马铃薯脱毒种薯生产技术规程

马铃薯脱毒种薯生产技术规程 ICS 65.020.20 B 23 DB51 四川省地方标准 DB51/T 818—2008 马铃薯脱毒种薯生产技术规程 Technical Procedures of Virus-free Seed Potato Production 2008-6-6发布 2008-9-1实施 发布四川省质量技术监督局 DB51/T 818—2008 目 次 前言----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------? 1.范围---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 2.规范性引用文件------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 3.术语和定义------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 4.脱毒组培苗快繁------------------------------------------------------------------------------------------------------------2 5.原原种生产-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------3 6.原种生产----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------4 7.脱毒种薯繁育体系(见附录G)----------------------------------------------------------------------------------------4 附录A MS培养基贮备液的配制----------------------------------------------------------------------------------------5 附录B(规范性附录) 酶联免疫吸附试验法 ------------------------------------------------------------------------6 附录C(规范性附录) 往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法---------------------------------------------------------8 附录D 种薯切块操作程序 ----------------------------------------------------------------------------------------------12 附录E 主要病虫害防治--------------------------------------------------------------------------------------------------12 附录F(规范性附录) 马铃薯主要虫害症状与防治方法--------------------------------------------------------13 附录G 脱毒种薯繁育体系 ----------------------------------------------------------------------------------------------15 I DB51/T 818—2008 前 言 本标准附录B、附录C、附录F为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省农业技术推广总站、成都市农林科学院作物研究所负责起草。 本标准主要起草人:陈涛、章锐、周孝强、梁南山、何卫等。 II DB51/T 818—2008 马铃薯脱毒种薯生产技术规程 1 范围 本规程规定了马铃薯脱毒苗的培育、繁殖，各级脱毒种薯的生产、扩繁栽培和各级脱毒种薯的检验、收获、贮藏等技术操作规程。 