原核表达操作步骤及注意事项 - 资料中心 - 生物在线

原核 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达操作步骤及注意事项 - 资料中心 - 生物在线 原核表达 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点,易于生长和控制,用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵,有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件, ,1,选择标志的编码序列, ,2,可控转录的启动子, ,3,转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点), ,4,一个多限制酶切位点接头, ,5,宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下, 获得目的基因,准备表达载体,将目的基因插入表达载体中,测序验证,,转化表达宿主菌,诱导靶蛋白的表达,表达蛋白的分析,扩增、纯化、进一步检测。 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,,2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20?保存。 二、操作步骤 ,一,获得目的基因 1、通过PCR方法,以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物,在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点,,PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法,用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 ,二,构建重组表达载体 1、载体酶切,将表达质粒用限制性内切酶,同引物的酶切位点,进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 ,三,获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志,抗Amp或蓝白斑,作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 ,四,诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB,含Amp50μg/ml,中37?过夜培养。 2、按1?50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37?震荡培养至OD600?0.4-1.0,最好0.6,大约需3hr,。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37?震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀,70?10min。 5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 三 、注意事项 1、选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达,如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。 2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 原核表达的原理与实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 一、原核表达的原理 1、 E . coli 表达系统 E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后,通过温度的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。 2、 外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,IPTG,诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同,因启动子不同,诱导表达要根据具体情况而定。 二、原核表达的材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB ,Luria-Bertani,)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围,大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液, 2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ? 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液, 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS ,电泳级, 0.1 % 溴酚蓝 10 % 甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ,酶溶法 ,1,裂解缓冲液, 50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI ,2,50 mmol / L 苯甲基磺酰氟,PMSF ,。 ,3,10 mg / mL 溶菌酶。 ,4,脱氧胆酸。 ,5,1 mg / mL DNase I。 2 ,超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 ( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液, 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2%溴酚蓝 20%甘油 三、实验方案 1、外源基因的诱导表达 ( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。 ( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。 ( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,确定无误后进行下一步。 ( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30-32 ? 培养数小时,使培养液的OD达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ? 继续培养3-5h ,如果表达600 载体的原核启动子为tac 等,则37 ?培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3-5h 。 ( 5 )取上述培养液1 mL,1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化 1 ,细菌的裂解 常用方法有,? 高温珠磨法,? 高压匀浆,? 超声破碎法,? 酶溶法,? 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法? 、? 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。 ,1,酶溶法 常用的溶解酶有溶菌酶、β-1,3 -葡聚糖酶、β-1,6 -葡聚糖酶、蛋白酶、壳多糖酶、糖苷酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为, ? 4 ? ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液,100 mL ,。弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。 ? 每克菌加8μLPMSF及80μL 溶菌酶,搅拌20 min ,边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸,在冷室中进行,。 ? 37 ? ,玻棒搅拌,溶液变得粘稠时每克菌加20μL DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。 ,2 ,超声破碎法 声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎,在处理少量样品时操作简便,液体量损失较少,同时还可对染色体DNA 进行剪切,大大降低液体的粘稠度。 ? 收集1 L 诱导表达的工程菌,40 ? ,5000r pm 离心,15 min ,弃上清,约每克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ? 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌,10 000g 离心,15min ,分别收集上清液和沉淀。 ? 分别取少量上清和沉淀,加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液,进行SDS -PAGE 。 注意事项,超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关, 应根据具体情况掌握,超声波破菌前,标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。 2 ,包涵体的分离 蛋白质在细菌中的高水平表达,常形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒,即为包涵体,经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤,若为获取可溶性的活性蛋白,须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。 ,1,试剂与配制 ? 洗涤液I, 0.5 % Triton X -100 10 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 ) 溶于细胞裂解液中。 ? 2×凝胶电泳加样缓冲液。 ,2,细胞裂解混合物12 000g 离心,15 min , 4 ? ,弃上清,沉淀用9× 洗涤液l 悬浮,室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min , 4 ? ,吸出上清,用100 μL 水重新悬浮沉淀,分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀,加10 μL 2× 凝胶 电泳加样缓冲液,进行SDS-PAGE 。 3 ,包涵体的溶解和复性 ,1,试剂与配制 ? 缓冲液I, 1 mmol / L PMSF 8mol /L 尿素 10 mmol / L DTT 溶于前述裂解缓冲液中。 ? 缓冲液?, 50 mmol / L KHPO24 1 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 ) 50 mmol / L NaCI 2 mmol / L 还原型谷胱甘肽 1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽 ? KOH 和HCI ? 2×凝胶电泳加样缓冲液。 ,2,用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体,室温放置lh ,加9×缓冲液?,室温放置30 min ,用KOH 调pH 到10.7 ,用HCI 调至pH 8 . 0 ,在室温放置至少30 min ,1000g 离心,15 min ,室温,吸出上清液并保留,用100 μL 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀,取10 μL 上清,加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液,与20 μL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。 四、注意事项 ,1,不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。 ,2,表达和检测时,应设置对照组,如转化载体和非诱导细胞。 ,3,由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工,所以,其生物活性无法与天然蛋白质相提并论 如何做原核表达(prokaryotic expression) 首先来一些大肠杆菌表达的基本概念,一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株,如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂,如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑,比如表达量高低,目标蛋白的活性,表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。 人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的,1828年,德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展,人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷,需时较短,表达量大,适合工业化生产等优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题,当有了其它多种表达系统后,原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。 在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级,初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手,觉得十分有意思。但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我,做表达,那是谋事在人,成事在天。有时候你把克隆做出来了,双酶切鉴定没问题,测序没问题,可是就是看不到表达带。原因当然可以分析,实验也是可以改进,但是窜改一下戈尔泰的话,“成功的实验都是一样的,失败的实验各有各的不幸。”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析,找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多,市面上可供选择的载体、菌株也很多,要如何进行正确的选择,找到 适合自己的载体是十分重要的。所以,现在要对目前常用的一些载体进行介绍,让我们对其相关产品及其表达原理进行了解,以方便实验设计。 首先来一些大肠杆菌表达的基本概念,一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株,如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂,如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑,比如表达量高低,目标蛋白的活性,表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。 表达载体,我们关心的质粒上的元件包括启动子,多克隆位点,终止密码,融合Tag,如果有的话,,复制子,筛选标记/ 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因等。通常,载体很贵,我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心,辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景,MCS是否还是原来那个MCS,是我们要特别注意的。 复制子,通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制,拷贝数低,pCoE1,pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上,是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关,当然也不是越多越好,超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化,就要考虑复制元是否相容的问题。 筛选标记和报告基因,氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记,卡那霉素或者是新霉素次之,通常是另一个载体的筛选标记用。四环素,红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰,比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该 就是LB倒板前加抗生素的温度,温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥,不知道是否有我们实验人员的功劳呢,大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢,从以前的一针50万单位到现在100多万个单位,青霉素剂量似乎越来越大了。 对于做表达来说,如果不是要研究启动子的强弱,通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了,注意选择适用原核表达版本的GFP,,其他还有半乳糖苷酶啊,荧光素酶啊等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。 启动子、终止子和核糖体结合位点 启动子,启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的启动子。 组成型表达,表达载体的启动子为组成型启动子,也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子,如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高,成本低,但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长,反过来影响表达量的积累。 诱导调控型表达,表达载体采用诱导型启动子,只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响,又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的,但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的,也属于诱导表达系统。 融合表达,表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签,Tag,,表达产物为 融合蛋白,有分N端或者C端融合表达,,方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag,如GST,以获得稳定表达,而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。 分泌表达,在起始密码和目的基因之间加入信号肽,可以引导目的蛋白穿越细胞膜,避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长,或者形成包含体,而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。 