苯酚-硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量

苯酚-硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量 动物医学进展.2011,32(9):54—57 ProgressinVeterinaryMedicine 苯酚一硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量 张健,王成龙一,李引乾.,丁伯良,秦保亮.,王英珍 ((1.天津市畜牧兽医研究所,天津300112;2.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵712100I 3.新乡市畜牧局,河南新乡453003) 摘要:参照相关多糖含量的测定方法,以葡萄糖为标准品,应用苯酚一硫酸法对硫酸酯化酵母萄聚糖含 量测定的方法进行了研究.该方法在0.010mg/mL~0.500mg/mL范围内呈良好的线性关系,线性方程 为y一2.025x+0.1986,R.一0.9916.另外,还对本方法的重复性,回收率和稳定性等方面进行了试验.结 果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,该方法可应用于硫酸酯化酵母葡聚糖含量的测定. 关键词:硫酸酯化酵母葡聚糖;含量测定;苯酚一硫酸法 中图分类号:$859.7文献标识码:A文章编号:1007—5038(2011)09?0054—04 酵母葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种活性 多糖,它能够增强哺乳动物的免疫力,同时又具有抗 癌,抗病原微生物感染,降低胆固醇和血脂,促进伤 口愈合等功能,所以越来越受到人们的关注.但由 于其不溶于水,使其在应用方面受到了很大的限制. 水不溶性酵母葡聚糖提取物通过非均相磺化反应后 得到水溶性硫酸化酵母葡聚糖.目前关于硫酸酯化 酵母葡聚糖含量测定的方法尚未见报道.苯酚一硫 酸法是目前测定多糖含量较常用的方法,其利用多 糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成 糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物的原理, 通过比色法的方法对糖含量进行定量的分析.本试 验在参照相关多糖含量测定方法的基础上,采用苯 酚一硫酸法,对硫酸酯化酵母葡聚糖的含量测定方法 进行比较,以确立测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量的 最佳试验条件,探索水溶性酵母葡聚糖含量的检测 方法,为水溶性酵母葡聚糖作为奶牛乳房炎免疫增 强注射剂乃至在其他动物体上的应用奠定基础. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 1.1.1样品酵母葡聚糖(含量经鉴定为97,批号: 20100702-1),为湖北安琪酵母股份有限公司产品. 1.1.2仪器紫外分光光度计(TU-1901),为北京 普析通用仪器有限公司产品;FTIR-650傅立叶变换 红外光谱仪,为天津港东股份有限公司产品;SOR— VAL高速冷冻离心机,为日立公司产品;77530 Labeonco冷冻干燥机,为Labconco公司产品;恒温 水浴锅. 1.1.3试剂葡萄糖,批号:030423,为天津市化学 试剂三厂产品.正丙醇,浓硫酸,苯酚,均为国产分 析纯. 1.2方法 1.2:1硫酸酯化酵母葡聚糖的制备将浓硫酸慢 慢滴加到990mL/L正丙醇中(硫酸:正丙醇一 1.39:1.O0,mol/mo1),边滴边搅拌,制备反应液. 混合完后,将酵母葡聚糖加到上述反应液中,一6”C 反应2h.反应结束后,立即在,1O?下,14000 r/rain离心12min,去除反应液.然后用预冷的正丙 醇洗涤沉淀3次.沉淀再用去离子水溶解,离心,除 去未反应的p-1,3-酵母葡聚糖沉淀,最后将上述的 上清液冷冻干燥[?. 