本规程适用于四川省马铃薯脱毒种薯生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成 协议 离婚协议模板下载合伙人协议 下载渠道分销协议免费下载敬业协议下载授课协议下载 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 3243-82 马铃薯种薯生产技术操作规程 GB 7331-2003 马铃薯种薯产地检疫规程 GB 18133-2000 马铃薯脱毒种薯 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1脱毒组培苗(Virus-free in-vitro plantlets) 简称脱毒苗，是应用茎尖组织培养技术获得的、经检测确认不带马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯M病毒(PVM)或马铃薯S病毒(PVS)等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的再生试管苗，经过组织培养方法大量扩繁的且不带上述病毒和类病毒用于生产原原种的试管苗。 3.2试管薯 (In-vitro micro tuber) 脱毒苗经诱导培养，直接在试管(或瓶)内结的小薯。 3.3扦插苗 (Trans-plants) 脱毒苗切段在网室扦插成活或马铃薯试管薯直播于网室出苗后，剪取其主茎及侧枝顶端扦插成活的苗。 3.4脱毒种薯 (Virus-free seed potato) 从繁殖脱毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯数量的种薯生产体系生产出来的各级种薯。 脱毒种薯分为原原种、原种、生产用种薯。 3.4.1原原种 (Pre-basic seed)(脱毒小薯) 利用组培苗或系选苗(clonal selection)在防虫网室和温室条件下生产出来的、不带马铃薯病毒、类病毒及其他马铃薯病虫害的、质量在1 g,10 g之间的小薯。 3.4.2原种 (Basic seed) 用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯。 3.4.3生产用种薯 (Certified seed) 用原种或其加代繁殖一代后作种薯，在隔离条件下生产出的符合一级种薯质量标准的种薯。 3.5病毒病株允许率 (Maximum virus-infected plant percentage allowed) 脱毒种薯繁殖田中病毒病株的允许百分率。 3.6细菌病株允许率 (Maximum bacterial- infected plant percentage allowed) 1 DB51/T 818—2008 脱毒种薯繁殖田中细菌病株的允许百分率。 3.7 真菌病株及其它病株允许率 (Maximum fungal or other pathogen infected plant percentage allowed) 脱毒种薯繁殖田中真菌病株和其它病株的允许百分率 3.8 混杂植株允许率 (Maximum off-type plant percentage allowed) 脱毒种薯繁殖田中混杂的其它马铃薯品种植株的允许百分率。 3.9 有缺陷薯 (Defect tuber) 指畸形、次生、龟裂、虫害、冻伤、黑心和机械损伤的薯块。 3.10 隔离栽培 (Isolated planting) 指在与病虫害相对隔离条件下进行的栽培方式。 3.11扩繁栽培 (Multiplication planting) 主要指l g以上脱毒原原种直接种入大田，采取调节播种期、喷药防虫、剔除病、杂株等综合保护措施，生产脱毒原种的种植方式。 4 脱毒组培苗快繁 4.1 脱毒组培苗的培育 4.1.1 选材:应选用生产上主栽的、或具有某种特性(如抗马铃薯癌肿病)优良品种块茎的休眠芽或刚出土幼苗的茎尖、或田间成株上的叶芽作茎尖剥离材料。 4.1.2 培养基的制备:在每l000 mlMS培养基(见附录A)中加GA0.2 mg,0.3 mg、6-BA0.1 mg,0.2 mg、3 NAA0.01 mg,0.05 mg、泛酸钙1.5 mg,2.5 mg，分装入管(或瓶)。 24.1.3 灭菌:在0.15 Mpa,cm压力下灭菌15 min,20 min，冷却备用。 