[原创]蔗糖合成酶的测定方法

[原创]蔗糖合成酶的测定方法 蔗糖合成酶的测定方法 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂 HEPES-NaOH(50mmol/L，pH7.5)缓冲液，包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;2 0.2%(W/V)BSA;2%PVP; 0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。 2、酶活性测定 依次加入 50μL粗酶液， 50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5， 20μL 50 mmol/LMgCI， 2 20μL 100mmol/L UDPG， 20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖)， 30?中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80?水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作: 取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。 4、计算 ,1,1样品中酶活性(μg?g?h)= 式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg); V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1 V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2 淀粉酶活性的测定 1方法 1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制; 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol?L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯试剂。 1.2测定方法 1.2.1酶液的提取 将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL -1预冷的0.1mol/L柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再分别用1mL的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲(pH 5.6)冲洗2次,于4?下以15000×g离心15min，上清液转移入另一个5mL离心管中，作为酶提取液备用。 1.2.2酶活性的测定 取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。总反应体积为0.5mL，测定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液;对照管含0.2 mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)将试管放入恒温40?的水浴锅中，保温30min后取出，立即加入1.5mL的DNS试剂终止反应再将试管置于沸水浴中10min，取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍，测定波长520nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。 周蓓云.α-和β-淀粉酶活性的测定.见:中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南.北京:科学出版社，1999.123~124 酸性转化酶活性的测定 1.酶的制备和活性测定 酶的制备参照Miron&schaffer(199l)以及王永章等(2。02)的方法，稍做修改。提取缓冲液为:150mmol/lTris一Hcl(pH8.0)，10mmol/lMgC1，10mmol/l抗坏血酸，2mmol/LEDTA2 一Na，lmmol/LBenzadine(苯甲脒)，0.1mmol/LPMSF和0.2%(v/v)ß一疏基乙醇，视发育阶段不同加入3%(w/，)PvPP。称取一定量的果肉，加入2-3倍体积冷的提取缓冲液，于高速匀浆器中快速破碎组织至匀浆，16000*g离心20min，上清液对稀释10倍的提取缓冲液(不含PvPP)透析20h，其间更换透析液3次。经透析的上清液用于可溶性酸性转化酶活性和数量的测定。离 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 到的沉淀物用一定体积的提取缓冲液(不含PVPP)洗涤3遍，离心去上清液，沉淀用2~3倍体积的含0.5mol/LNaCI的提取缓冲液充分悬浮后，低温(4?)下振荡浸提24h，16000*g离心20min，上清液透析后用于细胞壁酸性转化酶活性和数量的测定。透析方法同上。 可溶性酸性转化酶和细胞壁转化酶活性的测定参照Miron&Schaffer(1991)的方法，测定反应液为0.1mol/L乙酸一乙酸钠缓冲液(pH4.8)，0.1mol/L蔗糖。用3，5一二硝基水杨酸测定其生成还原糖的量。 蔗糖合成酶的测定方法 蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶(SS)、(SPS)是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内的功能有所不同。蔗糖合成酶(SS)以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶(SPS)以果糖-6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。 蔗糖的合成(二条途径): 1、蔗糖合成酶 (非光合组织)UDPG+果糖 ?蔗糖+UDP 2、磷酸蔗糖合成酶(光合组织)UDPG+F-6-P ? 磷酸蔗糖+UDP 磷酸蔗糖+H2O? 蔗糖+Pi 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂 HEPES-NaOH(50mmol/L，pH7.5)缓冲液，包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;2 0.2%(W/V)BSA;2%PVP; 0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。 2、酶活性测定 依次加入 50μL粗酶液， 50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5， 20μL 50 mmol/LMgCI， 2 20μL 100mmol/L UDPG， 20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖)， 30?中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80?水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作: 取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。 4、计算 ,1,1样品中酶活性(μg?g?h)= 式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg); V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1 V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2