d-hanks胰酶溶液配置
r:bioer Hits: Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配
胰制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。 蛋白酶溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶
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面，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1:125或1:250。
胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37?)、作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37?时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。
细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。
材料:3000 mL锥形瓶，25 mL、50 mL试剂瓶，500 mL输液瓶，螺口盖，翻帽塞，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。
药品:NaCl，Na2HPO4，KH2PO4，KCl，酚红，NaHCO3，胰蛋白酶干粉，
-葡萄糖，MgCh?6H20，MgSO4?7H2O，酚红(0.1%)(配0.02%EDTA，CaCl2，D
法:称酚红2 g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHCO3溶液使最终体积为100 mL。瓶装保存，备用)。
仪器: 抽滤泵1套，过滤器1套，高压灭菌锅，量筒，磁力搅拌器，研磨器。
(一)配制D-Hanks液
1(按下表称取D-Hanks试剂。
2(依次加入上述试剂至800 mL无菌水中，磁力搅拌下溶解，加2%酚红1ml(如果是储存以后用，则先不加)，定容至1000 mL。
3(高压灭菌，10磅10 min。
NaCl 8.00g
KCl 0.40g
Na2HPO4•12H2O 0.12g
或者Na2HPO4•7H2O 0.09g
或者Na2HPO4•H2O 0.06g
或者Na2HPO4 0.048g
KH2PO4 0.06g
无水葡萄糖 1.00g
双蒸水 1000ml
(二)配制Hanks液
详见Hanks液、PBS的配制
(三)配制胰蛋白酶消化液
1(D-Hanks液高压灭菌之后，晾至室温，4?保存备用。
2(称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，调制成糊状。再放入4?预冷的适量D-Hanks液中，4?下磁力搅拌使完全溶解。
3(用NaHCO3干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的最适pH值)，并加入0.02%EDTA以协助消化作用。
4(滤过除菌，-20?冻存。
注意事项:
1(BSS的pH值应确定为7.2左右。
2(如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100 mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。
3(胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4?左右。
4(胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。
5(胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。
补充:EDTA-胰蛋白酶的配制
1、胰酶是0.25%，这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS，注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。
2、EDTA的工作液溶度是0.02%-0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调
DTA对细胞贴壁性整。EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。E
有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。
3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。 4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。
5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。 6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。
7、可配2-3×的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。
8、储存液放在-20度冰箱冻存，使用液放在4度，用的时候不要放在27度水浴锅温浴，因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会，因为加的量很少，所以一般不会冻坏细胞。
9、消化时，向培养瓶中加入适量胰酶，个人经验，一般10cm培养皿加
入0.5ml足已，加入后，立刻摇晃培养皿，使胰酶铺满，一旦铺满，立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶，再放入37度培养箱消化。 10、注意，过量的胰酶对细胞是有害的，而EDTA过多也会影响贴壁，所以没必要把细胞泡在胰酶里面消化。
11、胰酶37消化效果最好，低于37度也有消化能力，有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。注意，不可消化过久。
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