4.1.4 茎尖剥离接种:将入选材料放入纱布袋，用自来水冲洗1 h后，在无菌条件下，放入70 ,,75,酒精中浸2 s,3 s，再用0.1 ,升汞液消毒3 min,6 min(或用3 ,次氯酸钠液加2,4滴吐温振荡消毒15 min,20 min)，取出用无菌水冲洗3,5次，用灭菌滤纸吸干材料表面水分，在体视解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶，切取带l,2个叶原基(0.1 mm,0.4 mm大小)的生长点，迅速接入装有茎尖分化培养基的试管或培养瓶中，每管(瓶)放1个生长点。注明品种，茎尖号，接种期。 4.1.5 培养条件:日温25 ?，夜温15 ?，光照时数l 2 h,d,14 h,d，光照强度2 000,3 000 1x条件下培养。 4.2 病毒检测 本单位自检，然后送国家法定植检部门复检认定。 用于检测的数量不低于总数的10 %。根据检测结果出具检验结果报告单，如果脱毒苗没有检出PLRV、PVY、PVA、PVX、PVM或PVS和PSTVd等病毒和类病毒，则应批准进行组培苗生产。不合格的脱毒苗不得用于组培快繁。 4.2.1 检测方法:马铃薯PLRV、PVY、PVA、PVX、PVM或PVS等病毒，用酶联免疫吸附(ELISA)法检测(见附录B)，无阳性反应再用指示植物鉴定。纺锤块茎类病毒(PSTVd)用往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(R-PAGE)检测(见附录C)，鉴定筛选出不带PLRV、PVY、PVA、PVX、PVM、PVS和PSTVd的脱毒苗。 4.2.2 脱毒苗复检:继代扩繁中选留的脱毒苗，每年至少作一次病毒复检。 4.3 脱毒苗组培快繁 4.3.1 脱毒组培苗来源:经4.2.1检测，脱除了所列病毒的组培苗。 4.3.2 培养基:用MS培养基。灭菌同5.1.3。 4.3.3 快繁:将脱毒苗剪切成1 cm左右，带一叶一芽的茎段接种于继代培养基上，每瓶培养基接种10,15个茎段，待茎段长成高10 cm左右小苗(培养15 d,30 d)，进行切段转接，如此，反复继代培养繁殖。 4.3.4 培养条件:同4.1.5 2 DB51/T 818—2008 4.4 脱毒组培苗的保存 4.4.1 培养基:Ms+B5 mg/l,10 mg/l+甘露醇40 mg/l+琼脂7000 mg/l+40000 mg/l。pH5.8.每瓶装培养9 基45 ml~70 ml，灭菌同4.1.3。 4.4.2 接种:选继代培养中生长健壮的组培苗，进行切段，每瓶接种10个茎段。 4.4.3 培养:置弱光(1000 lx)和较低温度(5 ?~10 ?)下保存。3,6个月转接一次。3 y,4 y更新一次用于快繁的脱毒组培苗。 5 原原种生产 用脱毒组培苗或试管薯在60目以上网室内隔离栽培。 5.1 隔离网室的建立 5.1.1 环境条件:选择四周无高大建筑物，水源、电源、交通便利，通风透光的地方建网室。 5.1.2 建设要求:隔离网室用热镀锌钢管作支撑，高3 m,3.5 m，宽6 m,10 m。网室内地表及网室四周2 m内，应建成水泥地面，网室周围10 m范围内不能有其它可能成为马铃薯病虫害侵染源或可能成为蚜虫寄主的植物。严防网室内地表积水和网室外水流入。用于隔离的的网纱孔径要达到60,80目。 5.2 扦插(或播种)前准备 5.2.1 炼苗:将长到7,8片叶，苗龄30 d左右的组培苗拔去瓶塞，炼苗2 d,3 d。 5.2.2 基质:蛭石、草炭、珍珠岩或细砂均可作基质。生产原原种以蛭石、珍珠岩混合基质为好，混合比例2:1，将混合基质装入规格适宜的育苗盘，基质装填前应充分吸水。每茬薯收后基质必须严格蒸煮消毒，一般反复使用3 y,4 y。 5.2.3 消毒:工作人员进出棚必须更换鞋和工作服，并用肥皂洗净手。扦插(或播种)工具每次使用前均应蒸煮消毒，不能蒸煮的用肥皂水认真清洗后用75 ,酒精浸泡消毒。 5.2.4 切段:将经炼苗的脱毒试管苗用镊子轻轻取出，用剪刀剪为3 cm,4 cm长的茎段，供扦插用。 5.2.5 剪尖:扦插的脱毒苗高5 cm,7 cm、直播薯苗高8 cm,10 cm，侧枝长5 cm,6 cm时，剪取3 cm,4 cm长的主茎顶端或侧枝尖端(每株只剪3,4次)，供扦插用。 5.3 切段和扦插苗处理 将切段和扦插苗放入20 ppmNAA+1 ‰克露+1 ‰威力特的混合液中浸泡10 min,15 min后取出备插。 5.4 试管薯播种与剪尖苗扦插 5.4.1 选薯:生产原原种用的试管薯，必须是通过休眠、萌芽整齐的薯。 5.4.2 密度:生产原原种的组培苗切段扦插株行距为2.5 cm×2.5 cm;扦插苗为3.3×3.3 cm。 