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Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长作用研究(可编辑).doc

Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长作用研究(可…

SamanthaOK
2017-11-01 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长作用研究(可编辑)doc》,可适用于初中教育领域

Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长作用研究(可编辑)Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长作用研究第三军医大学博士学位论文Versican基因对毛乳头细胞凝集性生长的作用研究姓名:杨亚东申请学位级别:博士专业:皮肤病与性病学指导教师:伍津津第二军医大学博七学位论文基因对毛乳头细胞凝集性生长的作用研究摘要背景及目的:毛乳头所固有的诱导毛囊形成的特性得到了广泛认同。即使将体外培养的毛乳头细胞移植入正常皮肤,仍然具有诱导毛发生长作用。每个毛囊都有自己固有的生长节律,其生长周期并非同步进行,所以单个毛囊的周期性生长受到多种毛囊自身细胞的信号调控。目前对于毛囊生长周期中各种基因的表达变化所知甚少。毛囊的分子生物学研究还需要深入探讨。至今无毛囊体外重建成功的报道,其原因在于,这些研究仅仅模拟了毛囊上皮和间质的接触作用环境,而无法真正提供含有细胞因子、细胞外基质等重要成分的体内环境,无法从根本上提供毛囊形成的基本条件。显然细胞因子、细胞外基质在毛囊发育中的发挥着重要作用。而基因的表达与毛乳头细胞的凝集性生长显正相关,同时信号通路控制着的表达。因此,我们推测基因有可能是控制毛乳头细胞凝集性生长的关键基因。本研究在我科建立的高效简便分离毛乳头细胞的方法基础上,应用二步酶消化法分离毛乳头细胞、并进行体外培养,观察其体外培养的生物学特性应用检测和的蛋白表达水平、激光共聚焦显微镜检测其标记强度、法检测和的基因表达,并用干扰的表达等方法研究基因在毛乳头凝集性生长方式中的重要作用,为进一步研究毛囊的生物学特征及毛囊形成过程中的影响因素奠定基础,为以为靶点研究毛囊生物学特征提供良好的实验证据和理论支持。方法:利用二步酶消化法分别培养毛乳头细胞、真皮鞘细胞、成纤维细胞和角质形成细胞,观察不同代次毛乳头细胞凝集性生长的特征变化,应用色法检测细胞不同代次毛乳头细胞中和的表达变化采用基因转染技术构建重组腺病毒颗粒删一并扩增。并观察低代、高代代毛乳头细胞,一转染、、一诱导的高代凝集性生长毛乳头细胞以及角质形成细胞、成纤维细胞和毛囊真皮鞘细胞中和的表达变化差异通过重组腺病毒颗粒删转染毛乳头细胞,观察外源性过表达对毛乳头细胞生长方式的影响法检测各组细胞中,第二军医人学博十学位论文和不同亚型的表达情况激光共聚焦显微镜检测应用、抗体标记的各组细胞表达变化并且以一腺病毒感染高代毛乳头细胞,对比观察感染腺病毒后高代毛乳头细胞及基因表达变化。观察高代毛乳头细胞感染一表达腺病毒后的生长特性变化。用合成片段转染低代毛乳头细胞,观察干扰基因的表达对低代毛乳头细胞凝集性生长的影响。结果:体外培养的毛乳头细胞有凝集性生长的特性,其凝集性生长特性随培养代次的增加逐渐减弱。方法检测不同代次毛乳头细胞及蛋白水平变化,发现随着毛乳头细胞传代次数的增加,及蛋白表达水平逐渐降低,且蛋白降低幅度更大低代毛乳头细胞两种基因表达与对照组成纤维细胞、毛囊真皮鞘细胞和角质形成细胞相比均有明显差异,与高代毛乳头细胞比较则有显著差异观察不同代次毛乳头细胞凝集性生长状态的变化,发现随着代次逐渐增高,毛乳头细胞凝集性生长趋势逐渐减弱,其减弱趋势与基因变化时间及幅度大致相同。采用成功构建一表达腺病毒颗粒感染高代毛乳头细胞后及基因和蛋白水平均明显上调,基因上调更显著达到了与低代毛乳头细胞基本相同的水平一腺病毒感染高代毛乳头细胞后其出现凝集性生长方式,与低代毛乳头细胞的凝集性生长相似。能有效干扰基因在低代毛乳头细胞中的表达,其抑制效应呈时间和强度依赖性,且在和蛋能显著改白水平均有显著抑制,对基因表达没有显著影响变低代毛乳头细胞的生长方式,使其原本的凝集性生长方式消失,与高代毛乳头细胞的生长方式相似。结论:一、蛋白水平表达与毛乳头细胞凝集性生长密切相关通过不同代次毛乳头细胞中和表达研究,首次证明了和毛乳头细胞凝集性生长的关系。随着毛乳头细胞代次增加,其凝集性生长的趋势减弱,毛乳头细胞和的表达逐渐降低,其中的降低不如明显,而的降低趋势和凝集性生长特性改变相关性紧密。二、信号通道调节参与毛乳头细胞凝集性生长特性的调控。