植物细胞工程在玉米育种的应用

2013~2014学年第一学期 《生物技术在食品中的应用》第三次作业 论文题目：植物细胞工程在玉米育种中的应用 学    院：生物与农业工程学院 专    业：食品科学与工程 班    级：XXXXX 学    号：XXXXX 姓    名：XXXXX 任课教师：XXXXX 植物细胞工程在玉米育种中的应用 生物与农业工程学院  45XXX  XXXX 摘要：植物细胞工程在玉米育种上有两方面的意义,其一是通过细胞和其它外植体的人工培养,迅速获得纯合二倍体,达到缩短育种年限的目的。二是转基因育种的组成部分,为基因转移提供了适宜的受体细胞,为植株再生和正常发育创造了良好的条件。文章综述了花药培养的一般程序,并详述了诱导产生单倍体的两个主要途径以及影响花药培养效率的因素,最后总结了植物细胞工程在玉米育种中的应用存在的问题,还对今后生物技术在玉米育种中的应用提出了展望。 关键词：玉米；植物细胞工程；花药培养；问题与展望 玉米在全世界广泛种植,是世界第三大作物,中国第二大作物。随着人口的增加和经济的发展,玉米的需求量不断上涨。耕地面积的减少,环境变化的加剧使生产上对高产、优质、抗逆性强的玉米新品种的需求日趋迫切。常规的育种技术由于育种周期长、选择效率低等特点很难在短时间内选育出生产所需要的品种。近些年来,随着生物技术的完善和发展,植物细胞工程在玉米育种中的应用越来越广泛。自谷明光等(1975)首次获得玉米花粉植株以来,国内外学者加强了利用组织培养技术对玉米的研究。杭玲等(1991)育成了玉米花培杂交种桂三1号和桂花1号,推广8万多亩。用此技术育成的品种还有花单1号和玉单358等。 1 植物细胞工程 植物的细胞具有在发育上的全能性,即在适宜的条件下,一个植物细胞可形成一个完整的植株。植物细胞工程就是以植物细胞的全能性和体细胞有丝分裂的均等性为理论依据,以植物细胞为单位,按照人们的预先设计,有目的、有计划地对植物细胞进行加工、改造,使其遗传和生物学特性发生改变,从而对植物体进行创造设计的技术。通过植物细胞工程可以改良和创造新的生物种质[1]。 玉米细胞工程主要包括:单倍体培养,包括花粉培养(孤雄生殖)和子房培养(孤雌生殖)等;细胞变异体培养,用于耐盐、耐旱、耐铝和抗病等细胞变异株的诱导和筛选;其它外植体培养,如幼胚、幼叶、成熟胚和幼穗等的培养[2]。 单倍体培养就是单倍体育种,即通过单倍体培养迅速获得纯合二倍体,达到缩短育种年限的目的。花培育种是国际上20世纪60年代发展起来的新技术,我国已培育成20多种植物,其中小麦、玉米、高粱和辣椒等作物为我国首先培育成功。花药培养获得单倍体是一项新兴的生物技术,目前在玉米育种中广泛应用。 2 花药培养的一般程序 加快自交系的选育和纯化历来是玉米育种工作的主要内容和基础。采用单倍体育种技术选育自交系,可使材料的纯合从常规育种的5~7a缩短到1~2a,大大地提高了育种效率。组织或细胞的离体培养和体内发生是诱导产生单倍体的两个主要途径。 2.1 细胞、组织培养等方法诱导玉米单倍体 从20世纪70年代中期至80年代,人们陆续开始了玉米花药培养方面的研究,并取得了一定的成果。广西玉米研究所杭玲等育成了国内外第一个玉米花培杂交种桂三1号,于1992年通过广西壮族自治区品种审定。山东农业大学育成的花培玉米杂交组合B218×多27,综合性状良好,抗病抗倒伏。李冬郁等[3]报道了以玉米为材料进行了化学药物诱导孤雌生殖的试验,成功地获得了自交系并组配了杂交组合。 尽管如此,大量的研究表明,不同材料间诱导率存在很大的差异,诱导成功与否还受到诱导时间、培养体系等多个因素的影响。王子霞等[4]研究了新玉9号等10个玉米材料在5种培养基中的诱导情况,其中的4个材料共接种了16 900枚花药,但未出现一块愈伤。由于诱导材料基因型的差异及对培养基的选择性,现在还没有形成统一的培养体系供玉米育种应用。Armstrong和Green［5］的研究结果显示添加了L-脯氨酸的N6培养基可诱导A188愈伤组织的胚胎发生,而添加D-脯氨酸则无这种作用但不同基因型的组织材料其诱导培养 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 的培养基不同,没有一种培养基能适合所有基因型材料,故在诱导不同基因型玉米时,应在培养基中添加不同的激素,以提高诱导率。 2.2 采用孤雌生殖诱导玉米单倍体 拥有遗传标记显著、花粉量大、抗病性好的诱导系是开展孤雌生殖诱导玉米单倍体的先决条件,国内外许多学者都在进行这方面的研究。德国科学家F K Rober等[6]利用俄罗斯诱导系KEMS和法国诱导系WS14杂交后代F5分离出新的高频诱导系RWS,平均诱导率达到8.1%。刘志增等[7]从单倍体诱导系Stock6与高油玉米群体BHO的杂交后代中经过不断的测交和选择,育成了我国第一个孤雌生殖的单倍体诱导系——农大高诱1号。其平均单倍体诱导率为5.34%,以黄绿苗自交系Syn 695yg为测验种,高诱1号的诱导率达5.8%,较Stock6高出5倍,同时其籽粒标记选择更明显,花粉量达,繁殖容易。农大高诱1号的育成缩小了我国在该领域与先进国家的差距。 