5.4.3 放盘:将插、播好的育苗盘规范整齐放置于网室，分厢放置，每厢24,30盘，每厢间隔80 cm。 5.5 管理 5.5.1 拱棚盖膜:脱毒苗(或薯)插(播)好后，轻细均匀喷水，使基质充分饱和吸水，及时拱棚盖膜，小拱棚内相对湿度保持在90 ,,95 ,。 5.5.2 施肥:从小苗生根成活(插后7 d,,, d)及时撤拱棚到收薯前10 d，根据苗情喷施0.2 ,, 20.3 ,N:P:K,2:1:3的营养液4,6次，每厢(3.5 m)喷7500 ml(出拱棚后喷第一次肥浓度应减半，每7 d,10 d喷一次)。 5.5.3 浇水:勤浇、细浇、少浇，保持基质湿润，持水量50 ,,60 ,，收前7 d,10 d停止浇水。 5.5.4 病虫害防治:防治对象、时期、方法按附录D执行。发现病株连同薯块拔除，带出网室外销毁。 5.6 收获、包装(贮存 5.6.1 原原种收获:早熟种在插后60 d,65 d，中早熟种65 d ,70 d，晚熟种在插后75 d,80 d即可收获。收获时避免机械损伤和品种混杂。收后摊晾4 d ,7 d，剔除烂薯、病薯，伤薯及杂物。 5.6.2 分级标准:按种薯个体重量大小依次分为5 g以上、3 g,5 g、1 g,3 g三个等级。 5.6.3 包装:包装采用尼龙网袋包装，每袋2000粒左右，按等级和收获期分品种装袋，作好标记，双标签，袋内袋外各一。 3 DB51/T 818—2008 5.6.4 贮存方式:根据当地气候，种薯生产量、收期、设备条件及用种季节，将种薯置于常温或低温室(平摊或上架)内避光贮存。 5.6.5 贮存条件:低温贮存5 ?,8 ?。相对湿度80 ,,90 ,。 5.6.6 贮存(包装)量:装袋不超过网袋体积的三分之二，平堆厚度为30 cm左右。 6 原种生产 6.1选地:选择海拔1500 m以上的高寒少蚜山区或中低海拔地区自然隔离条件良好(500 m内无茄科、十字花科作物，无商品薯种植)土质疏松、肥力中上、排灌方便两年内未种植过茄科和十字花科作物向阳的地块(最好是砂壤土)。 6.2 种薯准备:选用通过休眠、芽短壮的原原种做种薯。播种前2个月，将在低温室或专用库内贮藏的原原种薯取出，剔除病薯，烂薯后，置于20 ?,3O ?，有散射光的室内，让其自然通过休眠发芽，促芽变绿。10 g以上的薯可切块播种，每块带2个以上芽眼(见附录D)。 6.3播种 26.3.1双行高厢垄作:行距60 cm，株距20 cm。5555株/667 m株。 26.3.2底肥:腐熟农家肥1500 kg,2000 kg/667m，尿素5 kg，过磷酸钙20 kg，硫酸钾l0 kg。 6.3.3播种期:春播在2月,3月，秋播在7月,9月。 6.4田间管理 6.4.1追肥、中耕、培土:齐苗后及时追施尿素5 kg,667 ?，结合第一次中耕除草进行。7,8片叶时第二次中耕，培土成低垄。现蕾开花期第三次中耕，培土成高垄。第二、三次培土前喷施KHPO。每次24200 g,667 ?。 6.4.2 去杂去劣 现蕾至盛花期，两次拔除混杂植株，异常株，包括地下块茎。 6.4.3病虫害防治 ——防病:病害防治主要防治早、晚疫病、清枯病，发现中心病株及时拔除带出田外处理。并喷施杀菌剂保护，每7,10d一次(见附录E、F)。 ——严格防蚜:齐苗后选用不同杀虫剂，每7 d,10 d防治蚜虫一次，连续3,4次(见附录E、 F)。 6.5收获、包装、贮存:按5.6有关规定执行。 7 脱毒种薯繁育体系(见附录G) 4 DB51/T 818—2008 附 录 A MS培养基贮备液的配制 用量(mg/l) 每升培养基取用量(ml) 贮备液 成 分 A 硝酸铵(NHNO) 33000 50 43 硝酸钾(KNO) 38000 3 磷酸二氢钾(KHPO) 3400 24 硫酸镁(MgSO?7HO) 7400 42 氯化钙(CaC?2HO) 8800 l22 B 硫酸亚铁(FeSO?7HO) 5570 5 42 乙二胺四乙酸二钠(Na?EDTA) 7450 2 C 碘化钾(KI) 166 钼酸钠(NaMoO?2HO) 50 242 硫酸铜(CuSO?5HO) 5 5 42 氯化钴(CoCl?6HO) 5 22 硫酸锰(MnSO?4HO) 4460 42 硫酸锌(ZnSO?7HO) 1720 42 硼酸(HBO) 1240 33 D 盐酸硫胺素(VB) 20 1 盐酸吡哆素(VB) 100 6 甘氨酸 400 5 烟酸 100 肌醇 20000 E 蔗糖 30000 琼脂 7 注:在配制贮备液A时，最后加氯化钙;在配制贮备液B时，分别溶解FeSO4?7H2O和Na2?EDTA在 各自的450 ml蒸馏水中，适当加热并不停搅拌。