的过度表达有明确的诱导毛乳头细胞凝集性生长的作用,作用机制可能是通过相关基因、的表达改变来实现,并且其调节水平需达到一定的阈值方可发挥作用。而也有部分诱导毛乳头细胞凝集性生长的作用,作用机制与其中含有部第三军医大学博士学位论文分细胞因子有关。三、对毛乳头细胞表达和锄有明确调节作用。过度表达具有诱导人毛乳头细胞和水平上调的能力且诱导人毛乳头细胞水平上调的能力大于诱导水平上调的能力,同时和的基因水平和蛋白水平的改变不对称,因此可以初步明确对蛋白水平的调控过程可能以转录过程的调节为主,但受到多种因素的影响。四、应用干扰技术特异性的干扰毛乳头细胞基因表达时,低代毛乳头细胞蛋白的表达降低,并且具有时间和浓度依赖性。的亚型对毛乳头细胞的凝集性生长特性影响较明显,而和亚型可能不参与该特性的调控。干扰低代毛乳头细胞的表达时其凝集性生长特性逐渐消失,进一步说明基因在毛乳头细胞的凝集性生长中具有重要作用。关键词:毛乳头细胞、凝集性生长、锄、、一、第二军医大学博士学位论文】:,,,,,”,色,,,印,,略:,姗第二军医人学博学位论文,一艳、,,,一,一一一’一,’’,一色托:订,,咖,彻,一第三军医人学博士学位论文啪:,锄一,,衄艳’,:,,、,伦,,、一,色,”【、,一一,色,,第二军医人学博士学位论文色,,诧,,,:色一第三军医人学博学位论文英文缩写一览表英文缩写英文全称中文全称细胞因子,双蒸水脱氧核糖核酸’培养基’毛乳头毛乳头细胞真皮鞘细胞细胞外基质成纤维细胞胎牛血清苏木素伊红染色羟乙基哌嗪乙磺酸一一毛囊毛囊角质形成细胞内根鞘免疫组织化学绿色荧光蛋白甘油醛一一磷酸脱氢酶一一角质形成细胞新生小牛血清外根鞘磷酸盐缓冲液聚合酶链反应印转分逆转录反应第三军医大学博士学位论文反转录干细胞皮肤替代物半定量转化生长因子细胞因子血管内皮生长因第三军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风,本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。~多眵易论文作者签名:厶絮,冀指导教师签名:日期:二,涵第二军医人学博士学位论文基因对毛乳头细胞凝集性生长的作用研究※‘一月吾毛乳头细胞,在诱导毛囊,发育及维持毛发生长中起至关重要的作用。在胚胎形成过程中形成是在间质细胞的凝集状态下完成的,体内凝集的真皮间质细胞转化为毛乳头,,从而诱导的形成与再生。在体外培养过程中也具有能形成多层化的细胞团块即凝集生长的特性,是其发育过程中保留下来的一个重要特性,是体外培养过程中形态学上区别于成纤维细胞肋,的重要特征。目前认为其凝集性生长特性是诱导形成的基础,的凝集性生长状态与其细胞分化和功能密切相关【一】。和我科朱堂友博士等【“】在体外进行了诱导研究,但不管用什么方法,至今尚无体外诱导重建成功的报道的体外诱导和构建多以失败告终,究其原因可能在于这些研究仅仅模拟了上皮和间质的接触作用模式,而无法真正提供包括含有细胞因子儿,、细胞外基质,等重要成分的体内环境,也无法提供体内的复杂细胞信号系统,所以没有从根本上提供形成的基本物质条件。因此,有学者针对性的进行了研究,罗洋【】等用低代的条件培养基对高代进行培养,其凝集生长的特性得到部分恢复,说明某些和对的生物学特性有重要影响。随着发育生物学的研究深入,越来越受到广泛的重视。研究在多种生理及病理过程中作用的报道也越来越多【母】,与细胞的分化、肿瘤的转移等都有着密切的关系。同时参与多种器官的形成及功能调节,而作为一种微小器官,其形成也离不开的参与,因此探讨凝集性生长中的影响因素,有必要对等进行深入研究。主要指细胞外间质中的生物大分子。现已发现的成份的种类很多,按其结构主要分为纤维、糖蛋白和蛋白聚糖三大类,其分子结构和组织学分布均有各自的特征。目前发现的蛋白聚糖有多种。其中蛋白是~种分子量很大的硫酸软骨素蛋白聚糖,属于外源凝集素家族。它是由一个蛋白核心和连接在其上的国家自然科学基金资助项目:多能聚糖基冈在毛乳头细胞凝聚生长特性中的作用研究资助号:第三军医大学博士学位论文~个硫酸软骨素侧链所构成的。研究者最初是从人胚肺纤维细胞系及人类胎盘中分离得到的,之后陆续在其它细胞中被相继发现,包括角质形成细胞,,动脉平滑肌细胞等。免疫组织化学,实验揭示了蛋白与血管及结缔组织有密切关系,在真皮中也有较高的表达。此外,很多研究表明在细胞黏附、迁移、增殖和分化过程中都发挥作用【例,在动脉硬化改变中扮演着重要角色,它的表达和或分泌增加与血管硬化的改变有直接的联系。基因位于鼠的号染色体和人的号染色体上【。它是由万个碱基对的连续的脱氧核糖核酸,编码的个外显子组成。基因的表达是由一个位于上的启动子和一些转录因子结合位点所调节的。这些转录因子包括,增强子蛋白及应答元件等【】。研究表明蛋白多能聚糖的表达随周期的变化而发生改变。在毛发生长期多能聚糖在中的表达达到高峰,生长期末降低,在退行期进一步减少,到休止期,多能聚糖则逐渐消失【。