可溶性表达,大肠杆菌表达效率很高,特别是强启动子,目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒,包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物,也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性,比如Thio,pMAL系统。 转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性,避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读,降低本底。转录终止子有两类,Rho因子作用下使转录终止 mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。 核糖体结合位点,启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列,其中能与rRNA16S亚基3'端互补的 SD序列对形成翻译起始复合物是必需的,多数载体启动子下游都有SD序列,也有些载体没有,适合自带SD序列的基因表达,要留意。 表达菌株,我们往往最容易忽视的一点。不同的表达载体对应有不同的表达菌株,一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题,这一点生物通会有专门的 介绍。同样的,交换获得的免费菌株,要小心其遗传背景是否已经发生改变,当心。 yhbdxs:实验思路是这样的,将目的基因连接到含有GFP的表达载体上,得到GFP和目的基因的融合蛋白,再纯化。 我现在还没有选定用哪个载体,请你们帮帮我,太多不清楚的地方了。 E.coli:通常在进行原核表达实验时,选择使用pET系列载体居多。但是pET系列载体不带有GFP基因,其上的His Tag标签是专门用于分离纯化的。通常情况下,目的基因与GFP蛋白融合,用于真核表达的实验较多。 yhbdxs:谢谢E.coli的回答,我爱E.coli，，希望给我带来好运气， 由于时间紧迫,真核表达周期长,只能选择原核表达了。 1、用clontech的pGFP载体可以做原核表达吗, 2、先把目标基因连接到GFP载体上,切下来,连接到pET载体上,可以吗, 3、为什么pET系列载体不带有GFP基因啊, E.coli:clontech的pGFP载体是原核表达载体,应该符合你的实验要求,但是我没有使用过,因此对其具体操作注意不是很了解。如果你一定要求使用pET载体表达带有GFP报告基因的目的基因,在进行载体构建时,加入GFP报告 基因与目的基因融合应该是可行的。不过这样构建起来也是挺麻烦的,不如使用商品化载体方便些。 yhbdxs:在进行载体构建时,加入GFP报告基因与目的基因融合应该是可行的。 如果这样的话,是不是要用到一个辅助载体啊,就是说我一共要用三个载体, 目的基因先克隆到T载体送去测序,然后亚克隆到含有GFP的载体融合,最后再把融合基因连接到pET载体上,进行表达,是这样的思路吗, 我很急,一直在这里等着看结果呢,谢谢E.coli E.coli:我认为在进行载体构建时,需要根据你的实验要求选择实验步骤, 1.如果在进行目的基因与GFP基因融合时,中间有酶切位点可以满足你的实验要求,可以, 1).将目的基因扩增后克隆至中间载体上测序。,目的基因去除终止密码子, 2).将1).测序好的片段通过酶切位点克隆至pET载体上。 3).如果你现有的GFP基因两侧的酶切位点满足已克隆目的基因的pET载体MCS的要求,可以直接将GFP基因克隆至2).构建好的载体上。 但是这样在目的基因与GFP基因间会存在有酶切位点,至少一个。并且在进行GFP基因克隆时,需要严格考查读码框的准确性,不可以移码。 2.如果在进行目的基因与GFP基因融合时,中间必须紧密相连,不允许有其它碱基,可以, 1).将目的基因扩增后克隆至中间载体上测序。,目的基因去除终止密码子, 2).克隆GFP基因,T载体即可。 3).使用1)./2).质粒为模板,设计引物搭链扩增目的基因与GFP基因,两侧加入与pET MCS相匹配的酶切位点。并克隆至T载体,测序。 4).将3).测序好的片段通过酶切位点克隆至pET载体上。 3.如果在进行目的基因与GFP基因融合表达后,你需要进一步将GFP融合蛋白切除,那么依据2.所示步骤,在进行第3).步搭链扩增时,还需要在搭链引物上设计蛋白酶识别位点,其余相同。以便在进行蛋白表达后,可以使用蛋白酶将GFP融合蛋白切除。 具体的蛋白酶识别位点设计情况,你可以参照pET Vector manual. 乱七八糟的,希望可以对你的实验有所帮助。 yhbdxs:今天下午和老板商量了一下,最终决定用clontech的pGFP载体,虽然还没有把握,现在我只能祈求自己好运气了， wangjiali:你好,为什么不直接连在载体上酶切测序,还要连接在中间载体上测序, E.coli:目的基因在进行扩增时,有可能会产生突变。将目的基因克隆至中间载体后,如果测序发现有突变,进行突变修复时比较容易操作。而且PCR产物进行TA克隆的难度远比酶切后克隆至表达载体的难度要小,阳性克隆率高,也比较有利于实验。 注,以上各种特性是可以相互组合的,不是排他的， 几个常用的启动子和诱导调控表达系统 最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子,由 启动子Plac + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录,该启动子在转录水平上只受lacI 的调控,因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白,能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和 lacI产物结合,使其构象改变离开lacO,从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子,且转录水平更高,比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子,同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中,lacI阻遏蛋白表达量不高,仅能满足细胞自身的lac操纵子,无法应付多拷贝的质粒的需求,导致非诱导条件下较高的本底表达,为了让表达系统严谨调控产物表达,能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为 Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因,以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG广泛用于诱导表达 系统,但是IPTG有一定毒性,有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适,因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体,30度下抑制转录,42度开发。热诱导不用添加外来的诱导物,成本低,但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果,而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活,一些蛋白酶会影响产物稳定。 以 λ噬菌体再起转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录,42度下解除抑制开发转录。同样的,PL、PR 表达载体需要携带cI857(ts)菌株作为表达载体,现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因,所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统,就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上,通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子,抑制cI 基因的表达,从而解除强大的PL启动子的抑制。 T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流,这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选,尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶,而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时,宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白,诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶,需要将外源的T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌,因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下,可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录,从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响,通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量,就可以控制产物表达量,某些情况下可以提高产物的可溶性部分。 有何高招,且看我为你一一道来, 有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成,从而调控T7表达系统。 1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株,含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株,构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中,诱导调控方式和lac一样都是 IPTG诱导。 2.