然后将两种溶液混合在一起，PH值到5.5，最后加蒸馏 水定容到1000 ml。培养基PH值5.8。 5 DB51/T 818—2008 附 录 B (规范性附录) 酶联免疫吸附试验法 应用双抗体夹心法(Double Antibody Sandwich Method)检测马铃薯脱毒苗是否带有PVX、PVY、PVS、PLRV等主要马铃薯病毒。 B.1 仪器和设备 B.1.1 聚乙烯微量滴定板:有40孔和96孔两种规格，均可使用。 B.1.2 微量可调进样器:需2-10 μL、10-50 μL和10-200 μL三种规格，并附相应规格的塑料头。 B.1.3 冰箱。 B.1.4 保温箱:温度设置为37?。 B.1.5 直径8cm的瓷研钵及钵锤。 B.1.6 酶联免疫检测仪:检测辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase. HRP)标记的酶标记抗体用490nm，波长检测，碱性磷酸(Alkaline Phosphatase AKP)标记的酶标抗体用405nm波长检测。 B.2 应用的化学试剂 所用为分析纯级规格、用水为蒸馏水。 B.2.1 抗体免疫球蛋白(r-globulin)和酶标记抗体(Coniugate):从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，将其浓度调为1 mg/ml，做为包被微量滴定板的抗体。用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标记抗体、浓度为1:1000以上，贮藏条件为4 ?。 B.2.2 碳酸盐包被缓冲液:pH9.6:1.59 gNaCO(碳酸钠)，2.93 gNaHCO(碳酸氢钠)加水至1升。 33 B.2.3 PBS一TWeen20缓冲液，pH7.4:8 gNaCl(氯化钠)0.2 gkHPO(磷酸二氢钾)、2.2gNaHPO?7H2424O(磷酸氢二钠)或2.9 gNaHPO?12HO，0.2 gKCl(氯化钾)加水至1升，然后加0.5 ml Tween-20，2242 洗涤微量滴定板用。 B.2.4 样品缓冲液:取PBSTween-20缓冲液100 mL，加聚乙烯吡咯烧酮(PVP)2 g。 B.2.5 底物缓冲液: 取0.2 M NaHPO?12HO溶液25.7mL加0.1 M柠檬酸溶液24.3 mL加水50 mL，pH调242 至5.0(现用现配)临用前加磷苯二胺40 mg，30 ,HO，(过氧化氢)0.15 ml混匀，避光放置，应为白2 色或微黄色溶液。 B.2.6 终止液:为0.2 M硫酸溶液，用1体积浓硫酸加9份水。 B.3 操作步骤 B.3.1 包被微量滴定板:把免疫球蛋白用包被缓冲液按1:1000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加入稀释的免疫球蛋白200μL。在37?条件孵育1h。(或在4 ?条件下过夜)。 B.3.2 洗涤包被的微量滴定板:甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在吸水纸上敲打微量滴定板，除尽残留溶液。向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液，停留30min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3次，以除尽未吸附的免疫球蛋白。 B.3.3 加被检测的样品 B.3.3.1 取样:在无菌条件下，从瓶苗上剪下长2 cm茎段，放在小研钵内，把取样的试管苗放回原瓶内，封好瓶口，把样品编好号，以便检测结果决定取舍。 B.3.3.2 向小研钵内加样品缓冲液，加入液量依每个样品上样的孔数而定，例如每个样品准备上样一个样品孔时，可加入0.4 mL样品缓冲液，研磨后可得200 μL清液，够上一个样品孔用。 6 DB51/T 818—2008 B.3.3.3 加入检测样品:向编好号、洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号、逐个加入提取的样品液200μL，每一块微量滴定板上，可设两个阳性对照孔。两个阴性对照孔和两个空白对照孔。 B.3.3.4 把加完样品的微量滴定板，在37 ?