从多能聚糖在中的周期性表达,可以推测多能聚糖参与了周期的调节。研究进一步证实【,多能聚糖在培养传代的中很快消,表达多能聚失,不表达多能聚糖的失去了支持再生的能力。有研究表明【糖的前体,经过多次传代后,大部分细胞不表达多能聚糖,这种传代的细胞不能诱导形成,但利用细胞分离技术,分类收集多能聚糖表达阳性细胞,证实这些细胞确有诱导形成的能力。有学者研究发现在雄激素秃发之毳毛样的中基因表达几乎丧失,蛋白水平也明显降低【”】。因此等多能聚糖的表达在形成具有非常重要的作用,并且有一定的剂量依赖性。在胚胎发育过程中有多条信号通路发挥着非常重要的作用。研究表明信号途径在的发育形成过程起非常关键的诱导作用【】,连环蛋白,是基板形成中最基本的信号分子,是,信号传导途径的下游分子,而在发育形成后是决定干细胞,分化方向的重要分子,当缺乏时干细胞不会向毛囊角质形成细胞分化,而是向表皮分化【,当抑制信号活性时,皮肤的基板则不能形成,产生不了胚芽,、牙齿和乳腺的发育均被阻断【】。家族成员中和表达于毛基板细胞,异常的可导致毛发发育畸形【】。是基板表达最早和最显著。的分子,经其处理后的原始表皮细胞显示出向毛干和内根鞘分化的特征【研究表明,转染了部分基因的转基因小鼠,由于主要是第二军医大学博士学何论文内含有基因,绿色荧光蛋白,表达呈强阳性,从而能够用流式细胞仪分离出来,当与混合后,再移植到裸鼠背部的小室中进行皮肤重建时,表现出了诱导形成的能力,并有毛发生长当缺乏上皮的信号作用时,这些细胞在培养数代后均会丧失诱导形成和表达转基因的能力,如果与表达一的细胞共培养后会延长这两种能力而阴性不含基因的真皮细胞不能够诱导形成【,】。此转基因小鼠与转染型卵蛋逆转录病毒的转基因小鼠杂交,产生的双基因转染小鼠,使低水平表达,仍能维持诱导形成和表达的能力,在缺乏信号作用的情况下给予稳定型的也能有效维持其诱导能力,但是在其表达能力丧失后即使再给予和一,均不能恢复的诱导能力,、和的表达水平显著下降而不能检测出来而开始不表达的聚集真皮细胞与一或表达细胞共培养,或使其表达,也能获得诱导形成的能力。说明存在活性,信号通路直接作用于本身,且能有效维持其诱导形成的能力,而基因是。控制诱导形成的必要基因,它的失活直接导致了诱导形成能力的丧失【基因及蛋白、凝集性生长或细胞凝集团分别与诱导形成的能力呈明显正相关关系,那么基因及本身和凝集性生长之间有没有必然联系而信号通路如何影响的表达以及在中信号通路、基因及蛋白、凝集性生长和诱导形成能力之间存在何种联系我们预测基因是控制凝集性生长的关键基因,基因在信号通道的调节下的表达和转录是影响和维持的凝集性生长特性的关键因素。本研究在我科已有研究的基础上,以伍津津教授等成功诱导了凝集性生长的模型【】为研究手段,进一步采用、逆转录聚合酶链反应,、干扰和一诱导等方法,对比研究具有凝集性生长的低代、高代诱导凝集性生长的和高代中和在和蛋白水平表达的差异,并分析它们与凝集性生长的关联度,从而说明凝集性生长和诱导形成能力之间的因果关系,为深入研究基因在诱导毛囊形成中的关键性作用奠定一定的基础。第三军医大学博士学位论文第一部分细胞的培养及毛乳头细胞蛋白的表达作为一种微小器官,研究其发育和生长在发育生物学中具有非常重要的意义,有学者认为可以将其作为器官发育的模型,为研究其他器官提供载体【’。作为的重要组成细胞,其生长特性的改变直接影响的生物学功能,在体外成功分离培养纯化的真皮成分细胞是研究生长、发育的关键步骤。目前认为的凝集性生长特性是其诱导毛囊形成的基础。而体外培养的凝集性生长特性之所以得以维持,与本身具有分泌以及之间相互的信号联系有密切的关系。对的研究报道越来越多,受到广泛的关注和重视,蛋白多糖作为的重要组成部分,其作用非常广泛。作为的重要组成成分,蛋白是一种分子量很大的硫酸软骨素蛋白聚糖,又称多功能蛋白多糖,研究表明在细胞黏附,迁移,增殖和分化过程中都发挥作用【,已有研究表明等多能聚糖的表达随周期的变化而发生改变【。进一步研究在体外培养过程中的改变可以揭示在毛发周期中的作用。本实验应用我科现有的基础,培养、、方法检测不同代次及,并观察各种细胞的生长情况应用和及蛋白表达情况,观察它们与凝集性生长的关联度。为进一步研究基因在诱导形成的作用奠定基础。材料与方法一主要试剂分离酶美国公司胰酶美国公司型胶原酶美国公司培养基美国公司培养基美国公司青霉素针、链霉素针华北制药股份有限公司新生小牛血清天津标准标准胎牛血清天津特级德国公司第二军医人学博十学位论文鼠抗人北京中杉公司北京中杉公司鼠抗人兔抗人北京中杉公司通用型北京中杉公司甲醛重庆北碚化学试剂厂多聚甲醛美国公司二主要液体的配制,,,溶入:三蒸水,调至后以双蒸水定容至“’液:,,,,,酚红,青霉素力,链霉素万,超纯水,用氢氧化钠调至,“孔滤膜过滤除菌,瓶分装,一贮存备用。:购于公司,~贮存,临用前加牛垂体提取物和,调整钙离子浓度为。