1.2.2硫酸酯化酵母葡聚糖的鉴定硫酸酯化酵 母葡聚糖通过KBr压片,经FTIR-650傅立叶变换 红外光谱仪分析,扫描范围为4000cm,400 cm_. . 1.2.3溶液的配制 1.2.3.1葡萄糖标准溶液的配制精确称取 105?干燥至恒重的葡萄糖i00mg,置100mL容量 瓶中加水定容至刻度,即为葡萄糖标准溶液. 1.2.3.2硫酸酯化酵母葡聚糖标准溶液的配制 精确称取硫酸酯化葡聚糖样品100mg,置于100 mL容量瓶中,溶解后,加水定容至刻度. 1.2.4测定条件的确立 1.2.4.1反应液最大吸收波长的测定精密吸取 收稿日期:2011-03-08 基金项目:天津市科技支撑计划重点项目(O9ZCGYNCOO100) 作者简介:张健(1964一),男,天津人.副研究员,主要从事兽医临床研究.*通讯作者 张健等:苯酚一硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量55 葡萄糖标准溶液1mL,用无离子水补至2mL.加入 5的苯酚2.0mL,摇匀,迅速滴加适量的浓硫酸7 mL,摇匀后静置5min,于100?沸水中放置30m.in, 冷却后,用紫外分光光度计在460nm~530nlTl范围 内进行扫描,寻找最大吸收峰L2]. 1.2.4.2温度对反应液吸光度的影响吸取葡萄糖 标准溶液1.0mL,共8份,分别加无离子水至2.0 mL,各置于2OmL具塞刻度试管中,按1.2.4.1项操 作,分别在65,70,75,8O,85,9O,95,100?水浴3O rnin.待冷却后,用紫外分光光度计在490nln处测定 吸光度.同法测定3次. 1.2.4.3时间对反应液吸光度的影响吸取葡萄糖 标准溶液1.0mL,共8份,分别加无离子水至2.0 mL,各置于20mL具塞刻度试管中,按1.2.4.1项操 作,沸水中放置时间分别设定为10,15,2O,25,3O,35, 40,45min时取出,放至室温冷却,测定吸光度.同法 测定3次. 1.2.4.4硫酸浓度对反应液吸光度的影响吸取葡 萄糖标准溶液1.0mL,共7份,分别加无离子水至2.0 mL,各置于2OmL具塞刻度试管中.按1.2.4.1项 操作,各加入浓硫酸3,4,5,6,7.8,9mL,充分振摇,静 置5min,于100?水浴加热30min.取出,放至室温, 测定吸光度.同法测定3次. 1.2.5标准曲线的建立精确称取葡萄糖标准溶液 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL于20mL具塞试管中,用 无离子水补至2mL.各试管加入50ml/L的苯酚2.0 rnL,摇匀,迅速滴加浓硫酸7mL,摇匀后静置5min, 于100?沸水中放置30min,冷却后以第一管的吸光 度为空白测定其他各管在490nm处的吸光度,绘制 标准曲线,并计算其标准曲线回归方程. 1.2.6换算因素的测定精确称取硫酸酯化酵母葡聚 糖20mg,置100mL容量瓶中,加少量水溶解并稀释 至刻度,摇匀作贮备液.精确吸取贮备液0.2mL,按 照上述方法测定吸光度,从回归方程中求出供试液中 硫酸酯化酵母葡聚糖含量.按下列公式计算换算因 子:{=W/CXd,式中w为硫酸酯化酵母葡聚糖重量 (g),C为硫酸酯化酵母葡聚糖溶液中水解的葡萄糖浓 度(g/mL),d为硫酸酯化酵母葡聚糖的稀释倍数[3]. 1.2.7硫酸酯化酵母葡聚糖含量的测定精确吸取 硫酸酯化葡聚糖样品1.0mL,样品按1.2.5项的方法 测其吸光值.按回归方程求出硫酸酯化酵母葡聚糖 溶液中葡萄糖含量,按下式计算样品中硫酸酯化酵母 葡聚糖的含量:硫酸酯化酵母葡聚糖含量()一cXd ×f/wX100,式中C为样品溶液中葡萄糖的含量 (g/mL);d为供试样品溶液的稀释倍数;f为换算因 子;w为供试品重量(g). 1.2.8处理样品稳定性试验取不同批次制备的硫 酸酯化酵母葡聚糖按1.2.5项的方法分别测定其吸 光值,分别将测定吸光值代人1.2.7项公式中计算出 硫酸酯化酵母葡聚糖的百分比含量,并将同一批次显 色后的硫酸酯化酵母葡聚糖样品溶液每隔30min测 定一次吸光度,连续1d观察处理样品的稳定性. 1.2.9重复性试验取待测的同一批硫酸酯化酵母 葡聚糖样品溶液6份,分别测定其多糖含量[4]. t.2.10回收率试验采用加样回收法,即称取硫酸 酯化酵母葡聚糖样品50mg置于100mL容量瓶中, 制备成样品溶液.