另一种策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因,即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7RNA 聚合酶的衍生株,在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。 此了噬菌体之外,还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA聚合酶合成,据说这比较适合工业化发酵的条件控制。 由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达,控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖,有助于控制本底表达水平。二是采用带有T7lac启动子的载体 ——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI),lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达,也作用于载体T7 lac 启动子,以阻断任何T7RNA 聚合酶导致的目的基因转录。pLacI工转化也是同样的原理。如果这还不够,更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA聚合酶的基因——T7融菌酶,降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE,相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化,前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多,对细胞生长影响小,而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平,容易出现过度调节,增加蛋白表达的滞后时间,从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成,T7启动子发展出了史上功能最强大,最丰富的表达系统。 如何做好酶切, 该问题看似什么简单, DNA中加上酶,然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中,我们不断听到,切不动,装不上。问题在什么地方,能系列生产限制性内切酶的公司国际上,就那么几个,位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题,但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮 助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂,会使酶变性或产生星号货性,,不能含有干扰酶活性的污染物质,不能含有高浓度的 EDTA (TE中的EDTA浓度较低,对Mg的浓度影响较小),同时要对DNA甲 基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用,特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中,只是在需要用酶才从 冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分,移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。 注意,酶通常是最后加。 4) 反应体积需要根据实验目的定,常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定 10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题,浓度过高,溶液黏度过大,酶不能有效扩散,酶切效果不会 好。浓度过低,也会影响酶活性。 6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的 确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,short spin 一下就 可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度,但是 Sma I 的最适合温度是25度,37度时酶仍表现出活性,但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应,如Taq I的最适温度为65度,37度保温,效率仅为前者的 1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应,或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%,也就是说10ul的体系,酶的用量不要超过 1ul。 10) 是否和如何终止反应,酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段,加入高浓度的EDTA,65度或80度热处理20-30分钟,部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高,热处理灭活不一定完全,需要用苯酚/氯 仿/乙醇方法纯化,电泳回收也是实验室常用除酶的手段。 2,如果遇到酶切不动或切不完全,该怎么办, 要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定,我们多次接到这样的问题,1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那 么长时间也不能切开或切完全,从下面几个因素去考虑, 1) 酶是否有活性,酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板,也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的,虽然识别位点相同,但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式,通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感,还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降,这种情况是很少发生。我们公司销售的SibEnzyme公司的酶,在分装前严格检验过,不合格的东西,很少,都退回原厂,所以不合格的产品是不会送 到用户手头的。 2) 模板性质是否清楚,如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质,线状,超螺旋状,、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的),同时需要提高酶的用量,10U/ug,和延长反应时间等措施。还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的, 背景不清楚也造成困惑。 3) 模板纯度是否够,模板制备方式影响DNA的质量,制备过程中使用到乙醇,氯仿,苯酚,SDS, EDTA等如果残留在最终的DNA模板中,都会不同 程度影响酶的活性。Miniprep时如果用试剂盒抽提,需要的问题污染是变性剂和乙醇,如果是手工制备的,氯仿,乙醇,苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。 4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响,细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式,在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况,或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。 5) 反应条件是否合适,对照说明书,检查使用的温度是否正确,是否需要添加BSA, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温,这是很不 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 的行为。 6) 酶稀释和添加方式是否正确,一般要求在最后加酶,但是对同时做多个相同反应的时候,最后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物,然后分装,最后加模板。需要提醒的是混合物,Master Mix,中由于没有底物的存在,离子强度也不对,酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题,只是动作要快一些,没有分装前的Mix,要求放在冰里,尽快使用。 3,如何设定PCR引物的保护碱基, 如果您想直接对PCR产物酶切,同时想获得理想的酶切效果,一般情况下需要在酶切位点序列5’端方向增加额外的保护碱基。保护碱基的数目随酶的种类不同而不同,根据文献资料汇总,一般保护碱基有3-4个就可以了。不提倡提供过多的保护碱基,因为太多的额外碱基会增加PCR扩增的难度,同时增加合成费用。 4,如何对PCR扩增的产物进行酶切, Fermentas公司的研究表明,限制性内切酶在 PCR扩增体系中仍然有部分活性,可以通过稀释,3倍以上,扩增混合液,适当提高酶量和反映时间,进行酶切。我个人认为需要对PCR产物进行酶切分析通常是为了或基因表型分析,由于Taq,Pfu等高温聚合酶在酶切温度,37度或更高,下,仍然保持一定的活性,高温聚合酶所具有的聚合或无模板添A或外切修正的功能仍在一定的程度上表现出来,可能会影响到酶切产物末端的正确性。结果是要么装不上去,要么装上去切不下来,测序发现末端引物碱基少了。正确安全的做法是先通过琼脂糖电泳回收产物,然后酶切,酶切可以适当提高酶的用量。一般的做法是从50ulPCR反应中回收的产物,溶解于45ul水中,加入酶,酶切后的产物通过从溶液中回收DNA的方式直接回收,不需要跑琼脂糖电泳。