培养基:,,,新生小牛血清,调值至,青霉素,,链霉素,,超纯水加至“,用微米孔滤膜过滤除菌,瓶分装,贮存备用。缓冲液中,震荡分离酶:电子天平称取分离酶,溶于使其溶解,微米孔滤膜过滤除菌,瓶分装,贮存备用。胰蛋白酶:电子天平称取胰蛋白酶,溶于溶液中,震荡使之溶解,冰箱过夜,次日微米孔滤膜过滤除菌,瓶分装,贮存备用。型胶原酶:型胶原酶,含新生牛血清的,孔滤膜过滤除菌,瓶分装,贮存备用。细胞冻存液:含血清的培养基,加入无菌甘油,瓶分装,贮存备用。、分离胶:超纯水、、几。、过硫酸胺、、,、浓缩胶:超纯水、、。、过硫酸胺三主要仪器第三军医大学博士学位论文二氧化碳孵箱美国公司电热鼓风干燥箱重庆实验设备厂电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂超净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司倒置显微镜及照相系统日本公司万分之一电子天平德国公司低温高速离心机美国公司数显普通离心机安徽中国科大中佳公司孔、孑、孑、孑培养板美国公司微量移液器法国公司水纯化系统美国公司数控超声波清洗器浙江昆山市超声仪器有限公司压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂超低温冰箱日本公司四标本来源所需标本来自健康的整形手术除皱患者的全层正常头皮,经患者知情同意,也可以取自新鲜的尸体头皮,经家属知情同意。健康成人的头皮包含有本实验所需的、、、。标本取下后浸泡于平衡盐液中,冰箱中保存,保存时问最长不超过天。五各细胞的分离培养的分离与培养的分离和原代培养酒精浸泡后,置超净工作台上,用酒精棉球擦拭标本三遍标本移至培养皿中,用平衡盐液反复冲洗标本遍,每个角落均要冲洗到,每遍不少于,直至标本发白在培养皿中用手术剪剪去皮下组织,并将其剪成×大小的皮条将皮条置于培养皿中,加分离酶浸没组织酶与标本之比为:冰箱中消化过夜取出消化后的标本置于另一洁净培养皿中,平衡盐液漂洗两遍用眼科镊轻轻揭下表皮,真皮部分置于另一培养皿中可用于分离培养,揭下的表皮置于培养皿中,加胰蛋白酶~一般表皮与胰蛋白酶体积比为:第三军医大学博士学位论文,在孵箱中消化消化时间满后取出置于另一培养皿中,加含的终止胰蛋白酶消化,用吸管小心反复吹打,尽量使表皮分散目筛网过滤,转离心弃上清,加培养液于其中,制成细胞悬液,接种于瓶底铺满型胶原的培养瓶中,后吸尽未贴壁的细胞,以后每天更换培养液的传代培养待细胞融合约后,按下列步骤传代培养:弃去细胞培养液,洗涤~遍用胰蛋白酶含消化至悬浮状态,迅速加入培养基终止消化多离心弃上清,加入新鲜培养基,轻轻吹打重悬细胞接种于瓶底铺满型胶原的培养瓶中,后吸尽未贴壁的细胞,加入新鲜培养基继续培养。的分离与培养的分离和培养标本处理同的处理过程取己揭下表皮的真皮皮条,置于另一培养皿中,挤出真皮内的毛囊剪碎,用儿型胶原酶消化小时反复用吸管吹打至液体完全浑浊加平衡盐液离心×,遍,沉淀为毛乳头与混合物及一些纤维组织加约,吹打呈细胞混悬液,印离心分钟,由于毛乳头较重,上清即为混悬液用吸管吸至培养瓶培养,台盼兰活细胞计数的传代培养待细胞快速增殖并融合后,按下列步骤传代培养:弃去细胞培养液,用胰蛋白酶含消化至悬浮状态,迅速加入含培养基终止消化第二军医大学博士学位论文离心,弃上清加入,印离心,弃上清:加入新鲜培养基,吹打重悬细胞接种于的一次性培养瓶中,,条件下培养。的分离与培养在上述的分离过程中,首次低速离心后,沉淀中仍含有较多和纤维组织,取沉淀物,按下列步骤分离:的分离×离心,加入培养基重悬×离心,加入培养基重悬按『述两步骤,交叉两种不同速度离心共次,沉淀即为纯度很高的和一些纤维组织接种至孔板中做悬浮培养天后更换培养基,除去其中的纤维组织,培养板中即为纯度很高的的传代培养待细胞融合约后,按下列步骤传代培养:弃去细胞培养液用胰蛋白酶含消化至悬浮状态,迅速加入含的培养基终止消化离心弃上清,加入新鲜培养基,吹打重悬细胞接种于的一次性培养瓶中,,条件下培养。的分离与培养的分离标本处理同上,取已经挤出毛发的真皮成分按下列步骤操作:将真皮层粉剪成糊状,组织大小约为×按组织:酶比例为:,加型胶原酶浸没组织孵箱中消化小时,以将组织基本上消化散开,看不到组织块为度加平衡盐液稀释胶原酶以叩×速度离心,以沈去胶原酶按前述方法洗涤遍第三军医火学博学位论文弃上清,加制成细胞混悬液,接种至培养瓶中的传代培养待细胞融合约后,按下:传代,步骤如下:用胰蛋白酶含消化至悬浮状态,迅速加入含培养基终止消化印离心弃上清,加入新鲜培养基,吹打重悬细胞接种于的一次性培养瓶中,,条件下培养。六细胞生长曲线的绘制传代细胞时,可同时进行活细胞计数:并于开始培养后第、、、、天计数活细胞,换算成活细胞数每平方厘米,绘制细胞生长曲线。采用系统分析细胞体积及增殖情况:取待测细胞,按传代培养的方法获得待测细胞的悬液取测量杯,每杯加入的。