分别吸取3份样品溶液各0.5mL, 置于20mL具塞试管中,然后分别加入标准葡萄糖溶 液0.2,0.4.0.6mL,各加水补至2mL,按照1.2.5的 方法分别测处理样品的吸光度.根据葡萄糖的检出 量,计算其回收率【4]. 2结果 2.1硫酸酯化酵母葡聚糖的鉴定 硫酸酯化葡聚糖的红外光谱图若在3600cm , 3200CITI处出现l宽峰,在800cm,86Ocm一 处有糖环C-O-S伸缩振动的特征吸收峰,在1240 cm-1附近有一()-So3的S一0伸缩振动吸收峰,即可定 性判断酵母葡聚糖残基连接上了硫酸基团[5].由图1 可知,样品在3228,1250,796cm均有吸收峰,由此 可鉴定样品为硫酸酯化酵母葡聚糖.图1为磺化后 的酵母葡聚糖红外光谱图,图2为磺化前酵母葡聚糖 的红外光谱图. 2.2测定条件的确立 2.2.1最大吸收波长的确立通过紫外分光光度计 在460nm~530ilin范围内扫描的吸光值试验,结果 表明葡萄糖标准样品在490nrn处的光吸收值最大, 可以确立葡萄糖最佳吸收波长为490nm(图3). 2.2.2最佳水解温度的确立通过不同水解温度对 吸光值的影响试验,结果表明水解温度在100?时,葡 萄糖标准样品的吸光值最大,可以确立1OO?为最佳 的水解温度(图4). 2.2.3最佳水解时间的确立不同时间对吸光值的 影响试验结果表明,水解时间在30min时,葡萄糖标 准样品的吸光值最大,水解时间30min可以确立为最 佳的水解时间(图5). 2.2.4最佳浓硫酸的添加量不同浓硫酸添加量的 试验结果表明,浓硫酸的添加量在7mL时,葡萄糖标 准样品的吸光值最大,可以确立7mL为最佳的浓硫 酸添加量(图6). 56动物医学进展2011年第32卷第9期(总第219期) 2.3标准曲线的确立 试验结果表明,标准曲线方程为Y一2.025x+ 0.1986,r2=0.9916.可见葡萄糖的浓度在0.010 V,一l; 蓄…一一萄…”蔷茹……,一…一 波数/cm.Wavenumber 圈1硫酸化酵母葡聚糖 Fig.1Sulfatedyeastglucan D 《 {越 螫 一一???l_口疆 波长,nmWavelength 图3葡萄糖最大吸收波长 Fig.3Msxilllulnabsorptionwavelengthofglucose ‘r~/minTime’’ 围5时间对吸光值的影响 Fig.5EffectoftimeonODvalue EffectoftemperatureonODvalue ‘?;?I?? 硫酸/mLSulfuricacid 图6硫酸对吸光值的影响 Fig.6EffectofvitriolonODvalue 样品在3h内有较高的稳定性,相对误差为0.60A;3h 后光密度(0D)开始下降.说明该硫酸酯化酵母葡聚 糖不同批次之间差异不大,且性质稳定;并且该法处理 , 一 一 mm????m???0棚,I 笤II墨昌?II毫o/0\脚 一一.I;:.:,:.!胄oolI暑g?II砖.IIL,料挈f罄:,U sq《避皋 张健等:苯酚一硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量57 的样品在3h内基本稳定.所以应用该方法进行测水解时间30rain,硫酸加入量7.0mL.最后通过稳 定时,需在3h内用紫外分光光度计进行含量测定.定性,重复性和回收率等指标对该方法进行评价,表 2.5试验的重复性明该法准确,稳定,可靠,可作为硫酸酯化酵母葡聚糖 测定同一批次样品6份,其含量基本相同,RSD及其相关的硫酸酯化多糖产品含量测定的一种有效 为0.62%.方法. 2.6试验样品的回收率水不溶性酵母葡聚糖通过处理后得到水溶性酵 经测定,3份样品的平均回收率为99.4%,RSD母葡聚糖,使得酵母葡聚糖作为免疫增强剂的应用除 为0.8.了通过口服途径外,还可通过注射途径发挥其更好的 3讨论免疫增强作用.硫酸酯化酵母葡聚糖含量测定方法 目前多糖含量测定的方法有:化学测定法,色谱的确立,为检测水溶性硫酸酯化酵母葡聚糖产品的质 测定法,毛细管电泳测定法和红外光谱测定法等.