条件下孵育4-6 h，或在40?条件下过液，然后按A3.2洗涤微量滴定板。 B.3.3.5 加酶标记抗体: 把酶标记抗体用样品缓冲液按1:1000稀释，向每个样品孔中加入200 μL稀释的酶标记抗体。 B.3.3.6 洗涤微量滴定板:按3:2方法洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。 B.3.3.7 加底物: 使用国产酶标检测仪器测定光密度时，向每一样品孔内加底物缓冲液100μL。如果用进口Bio-Rad 550型等进口酶标检测仪时则可加入200μL底物，当观察到阴性对照孔与阳性对照孔显现的颜色可以明确区分时(辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现桔红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色);或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色可以明确区分时，每孔加入30μL终止液，如加入200 μL底物缓冲液时则加入50 μL终止液。(碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液)。 B.4 结果判定 B.4.1 目测观察:显现颜色的深浅与病毒相对浓度呈正比。显现白色为阴性反应，记录为“—”;显现淡桔红色即为阳性反应，记录为“，”，依颜色的逐渐加深记录为“，，”和“，，”。 B.4.2 用酶联检测仪测定光密度值:样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍、即判定为阳性反应，(阴性对照孔的光密度值应?0.1)。 B.5 计算结果: m l,——×100, n 式中; l——马铃薯病毒检出率 m——呈阳性反应样品数量 n——实验室样品数量 结果用两次重复的算术平均值表示，脱毒苗病毒检出率修约间隔为1，并标明经舍进或未舍未进。 7 DB51/T 818—2008 附 录 C (规范性附录) 往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (Two-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 应用本法检测脱毒苗是否感染有马铃薯纺缍块茎类病毒。 C.1 范围 规定了马铃薯纺缍块茎类病毒(PSTVd)的检测方法。 适于检测马铃薯纺缍块茎类病毒。 C.2 引用标准 GB 18133-2000 马铃薯脱毒种薯 NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程(检测方法引用NY/T 401-2000) C.3 原理 类病毒分子在自然和变性条件下电泳迁移率不同，变性所引起类病毒核酸的环状结构使其电泳迁移率明显慢于桢分子量的其它线性RNA分子，因而第二向电泳中类病毒核酸的环状结构明显滞后，据此，结合可靠灵敏的银染色技术测定类病毒。 C.4 试剂 本方法所用化学试剂为分析纯极规格，用水为蒸馏水，个别要求无菌水。 C.4.1 盐酸溶液 [ψ(HCl)=1+4] 量取盐酸10 mL，加入40 mL水，混匀。 -1-1C.4.2 核酸提取缓冲液 [ρ{(CHOH)CNH}=12.11 g?L，ρ(CHNONa?2HO)=3.72 g?L，ρ23310142822-1(NaCl)=5.88 g?L ] 称取三羟甲基氨基甲烷((CHOH)CNH3)12.11 g，乙二胺四乙酸二钠(CH231014NONa?2HO)3.72 g，氯化钠(NaCl)5.88 g溶于900 mL水中，用盐酸溶液(4.1)通过酸度计(5.1)2822 调pH值为9.0~9.5，定容至1000mL。 -1-1C.4.3 TAE缓冲液贮液[ρ{(CHOH)CNH}=48.46 g?L，ρ(CHCOONa)=16.40 g?L，ρ(CHN233310142-1ONa?2HO)=7.44 g?L]，称取三羟甲基氨基甲烷((CHOH)CNH)48.46 g，无水乙酸钠(CHCOONa)822233316.40g，乙二胺四乙酸二钠(CHNONa?2HO)7.44 g，溶于900 mL水中，用冰乙酸通过酸度计(5.10142822 4)调pH值为8.1，定容至1000 mL。 -1-1C.4.4 TAE缓冲液工作液[ρ((CHOH)CNHa)=4.85 g?L，ρ(CHCOONa)=1.64 g?L，ρ(CHN23331014-1ONa?2HO )=0.74 g?L ]量取TAE缓冲液贮液(4.3)200 mL，加水1800 mL。 2822-1-1C.4.5 TBE电泳缓冲液贮液 [ρ((CHOH)CNH)=107.8 g?L，ρ(HBO)=55.0 g?L，ρ(CHN2333310142-1ONa?2HO)=9.3 g?L] 称取三羟甲基氨基甲烷((CHOH)CNH)107.8 g ，硼酸(HBO)55.0 g，82223333乙二胺四乙酸二钠(CHNONa?2HO)9.3 g溶于少量水中，定容至1 000 mL。 10142822-1-1C.4.6 TBE电泳缓冲液工作液[ρ((CHOH)CNH)=10.78 g?L，ρ(HBO)=5.50 g?L，ρ(CH233331014-1NONa?2HO)=0.93g?L]量取变性电泳缓冲液贮液(4.5)200 mL，加水1800 mL。 2822-1C.4.7 低盐溶液[ρ(NaCl)=11.7 g?L]称取9.35g氧化钠(NaCl)溶于800 mLTAE缓冲液工作液(4.4)中，0.1MPa灭菌30 min。 -1C.4.8 高盐溶液 [ρ(NaCl)=87.75 g?L]} 称取氧化钠(NaCl)70.13 g，溶于800 mL TAE 缓冲液工作液(4.4)中，0.1 MPa灭菌30 min。。 8 DB51/T 818—2008 -1-1C.4.9 丙烯酰胺贮液[ρ(CH2,CHCONH2)=290.0g?L，ρ(CH2,CHCONH2)2CH2=10g?L ] 称取丙烯酰胺(CH2,CHCONH2)29.0g，甲叉双丙烯酰胺((CH2,CHCONH2)2CH2)1g，37?溶于100 mL水中。冰箱冷藏室(5.13)保存。 -1C.4.10 过硫酸铵溶液 [ρ((NH)S0)=222.2g?L] 称取过硫酸铵(NH)S0)1.0g，溶于4.5 mL22282228灭菌水中，冰箱冷藏室(5.13)保存。 C.4.11 四甲基乙二胺(CHN(CH)NCH)。 3223 C.4.12 核酸固定液 [ф(CHCHOH),10,，ф(CHCOOH)=0.5,] 量取.50 mL 95,乙醇(CHCHO32332H);2.5 mL冰乙酸(CHCOOH)加水定容至500 mL。 3-1C.4.13 染色液[ρ(AgNO)=2.0g?L] 称取1.0g硝酸银(AgNO)溶于水，定容至500 mL。 33-1C.4.14 核酸显影液 [ρ(NaOH)=16g?L]，ф(HCHO),0.4,] 称取8g 氢氧化钠(NaOH)，溶于500 mL水中，用前加2mL甲醛(HCHO)，现用现配。 -1C.4.15 增色液[ρ(Ha2CO3)=7.5g?L]取3g 碳酸钠(Ha2CO3)，溶于400 mL水中。 -1-1-1C.4.16 指示剂[ρ(CHNNaOS)=1.0g?L，ρ(CHOBrS)=1.0g?L，ρ(CHO)0.4g?L]= 2527272191054122211称取100 mg二甲苯兰(CHNNaOS)、100 mg溴酚兰 (CHOBrS)、40 g蔗糖(CHO)，溶于10 mL 2527272191054122211TBE电泳缓冲液贮液(4.5)中，然后加入90 mL水，混匀。 C.4.17 琼脂糖溶液 称取1 g琼脂糖，量取10 mL TBE电泳缓冲液贮液(4.5)，加入90 mL灭菌水中，加热溶解。 C.4.18 聚丙烯酰胺凝胶 量取丙烯酰胺贮液(4.9)8.3 mL，TBE电泳缓冲液贮液(4.5)5 mL，四甲基乙二胺(4.11)50~60μL，溶解并用无菌水定容至50 mL混匀，灌胶前加过硫酸胺溶液(4.10)450μL，混匀，立即灌胶，此液应现配现用。 C.5 仪器设备 C.5.1 DYY-?6B电泳仪和DYY-?28C电泳槽。 C.5.2 TGL-16G高速台式离心机 最高转速:21000 r/min。 C.5.3 Sigma 3K30高速冷冻离心机 控制范围:(-20~40)?，最大转速:30000r/min。 C.5.4 PHS-3C酸度计 量程:pH(0~14)，精度:?0.01pH。 C.5.5 DL-101-2S电热鼓风干燥箱 量程:R?T+20~300?，精度:?1?。 C.5.6 移液器 20 μL，40 μL，200 μL，1 000 μL。 C.5.7 752w 紫外分光光度计 量程220~800nm，精度:?2nm C.5.8 一次性注射器 5 mL，50 mL。 