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植物基因组DNA的分离.doc

植物基因组DNA的分离

林子浩
2017-12-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《植物基因组DNA的分离doc》,可适用于综合领域

植物基因组DNA的分离,DNA核酸的分离与提取是分子生物学研究中很主要的基本技术样品质量将直接关系到实验的成败。但是不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。目前国际上已有许多DNA的提取方法有较为通用的(Bendich等Dellaporta等MetterMurray和ThompsonRogers和BendichTaylor和Powell)有专门针对含较高多糖、多酚等次生代谢物植物的(Baker等Webb和knappCouch和FritzGuillemaut和MarechalDrouard)有针对具体物种的如棉花(Callahan和Mchta)、甘薯(Baradarjan和Prakash)、莲属植物(Kanazawa和Tsutsumi)等。一般而言一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准:()所得DNA的纯度应满足下游操作的要求:用于RFLP分析的DNA其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物。()所得DNA应当完整电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型。()所得的DNA应有足够的量。例如要研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况也许就要求从单株植物中提取的DNA可作次分析而在从大量植株中筛选一个单一遗传标记时只需在一个Eppendorf管中微量提取得到的DNA就绰绰有余了。如果是对植物进行大规模筛选还应当满足下面这项要求:操作程序应当快速、简便、价格低廉并尽可能避免使用有毒试剂。有关植物DNA提取步骤的原理本节将从众多的DNA提取方法中结合本实验室的体会选择CTAB法作一简介。CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)是一种去污剂这种方法的原理是:一定浓度的CTAB与核酸结合并通过离心形成CTAB-核酸复合物沉淀而多糖等留在上相中。要使CTAB-核酸复合物的分开则先溶于高盐溶液中再用乙醇沉淀核酸CTAB溶于乙醇中。所得核酸DNA大小为~kb。很少有RNA干扰必要时也可用RNase去除残留RNA。无论是新鲜材料或经脱水处理的材料本方法均适用。抽提缓冲液(×):CTAB(WV)TrisHCl(pH)mmolLEDTAmmolLNaClmolL巯基乙醇CTAB溶液:NaClmolLCTAB沉淀缓冲液:CTABTrisHCl(pH)mmolLEDTAmmolL巯基乙醇CsCl梯度溶液(每梯度):CsClgTE缓冲液(pH)ml溴化乙锭(EB)mgmlTE缓冲液:TrisHCl(pH)mmolLEDTAmmolL异丙醇溶液:向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现然后边搅拌边加入固体CsCl至下层TE相中出现白色沉淀两相混匀待用液氮氯仿异戊醇()异丙醇巯基乙醇研钵和杵子烧杯、烧瓶硬塑离心管(ml,ml,ml,ml)高速及超速离心机水浴紫外分光光度计()取g~g新鲜植物材料先置液氮中速冻半min转至研钵中研磨至细粉末。()将细粉末转至一个ml的离心管中先加入~ml的巯基乙醇再加入等体积的煮沸的抽提缓冲液(×)迅速混匀。()将离心管置水浴中保温可轻轻搅动混合物使离心管内稳定达到然后让混合物降至室温。()加等体积的氯仿异戊醇()轻缓地颠倒混匀室温下g离心min上清转至另一新离心管中。()向离心管中加入体积的CTAB溶液再重复第步一次。()向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液混匀室温下放置至少min。g离心min小心去上清加CsCl梯度溶液在水浴中用枪头轻缓搅溶沉淀。()将梯度溶液上到超速离心管中平衡后封好管在g条件离心过夜。()在紫外灯下转移DNA带至一离心管中加入等体积的异丙醇溶液轻轻混匀后静置分层后弃上层重复抽提几次直至紫红色消失。()加两倍体积的TE缓冲液混匀后加等体积的异丙醇-放置小时条件下g离心min离心后沉淀溶于适量TE缓冲液中。()用紫外分光光度计检测DNA含量。()对于我国地域广大、交通落后的国情直接从野外新鲜的样品中提取DNA是非常困难的因此脱水处理是在提取DNA之前保存植物材料的一种较好方法。目前最常用的是用硅胶快速干燥保存样品并且干燥后的组织很容易研磨成粉而有效地破碎。()DNA沉淀呈棕色且很难用限制性内切酶完全降解。植物材料中特别是老的或是经逆境处理的材料含有大量的酚类化合物这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合使DNA带棕色或褐色并能抑制DNA的酶解反应。为防止这类情况出现可以向提取缓冲液中加入(WV)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP相对分子质量)或抽提缓冲液中的巯基乙醇的浓度可以提高到~。()DNA已降解在的琼脂糖凝胶上不形成清晰的条带而只是弥散一片。如果应灭菌的试剂都灭了菌各种用品都经过彻底的清洗操作按照程序和要点一般不会出现这种问题。如果出了这种问题植物细胞中的内源核酸酶会降解DNA。对于高分子量DNA来说操作过程中应该始终避免剧烈的振动在用枪头(tip)吸取过程中应避免产生气泡绝不能用枪(pipetman)吸上吸下地溶解DNA使用的枪头最好要口径大的或是剪掉枪头尖另外应避免重复地冻融步骤。()DNA浓度、纯度和质量的估测较纯的DNA溶液可通过测定其~nm范围内的紫外吸收光谱来进行定量DNA在nm处有一个明显的吸收峰。根据A值可估测浓度(A=,gmlcm光程)而AA比值则可估测其纯度(纯DNA溶液的AA值应为)若DNA不够纯由于RNA或非核酸类杂质的干扰通过紫外吸收测算的数据可能会有出入。这时可通过琼脂糖凝胶电泳加溴化乙锭染色的方法来定量。在低浓度琼脂糖凝胶()中加入约~ng样品DNA并排依次加入~ng未经酶解的,DNA标准高相对分子质量DNA(Mr>kb)应为一条靠近,DNA的清晰条带。该条带以下的片状模糊时机械或化学降解更为靠近胶底部的模糊条带则是样品DNA中混杂的RNA。比较样品DNA条带与,DNA标准条带的亮度即可对样品DNA进行定量。

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