吹打均匀后,于离心管中央位置取,滴加于测量杯中。将测量杯置于测量毛细管下。将铂电极浸没其中测量各标本的细胞数量与细胞直径。每标本测量次。采用上述三种方法每隔一天测量活细胞数或者值后,以时间为横坐标,活细胞数或者吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。七不同代次中弘和的蛋白表达变化检测不同代次和的表达情况,该研究中使用方法检测这两种蛋白。按下列步骤进行操作:裂解细胞取第一至七代,分别用预冷洗涤次加入适量的细胞裂解缓冲液,轻摇混匀后转移至管置于冰箱中,裂解,印离心面,取上清加入另一管吸取少量的细胞裂解液,用酶标仪检测总蛋白浓度,混匀取上清,加的×迅速置于沸水中,静置,使之变性第二军医大学博十学位论文快速离心,所得上清即可上样跑电泳蛋白电泳清洗蛋白质电泳仪,安装玻璃板根据所需浓度,配制,倒入玻璃装置中让其流动~的距离,形成需要的胶带同时小心加入少量异丙醇进行消泡并防止胶凝固过程中胶表面干燥等胶凝固后,倒去异丙醇加入上层胶,并插入梳子,等其凝固小心拔出梳子,组装电泳槽,加入电泳缓冲液,用注射器吹打加样孔,使其中的赃物吹出用加样器加样,小心不要使样品冲出加样孔接通电源,先将电压调至,等到样品被压缩到胶后将电压调至~。转膜及在半干转电转仪中用适当电流稳流电转,电转后的膜用含明胶的室温封闭:弃封闭液按:比例,鼠抗人、兔抗人第一抗体工作液于含的溶液中,室温孵育回收一抗,洗涤次,每次按:的比例,稀释第二抗体于含的溶液中,二抗稀释液室温孵育洗次,每次在暗室条件下用工作液孵育醋酸纤维膜暗室显影,定影将定影后的胶片用清水洗涤晾干后,使用图像扫描系统转换成电子格式保存,并使用软件对胶片上的斑点印记进行半定量分析。图像处理:图像处理软件进行光密度分析,在每张图片中随机选取采用个视野,测定每个视野下染色阳性的积分光密度,以每例个视野的积分光密度平均值作为该样本的测量值。具体步骤如下:选项罩打不要处理的图片,在光密度校正:用测试图片的不同空白处的狄度值,选择它们的中间值作为背景值第三军医大学博士学位论文调出泣窗口,选用与缸两个测量项目:对将当前的测量设置文件保存,用于同一批实验中收集割的所有的图片,以减少不同图片问的系统误差选择颜色,取颜色系统,与都选到选到左右对所有的图片进行处理,调整灰度之间的色差,尽量使目标区域的颜色尽可能地区别于背景色测量目标区域的光密度值,并统计目标区域与整张图片的比值。结果一细胞培养的观察个细胞,台盼:消化法培养的,每×大小的头皮可获得约×兰活细胞计数细胞活性可达以上,接种至瓶底铺满鼠尾胶原的培养瓶中×’瓶,小时后即可在显撤镜下观察到细胞贴壁,伸出触角,部分细胞之间出现连接,第三天可见细胞集落间出现细胞连接,类似地图样,一周左右细胞可达融合,基本铺满瓶底在瓶底呈铺路石样。图:图原代×第三军医大学博十学位论文传代后细胞成长加速,按传代,在显微镜下观察~小时细胞贴壁,伸出触角,细胞之间开始有连接,天即可达到~融合。、:经酶消化法分离的,接种至培养瓶中或培养板中细胞平均需要天左右开始贴壁生长原代开始生长的呈长三角形,细胞生长极其缓慢,细胞达到瓶底~后生长有所加速,但是细胞铺满瓶底需要约天左右,铺满瓶底的细胞呈长梭形,排列杂乱,但较整齐。图:圈×传代后生长明显加快,生长迅速,一般传代后~小时内细胞即可贴壁伸展生长,按:传代后,细胞在~小时内义可融合铺满瓶底第四代后细胞出现凝集生长,与剐分离的原代毛乳头外型极为相似,周围有梭形细胞放射状生长。代以后的也可在光学显微镜下观察到与类似的色素颗粒。但是将新分离的与混合行二维培养,可以观察到对有明显的促进作用,在第二天即可贴壁。细胞伸展呈典型的长三角形生长天即可融合。、:采用两步酶消化法分离,从标本处理到获得高纯度约需要小时每×大小的头皮可获得约个,接种至培养板中,小时后在显微镜下观察全部贴壁并有新细胞出周围向周出芽性的放射状生长根据接种的密度不同,般需要到灭方可达融合几近铺满瓶底,传代后细胞生长第三军医人学博士学位论文明显加速,在小时内即可存显微镜下观察到细胞贴蹙,开始伸展生长,原代培养的基本上呈多角形,图。图接种后天的原代×瑚传代后培养,的外观彤态逐渐和基本相同。但低代时的生长呈凝集性,尤以四代以内细胞凝集生长明显,在显微镜下可观察到多个凝集生长的细胞团或细胞分布在一定范围内明显高于其他区域。随着细胞代数的增加,凝集生长特性逐渐减弱,第六代的图具有隐约的凝集性生长细胞团。至七代时凝集性生长特性基本上已经不明显,继续培养发现其排列杂乱无章代以后不再凝集生长图。随着细胞代数的增加,体外培养的内的色素颗粒也逐渐减少低代时光学显微镜下可以见到呈致密黑色圆球形或不规则形的小点,散在分布在的胞浆内,并牢固贴附,凝集生长的尤以四代以内的细胞为主中这种小点在光学显微镜下清晰可见,但是十代以后完全消失。第一军医大学博。