同商标的尼龙 膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。 一、Southern杂交 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤: (1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。 Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。 将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。 1、材料: 待检测的DNA，已标记好的探针。 2、设备: 电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。 3、试剂: (1)10mg/ml 溴化乙锭(EB)。 (2)50×Denhardt's溶液:5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,过滤除菌后于-20?储存。 (3)1×BLOTTO:5g脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4?。 (4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。 (5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。 (6)0.2mol/L HCl。 (7)0.1% SDS。 (8)0.4mol/L NaOH。 (9)变性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。 (10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris?Cl, 加水至1000ml。 (11)硝酸纤维素滤膜。 (12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L柠檬酸钠,用1mol/L HCl调节pH至7.0; (13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀释。 4、操作步骤: (1) 约50μl体积中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24小时(包括DNA分子量标准物)。 (2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30分钟, 然后照相。 (3) 依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动: 500ml 0.2mol/L HCl 10分钟, 倾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸处理时间为20分钟)，用水清洗数次,倾去溶液; 500ml变性溶液两次,每次15分钟,倾去溶液; 500ml中和溶液30分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。 (4) 戴上手套,在盘中加20×SSC液,将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×SSC浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×SSC液的3滤纸盖住滤膜,然后加上干的3滤纸和干纸巾,根据DNA复杂程度转移2-12小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。简单的印迹转移2-3小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。 (5) 去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC中洗5分钟,凉干后在80?中烘烤2小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。 (6) 将滤膜放入含6-10ml预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42?)预杂交3-12小时，弃去预杂交液。 (7) 制备同位素标记探针(参见第一节)，探针煮沸变性5分钟。 (8) 在杂交液中加入探针,混匀。如步骤(6)将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。 (9) 取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动: 在室温下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。 在杂交温度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。 (10) 空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可见DNA谱带。对于?108 cpm/μg从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg哺乳DNA中检测到10pg的单拷贝基因。 二、Northern杂交 Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。 1、材料:待检测的RNA及制备好的探针。 2、设备:电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。 3、试剂: (1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。 (2)其他试剂:与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。 4、操作步骤: (1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法 与转移DNA的方法相似。 (2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。 (3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80?干燥0.5-2小时。 (4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42?进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS;若于68?进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS，(注意:BLOTTO不能用于Northern杂交)。 (5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分?μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。 (6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68?洗膜3次,每次20分钟。 (7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70?曝光24-48小时。 [注意] (1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。 (2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris?Cl (pH8.0)于65?洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。 (3)RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。 (4)含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室温晾干。 (5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。 (6)如用中性缓冲液进行RNA转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80?干烤0.5-2小时,或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。 三、菌落原位杂交 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(100-200)进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4?直至得到筛选结果。 1、材料:待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。 2、设备:恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。 3、试剂: (1)LB固体培养基。 (2)0.5mol/L NaOH。 (3)1mol/L Tris?Cl。 (4)1.5mol/L NaCl。 (5)0.5mol/L Tris?Cl。 (6)预洗液:5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。 (7)预杂交液:50%甲酰胺，6×SSC(或6×SSPE)，0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。 (8)其余试剂:与Southern杂交相同。 4、操作步骤: 1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上: (1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。 (2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒(如pBR322)的菌落。 (3) 倒置平板,于37?培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。 (4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。 (5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4?,直至获得杂交反应的结果。 (6) 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。 2. 菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜 (1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。 (2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤(1)。 (3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris?Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。 (4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris?Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。 (5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80?干烤2小时,固定DNA。 (6) 将固定在膜上的DNA与32 P标记的探针杂交。 ,.杂交 (1) 盛有2×SSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5分钟。 (2) 将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50?处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。 (3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。 (4) 将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68?，而在50%甲酰胺中杂交时用42?)下,预杂交1-2小时。 (5) 将32 P标记的双链DNA探针于100?加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。 (6) 杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。 (7)68?用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次,每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68?将滤膜浸泡60分钟。 (8) 把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。 (9) 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70?曝光12-16小时。 (10) 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。 四、斑点杂交 斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。 1、材料:待分析的DNA或RNA样品，已标记的探针。 2、设备:狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。 3、试剂: (1)100% 甲酰胺。 (2)甲醛(37%)。 (3) 20×SSC。 (4)0.1mol/L NaOH。 (5)硝酸纤维素滤膜。 (6)滤纸。 4、操作步骤: (1) 10μl样品与20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68?，15分钟后置冰浴中。 (2) 用0.1mol/L NaOH清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC浸润1小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。 (3) 用10×SSC清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗两次。继续抽吸5分钟,吸干滤膜。 (4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80?真空烘干2小时。按上述Southern或Norhtern杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。 [注意] 1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。 2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。 第三节 杂交反应的条件及参数的优化 不同的反应条件对杂交结果的影响如下: (1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间:一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。 (2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度:一般来说，杂交相为水溶液时,则在68?杂交,而在50%甲酰胺溶液中时,则在42?下杂交。 (3) 选用不同的封闭试剂:如Denhardt's试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的 BLOTTO, 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardt's试剂相比, BLOTTO价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt's试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言,通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。 (4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度,许多杂交膜一起反应时,连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。 (5) 在杂交过程中加入其他化合物, 如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探针的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。 (6) 根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度,如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式(高浓度SSC), 反之则选用非严紧型洗脱方式(低浓度SSC)。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20?的条件下进行。解链温度(melting temperature, Tm )是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G?C碱基对的序列比富含A?T碱基对序列的Tm 温度高。有关Tm的计算方法，请参考第八章。 (7) 根据标记探针的浓度及其比活性,选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。 (8) 在水溶液中杂交时,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时,应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。 上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。