量提供了一个可靠的测定方法,同时也为水溶性硫酸 化学法具有操作简单,快捷,重复性好,显色后稳定性酯化酵母葡聚糖作为奶牛乳房炎免疫增强注射剂乃 好和葡萄糖即可做为标准品等优点,是多糖含量测定至在其他动物体上的应用奠定了基础. 中常用的方法.色谱测定法,毛细管电泳测定法和红x陬: 外光谱法测定法需要相关的仪器和专业人员,而且需E1].”fY1J’Y.,aoSJ,G.ua”YA”.:.....pre. 要相应的葡聚糖作为标准品.钟方晓对化学法中dits.truct1elucidati.[J].crb.hydrat.P.ly.rs,2oo5, 的苯酚一硫酸法和蒽酮一硫酸法在多糖含量测定上的59:93—99. 可行性和稳定性进行了比较,结果表明硫酸一苯酚法E23何国光,刘晔玮,张鹤,等.黄参多糖含量测定条件优选[J].中 是较理想的多糖含量测定方法.故本试验采用了化国公共卫生,...,.():1400-1403. 学法中的苯酚_硫酸法作为葡聚糖硫酸酯含量测定的嘲定灵芝多糖含量的条件 方法.E4]王海侠,吴云,时维静,等.白茅根多糖的提取与含量测定[J]. 硫酸酯化酵母葡聚糖组成复杂,且相应的葡聚糖中国中医药信息杂志,2010,17(2):55—59. 对照品获得困难,所以给硫酸酯化酵母葡聚糖含量的[53葛青,张宝强,孙培龙.真菌多糖结构修饰及鉴定研究进展 精确测定带来一定的困难.当葡聚糖组成复杂时,往[J]’中国食用菌,2008,27(1):5-8? 往以葡聚糖的水解产物如葡萄糖代替对照品,以测定[]徐晓飞’陈健?多糖含量测定的研究进展口]_食品科学’.0., 样品多糖的相对含量.所以,本试验用葡萄糖作为[7]钟方晓,任海华,李岩.多糖含量测定方法的比较[J].时珍国 标准品,来测定硫酸酯化酵母葡聚糖的相对含量.医国药,2007,18(8):1916—1917. 通过多次试验结果比较,确立了测定硫酸酯化酵[8]王玮.苯酚_硫酸法测定猕猴桃根中的多糖含量[J].药学进展, 母葡聚糖含量的最佳试验条件为:水解温度100?,2010,34(5):225—230? DeterminationofSulfatedYeastGlucanContent , UsingPhenol—sulfuricAcidMethod ZHANGJian,WANGCheng-long,,LIYin—qian.,DINGBo—liang, QINBao—Liang.,WANGYing—zhenI (1.TianjinInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,Tianjin,30 0112,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine, NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 3.AnimalHusbandryandVeterinaryBureauofXinxiang,Xinxiang,Henan,453003,China) Abstract:Th,sstudyestablishedamethodfordeterminationofsulfatedyeastglueancontentusingthephe— nol-sulfuricacidreactionbasedonotherdeterminatedmethodofpolysaccharidecontent.Thismethod showedagoodlinearrelationshipintherangeof0.010mg/mL--0.500mg/mL,Itslinearequationisy一 2.025x+0.1986,r2—0.9916.Therepeatability,recoveryandstabilityofthismethodweredetectedin thisexperiment.Theresultsshowedthatthismethodcanbeusedforthedeterminationofsulfatedyeast glucancontent. Keywords:sulfatedyeastglucan;contentdetermination;phenol—sulfurica cidmethod