学位论文圈第代×兰第代、:消化法分离培养的生长较快,第二天即可见细胞生长,呈长梭形,天内细胞融合呈旋涡状铺满瓶底。以胰蛋白酶:传代后,细胞~天即可再次融台传代。图第三军医大学博士学位论文图第代×二不同细胞生长曲线的绘制传代培养后第、、、、、天采用系统每天计数细胞,绘制细胞生长曲线。图】一:五,匡『第三军医大学博学位论文由图可见传代培养的人表皮细胞于第天时开始快速生长,并于第天左右进入平台期接种第天时即开始快速生长并于第天左右进入平台期真皮鞘细胞和则于接种第无开始快速生长,并于第天进入平台期。细胞数单位为个图代生长曲线由翻可见,低代均培养第天时,进入快速生长期,井于第天时进入平台期:而高代的快速生长期并不明显,井于第天时进入平台期。三锄法检测细胞不同代次肛舭妯和舭的表达变化提取不同代次包括从第代至第代细胞总蛋白用分离后,转印至膜,以兔抗人日出蚰多克降抗体、鼠抗人单克隆抗体进行免疫杂交,并以血作为参照用化学发光法检测目的蛋白的变化情况,如图所示。第三军医大学博士学位论文不同代次毛乳头细胞代肛础‘图不同代次蛐和强血的表达图像处理图像处理软件进行光密度分析,用等高线法圈定各条带的采用范围。并计算各个条带的积分光密度,并用各组相应的内参的强度作为标准化参照,取平均标准化值后其结果如表所示:表并代争髓锄和、诅表达情况第二军医大学博学托论文以统计图表示为图圈各代和、铀表返情况以上结果提示如下几种现象:随着培养代数的增加和蛆的表达均逐渐降低阻甜水平于第五代时降至最低,并达到平台期、订她水平于第六代时降至最低,并达到平台期、研水平降低的速度比叭更快,降低幅度更大。讨论在体外培养时能形成多层化的细胞团块即凝集生长的特性。这是从胚胎发育过程中保留下来的一个重要特征,也是与真皮等最重要的形态学区别。其凝集形成能力与细胞诱导毛发形成的活性相关,聚集成团的细胞或是完整的毛乳头方能诱导形成口”。目前人的分离培养方法有显微解剖法四和酶消化法口”我科朱堂友博士对比研究后认为显微解剖法分离得到的纯度高,但费时费力,工作强度大:而酶消化法效率高、工作强度低,细胞存活率高,细胞纯度也很高,故而酶消化法应用更为广泛。本研究应用我科成熟的细胞培养技术对、、以及等进行分离培养尤其是的分离和纯化,以及凝集性生长的模型建立是本研究的的基础和关键。第二军医人学博十学位论文的分离培养:从年等【】在解剖显微镜下首次分离到老鼠触须的并成功的进行了体外培养传代不始,二十多年来有很多学者对的分离培养进行了不断的改进,但由于的空间位置特殊,分离工作仍然是一个耗时耗力的艰苦工作,并且往往分离的细胞纯度不高。伍津津教授等【机”】改进的分离方法,首先建立二步酶消化法,在保证分离后的分离纯度的前提下,尽可能去除游离杂质和细胞杂质,并且简化了操作大大降低了劳动强度。目前在我科实验室的分离培养已经成为一种熟练的基础实验技能。的生长特性:凝集性生长方式是与等的重要区别。体外培养的,在静止状态下细胞伸展开来,呈多边形和不规则形,生长状态下的细胞则表现为凝集,趋向融合【】。我们在实验中也反复证实了的这种生长特性。研究表明:身体各部位的都具有凝集生长的特性,这和文献报道一致【。这进一步证实:凝集性生长是诱导形成的基础条件,有多位学者研究发现的凝集性生长受上皮成分细胞的信号作用‘吲’】所干预。因此的凝集性生长受到上皮成分细胞间的多种信号调控而二维培养时的凝集性生长特性表现证实:本身也能相互发出信号,相互诱导形成凝集生长状态。凝集性生长特性随培养和传代次数的增加逐渐减弱甚至消失。其诱导再生能力随着传代次数增加而逐渐消失。而等【】比较了第代和永生化的在培养中凝集性生长特性的差异发现低代的和永生化的均凝集性生长特性明显。麦跃等【】研究发现,在凝集性生长状态时,其合成及合成功能明显增强能够合成和分泌酸性和中性粘多糖肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等,虽然不能促进的凝集性生长,但能使高传代逐渐恢复凝集性生长特性而一平滑肌肌动蛋白的表达可能与凝集性生长有一定关系并通过在裸鼠体内移植细胞诱导形成分化较为成熟的结构,并观察到有毛发纤维形成。因此,进一步研究凝集性生长的特性逐渐减弱的分子基础,可以从根本上明确形成及毛发周期中相应的调控因素,为研究及毛发疾病治疗提供必要的基础实验和有效策略。凝集性生长特性与和矗的表达变化关系:研究表明,信号系统参与皮肤及其附属器的发育生长过程【】。而作为信号系统的核心分子,是其经典途径的关键效应蛋白【】。动物研究发现,在毛囊发育过程中,在基板、毛囊胚芽、问质真皮细胞聚集体细胞内均有表达,与人相同【们。因此,在诱导形态发生,维持生长、发育及毛囊干细胞增生。进一分化中起着关键性的作用。的表达是诱导形成的决定性步骤【’第三军医人学博士学位论文步研究表明,在维持周期中具有非常重要的作用,当缺乏时毛囊干细胞不向毛囊上皮细胞分而向分化形成后,条件性删除基因或阻断表达将导致毛发脱落‘’。