2.3 影响花药培养效率的因素[8] 2.3.1 供体植物基因型的选择 研究发现,供体植物的基因型对花药培养效率的影响是非常显著的。遗传分析表明,只有很少的基因参与单雄发育,而且胚状体的形成和随后的植株再生没有关联性,是由不同的基因决定的。单雄发育反应的加性遗传方差大于非加性遗传方差,即为数量遗传性状。遗传成分参与单雄发育反应的事实,暗示了由花药或小孢子培养再生的植株至少含有一些有利基因。因此,花药和小孢子培养就可用来选择有利基因的积累。 2.3.2 温度胁迫处理 接种前的冷处理有利于提高花药培养效率,但确切的机制尚不清楚。可能与一种特定的蛋白质有关。根据基因型的不同,供体植物生长状况的不同,以及离体培养的温度不同,最适的预处理也不相同。典型的玉米花药预处理一般为4~14 ℃处理7~14天。接种后的温度胁迫也对花培效率有作用。无论是冷处理还是热处理,都能使胚状体和再生植株的数量大大增加。 2.3.3 诱导培养基及其成分的选择 用来诱导孢子体的小孢子发育以及随后的胚状体发生的培养基称为诱导培养基。玉米常用的培养基有N6、玉培、正14等。 (1)培养基中的糖分:蔗糖的效果最好(Butter,1997)。正常为蔗糖浓度6%~15%。 (2)培养基中的激素种类及比例:激素对诱发细胞的分裂、生长和分化起着决定性作用。Hongchang等(1991)研究发现,当玉培培养基中加入2 mg/L 2,4-D和1.5 mg/L Kinetin时,诱导频率最高。 (3)有机附加物:如氨基酸、酪蛋白、乳清蛋白等。其中酪蛋白水解物(CH)对胚状体的形成有显著的促进作用。另外,在培养基中加入脯氨酸(500~800mg/L)能够促进愈伤组织的增殖和幼苗的健壮(Ku等,1981)。 (4)活性炭:有促进花药中花粉愈伤组织和胚状体形成的作用。0.5%的活性炭使玉米花药中愈伤组织或胚状体的诱导频率提高一倍左右,在分化培养基中加入0.5%的活性炭,还能促使分化的幼苗健壮,根系发达(颜昌敬,1990)。 (5)琼脂:琼脂(0.7%~0.8%)在诱导培养基中常被用做凝胶剂,琼脂糖(0.6%~0.7%)效果也很好。Butter等(1997)通过比较不同的凝胶剂,发现脱乙酰基吉兰糖胶(0.1%~0.2%)凝固的培养基与琼脂凝固的培养基相比,胚状体的生成量多一倍。 2.3.4 植株的再生 要得到再生植株,可直接将胚状体转移到再生培养基,也可以先诱导愈伤组织,然后再转到再生培养基。玉米的再生培养基多以N6或玉培为基础。再生培养基与诱导培养基的主要区别是,蔗糖浓度的减少(2%~4%)和添加细胞分裂素,如Kinetin(1~2.5mg/L)或BA(0.5~1.0 mg/L),来促进芽的诱导。与诱导愈伤组织不同,植株再生时需要将胚状体暴露于光照下,一般胚状体或愈伤组织需在白色荧光灯下(16h光周期),26~28℃培养。也有研究提出,增加红色荧光有助于植株再生(Nitsch等,1982)。通常根在再生培养基中或移到无激素的培养基中后产生。如果培养基中加入多效唑(MH)1~2mg/L,会促进根的发育和生长。当再生植株产生出发育良好的根系时,就可移出试管。在一般的程序中,当胚状体直径达到1~2mm时,转入再生培养基以诱导芽和植株的形成。早期转移,在接种21天后将花药转移到再生培养基上,尽管平均成胚花药数目略有降低,但平均再生植株数增加了10倍(Barloy,1993)。 3 问题与展望[9] 植物细胞工程在玉米育种中的应用已展示出广阔的前景,但仍存在一些不足。首先是科研人员对玉米细胞工程技术相关研究仍处在起步阶段,转化率较低,转化体系还不是特别稳定,同时玉米的基因型限制还仍然是一个难题。其次玉米细胞无性系变异及突变体筛选程度不够,玉米不同品种高效再生体系还需研究。在今后的玉米育种研究中,应针对不同的品种和外植体来源,建立和完善更加简便有效的高效再生体系,为优异种质资源的保存、快速效殖以及基因工程操作和突变体的筛选提供技术保障。 随着转基因技术的日益成熟，植物细胞工程技术与之相结合的技术将在玉米育种中发挥越来越重要的作用,届时玉米育种将进入一个新的发展阶段。细胞工程会在改良玉米抗性、抗虫、抗涝、抗旱、抗除草剂等方面发挥更大的作用,改变目前我国玉米种质遗传基础狭窄难题;结合转基因技术实现转基因育种,培育出高抗、优质、高产新品种。    参考文献： [1] 周维燕.植物细胞工程原理与技术[M].北京:中国农业大学出版社,2001:62－63. [2] 卢峰,吕香玲等.生物技术在玉米育种中的应用[J].杂粮作物,2006, 26(2):68－70. [3] 李冬郁,杨宪民,滕少花.利用孤雌生殖技术选育玉米自交系和杂交种初报[J].玉米科学,2005,13(增刊):23－25. [4] 王子霞,杨克锐,海热古力等.玉米花药培养的初步研究[J].新疆农业科学,2001,38( 6):346－347. [5] ARMSTRONG C L,GREEN C E,PHILLIPS R L.Development and availability of germplasm with high type II culture formation  response[J].Maize Genet Coop News Lett(MNL),1985,59:92－93.