但当过度表达时,将导致肿瘤形成“。因此,下常的表达在诱导形成发挥重要的调控作用。毛囊上皮和间叶组织之间的信号交换是由蛋白多糖,如来调节的,这些蛋白多糖可以显著增强或者减弱分泌的生长刺激信号的生物学活性。而转染了部分基因的转基因小鼠的表达呈强阳性,并且这种细胞具有诱导毛囊形成的能力,而阴性的细胞不能够诱导毛囊形成。研究表明‘九删在毛囊形态发生、再生和生长中具有重要的诱导作用,在鼠和人类头皮毛囊中,的基因和蛋白表达与毛乳头的生长周期显著相关。本研究中,通过检测不同代次和的表达发现:随着培养代数的增加,体外培养的和的表达均逐渐降低水平于第五代达到平台期水平于第六代时达到平台期水平降低的速度比更快,降低幅度更大,观察发现的下降幅度与的凝集性生长特性改变呈正相关。因此,以上结果表明与的凝集性生长关系更加紧密,在的诱导和形成过程中,所发挥的作用可能更重要,可以初步肯定基因是凝集性生长的效应基因,同时在培养状态下蛋白水平的表达对凝集性生长的影响显著。由此可以发现,细胞在体外培养和传代过程中其生物学性能逐渐发生改变,是由于缺乏相应的细胞信号等导致其相应的基因表达缺失以及其分泌的等改表所导致的。第二军医人学博士学位论文第二部分重组一腺病毒颗粒的构建与扩增基因转染技术已经成功应用于生物学、医学等各个领域。目前对目的基因的转染最常用的是应用腺病毒作为载体,然后应用携带目的基因的病毒颗粒感染细胞,从而将目的基因转入细胞中,通过目的基因在细胞内的表达来研究目的基因片段的具体作用。已有的研究表明信号传导途径对形态发生及生长周期具有重要的调控作用【,。为研究信号传导途径在中对等基因的影响,本实验将线性化的重组穿梭质粒抗性与腺病毒骨架质粒一抗性进行同源重组,构建成重组腺病毒质粒删一。在细胞内予以扩增,并将重组腺病毒颗粒刖一在一细胞内进行包裹,使之成为完整的具有普遍感染能力的重组腺病毒颗粒胱,为下一步实验提供条件。材料与方法一质粒、菌株和细胞携带人基因的重组穿梭质粒侧,为我科李元朝博士惠赠。【和一腺病毒骨架质粒、大肠杆菌、大肠杆菌包装细胞为大坪医院野战外科研究所张一博士惠赠。二主要试剂质粒提取试剂盒大连宝生物公司限制性内切酶大连宝生物公司大连宝生物公司限制性内切酶限制性内切酶大连宝生物公司限制性内切酶大连宝生物公司大连宝生物公司琼脂糖凝胶片段回收试剂盒大连宝生物公司培养基美国公司脂质体转染试剂盒美国公司胰蛋白酶美国公司第二军医大学博十学位论文三主要溶液及配制培养基:在“去离子水中加入,细菌培养用胰化蛋白胨,细菌培养用酵母提取物,,摇动容器直至溶质完全溶解,用约。调节至,加入去离子水至总体积为,高压下蒸汽灭菌固体培养基:每培养基中加入琼脂糖,高压蒸汽灭菌后,冷却至左右,于培养皿中缓慢均匀铺板,封闭后于保存。电泳缓冲液:,,硼酸,定容至,调节至。:,,定容至,调节至,过滤除菌。细胞消化液:临用前将胰蛋白酶与按:配制。:,,,,定容至,高压灭菌。,调至四主要仪器凝胶成像系统美国公司电穿孔仪美国公司台式低温高速离心机德国公司微量加样器德国公司电热鼓风干燥箱重庆实验设备厂万分之一电子天平德国公司压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂超低温冰箱日本公司超净工作台苏州安泰空气技术有限公司电泳仪美国公司水纯化系统美国公司水平电泳槽北京六一仪器厂二氧化碳孵箱美国公司荧光显微镜日本公司五细菌内同源重组产生重组腺病毒删将线性化的重组穿梭质粒一抗性与腺病毒骨架质粒抗性共转染菌,在卡那霉素培养基中使其进行同源重组以构第三军医大学博十学何论文成重组腺病毒质粒删一。具体步骤如下:电转用感受态细菌的制备以冻存的菌于的肚链霉素的培养基中,振摇过夜以加入含链霉素的培养基中,良好通气于振摇~小时至值为将菌液分装至~个的离心管中,冰浴分钟。于、离心分钟以冰预冷的超纯甘油洗涤细胞。、离心分钟重复上述步骤一次倒出管内液体存留约液体将其合并至一管,、离心分钟,吸出上清,残留少量上清使总体积为~肛重悬细菌,以每管“分装,液氮快速冷冻,于一冰箱保存。在菌内进行同源重组进行酶切使线性化,将酶以碱法提取小量一质粒,以切产物用纯化试剂盒纯化,以“水溶解将酶切产物和“质粒加入“的感受态细菌中混匀。并将其转入电转杯中将电转杯放入电转仪中,以、、炉进行电转,立即加入“培养基中,直接以和菌液涂于含卡那霉素的平板,置孵箱内。重组质粒的筛选和鉴定挑取平皿中小及中等大小的菌落于含有‖卡那霉素的中振摇过夜。以快速法提质粒,的琼脂糖凝胶电泳进行初步筛选选择可能的阳性菌株以碱法提质粒,以的凝胶电泳进行鉴定进行酶切检测。酶切体系如下:将进一步选定的质粒以体系成分体积超纯水“××山质粒“总体积“第三军医大学博十学位论文琼脂糖凝胶电泳检查。重组腺病毒质粒一删一在仅细菌内的大量扩增由于大量制备删重组腺病毒质粒在菌中不稳定,容易发生缺失,因此必须在菌株中生产大量高质量的。感受态的制备使用法将构建好的重组腺病毒质粒转入感受念中进行扩增,具体方法如下:从振荡培养过夜的菌液中,取砌菌液加入含未加的培养基中,、振荡培养将细菌转移到冰预冷的的管中,在冰上放置“,使培养物冷却至、离心,回收细菌倒出培养液,在滤纸上将管倒置,以吸尽残留的培养液以用冰预冷的几重悬沉淀,放置于冰浴上于、离心,回收细菌倒出培养液,在滤纸上将管倒置,以吸尽残留的培养液加入冰预冷的的重悬沉淀,加入甘油至终浓度为,用“的管按“管分装,一冻存备用。需马上使用的不加甘油、不分装、不冻存。【感受态重组腺病毒质粒厂导入取刚刚制备好的【感受态细菌移至的管中加入重组腺病毒质粒约扯轻轻摇匀,冰上放置,于水浴中热休克,,然后迅速在冰上冷却培养基,摇匀后于孵育加入的平板上,孵箱培养过夜取适量菌液约涂布于含儿‖待刚刚出现肉眼可见的单菌落时,挑单菌落于的培养基中、振摇过夜。重组腺病毒质粒删的大量抽提与获取取前述大量扩增的的含重组腺病毒质粒的【细菌移至一摇瓶内,添加含“砌的培养基咖。、印条件下振摇过夜培养。取过夜培养的菌液“置于个离心管中,叩离心。弃上清,加入“重悬液重悬细菌沉淀,振荡混匀。加入山细胞裂解液,轻轻翻转数次,室温放置。第三军医人学博士学位论文待溶液变得粘滞、清亮后,加入预冷的结合缓冲液“,轻轻翻转数次,室温放置。待溶液变成云雾、毛絮状后,叩离心。组装吸附柱与收集管,小心地将上清液移入吸附柱,甲离心。弃过滤液,在吸附柱中加入洗液“,叩离心。弃过滤液,在吸附柱中加入洗液“,印离心。重复上一步。弃滤液,印离心“。将吸附柱放入一干净的曲离心管中,加入的,叩离心,保存备用。细胞的培养重组腺病毒质粒一胱一需要在一细胞内进行包裹,才能够成为完整的具有普遍感染能力的重组腺病毒颗粒删一。一细胞进行复苏与传代:将液氮罐中冻存的一管一细胞取出,迅速置于水浴中,轻轻晃动至完全融化在超净台无菌条件下用乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净将细胞转入无菌离心管中,加入含的培养基,叩离心弃去上清,加入含的培养基重悬细胞,轻轻吹打均匀转入培养瓶中,置于、培养条件下的孵箱中培养。在倒置显微镜下观察,待细胞贴壁至~的时候,进行传代培养。弃去细胞培养液,洗涤~遍。用胰蛋白酶含消化至悬浮状态迅速加入含的培养基终止消化。叩离心。弃上清,加入新鲜含的培养基,吹打重悬细胞。重复上一步一次。分装至个培养瓶内,每个培养瓶内再加入培养基。重组腺病毒质粒一侧一的线性化与纯化以重组腺病毒质粒刖转染细胞之前,为便于转染,需要第二军医大学博士学位论文先将重组质粒线性化,我们选用限制性内切酶单酶切质粒一删一以使之线性化,反应体系如下:厂×艳×加至反应条件:水浴中作用。线性化产物准备用于一细胞转染,而转染对质粒纯度要求较高,故在转染之前需要对重组腺病毒颗粒例一线性化产物进行纯化,以排除限制性内切酶和其他杂蛋白的干扰。按凝胶回收试剂盒说明书进行操作,具体步骤如下:取一的酶切反应体系。离心管中加入“液,混匀。液,混匀温浴。加入将混合溶液加入吸附柱内,印离心,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入“液,离心。弃滤液,在吸附柱中加入“液,离心。重复上一步。叩离心,弃去收集管,将吸附柱放入一干净的“离心管中。在滤膜的正中央加入“洗脱缓冲液,离心。一保存纯化产物,待用。重组腺病毒在细胞内的包装将细胞以×细胞接种于培养瓶中,于孵箱中培养至约有~的细胞融合用转染试剂进行细胞转染:按照转染试剂盒说明书,将脂质体和嵋酶切线性化的质粒分别加入到“无血清的培养基中混匀,室温放置分钟后,将稀释的质粒与稀释的脂质体混合,轻轻混匀,第三军医人学博士学位论文室温放置分钟在等待过程中,吸出待转染细胞的培养基,用无血清培养液洗涤细胞一次每孔加入“质粒脂质体混合物,缓慢滴加,轻摇混匀,均匀分布,重置于孵箱内孵育于~后吸出含质粒一脂质体混合物的培养基,加入含的培养基继续培养。重组腺病毒删一在细胞内可以表达绿色荧光蛋白,通过在荧光显微镜下观测细胞内的荧光来观察腺病毒生成情况。转染后,即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。重组腺病毒收集重组腺病毒质粒转染一细胞后第天,用细胞刮子将细胞刮下,盛于管中离心沉淀细胞,细胞重悬于将细胞悬液投入液氮速冻,再将其投入水浴融化,剧烈振荡重复上一步次叩离心,沉淀细胞碎片,上清即为病毒悬液,微孔滤膜过滤除菌,贮存于。重组腺病毒的鉴定使用软件,一基因序列全长摘自数据库。将目的基因全长输入对话框作为模板,随机选取一段基因序列作为反应扩增的对象,选择这一段序列的原则是使引物尽可能少的产生二聚体同时要求尽量避免错配和发卡结构,另外还需注意两条引物的值应当基本相

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