C.5.9 量筒 50 mL，100 mL，200 mL，2 000 mL。 C.5.10 容量瓶 50 mL，100 mL，500 mL。 C.5.11 吸量管 5 mL，10 mL，20 mL。 C.5.12 MDF-U332低温保存箱。 C.5.13 BCD-261冰箱。 C.6 试剂制备 C.6.1 样品粗提液制备 取样品(脱毒苗、薯块的薯肉)3 g左右放入干燥的研钵中，加入液氮进行研磨。研碎后向小研钵中加入10 mL核酸提取缓冲液(4.2)，SBS粉(十二烷基磺酸钠)约0.1g、皂土约0.1 g，再研磨6~10 min。向小研钵中加入120μLβ-巯基乙醇，再研磨6~10 min。加入11 mL苯酚。研磨6~10 min。加入12mL氯仿，再研磨6~10min。将研好的样倒入50 mL干净的离心管中，用氯仿平衡。高速冷冻离心机(5.3)4 ?、9000~10000r/ min离心20~25min，用移液器(5.6)，将上层水相(样品粗提液)转移到另一清洁的离心管中，可现用，也可冻存(-20?)。 9 DB51/T 818—2008 C.6.2 核酸纯化 将6.1中有上清液的离心管拿出备用。在100 mL无菌水中加入一定量的可溶性纤维素，混匀备用。 装柱:用带孔的橡皮塞和细纱装入5 mL的一次性注射器(5.8)，向注射器中加纤维素液，直至纤维素沉积至3.5 mL左右处，期间要不断加入无菌水。 上样:将上清液缓慢加入到柱中，直到加完为止。用低盐溶液(4.7)洗脱，每次加入2 mL，共20次约40 mL左右。待柱中低盐将流尽时，加入1 mL高盐溶液(4.8)进行清洗，然后将50mL干净离心管置于柱下分4次(每次2 mL)加入8 mL高盐溶液(4.8)，待高盐洗液全部流入50 mL离心管为止。向装有高盐洗液的50mL离心管中加入冻存的95,乙醇，加入量是离心管中液体的3倍左右，摇匀，放入低温保存箱(5.12)-20 ?以下冷冻，时间不得少于2 h。 C.6.3 总核酸提取 将冻存的离心管拿出来，用95 ,的乙醇平衡，然后用高速冷冻离心机(5.3)1 ?~4 ?、10000 r/min离心20 min，倒掉上清液，将离心管倒立放在铺好的干净滤纸上。待水分吸干后，向离心管中加75 ,的乙醇，加入量是离心管容积的1/3，进行清洗，时间为10 min ~20 min。用75 ,乙醇平衡，用高速冷冻离心机 (5.3)1 ?,4 ?、10000 r/min离心1 0min，倒掉乙醇，将剩余乙醇全部挥发掉。 C.6.4 试样获得 将TAE缓冲液工作液(4.4)200 μL加入到盛有总核酸的50 mL离心管中进行溶解，然后用移液器(5.6)将其移到1.5 mL干净的离心管中，再次用200 μL TAE缓冲液工作液 (4.4)进行清洗，将清洗液全部转移到1.5 mL离心管中。 C.7 测定步骤 C.7.1 试料 将盛有试样(6.4)的离心管在漩涡混合器上振混匀，然后用高速台式离心机(5.2)4 000 r/min离心3 min ~5 min。 然后量取15 μL样品，用3 000 μL TAE缓冲液工作液(4.4)稀释，以不加样品的TAE缓冲液工作液(4.4)为空白对照，紫外分光光度计(5.7)260 nm处，测定各试样光吸收值。 A260×201-1ρ(RNA)/μg?μL= ———————— =8.04 A260 0.025×1 000 m 一般电泳加样试料的RNA质量(m)要求相对一致，据V = ——，计算试料体积(V) ρ C.7.2 测定 C.7.2.1 制板 取洁净电泳槽，琼脂糖溶液(4.17)封底，注入聚丙烯酰胺凝胶(4.18)，反加样梳插入做成泳道。 C.7.2.2 加样 按7.1中计算试料体积，混入指示剂(4.16)和TBE缓冲工作液(4.6)，总量为40 μL,60 μL。 C.7.2.3 正向电泳 加入TBE电泳缓冲液工作液(4.6)，进行从负极到正极电泳，电泳仪(5.1)电压调到150 V。当示踪染料二甲苯兰迁移到距凝胶底部1 cm,2 cm时，停止正向电泳。将电泳槽中缓冲液倒掉，把电泳槽置于入电热鼓风干燥箱(5.5)中75 ?预热30 min，然后向电泳槽中加入75 ?的TBE缓冲液工作液(4.6)变性15 min。 C.7.2.4 反向电泳 在电热鼓风干燥箱(5.5)中进行从正极到负极的反向电泳，电泳仪(5.1)电压调至200 V，当二甲苯兰示踪染料带迁移到胶板上方刚跑出水面时停止电泳，取出凝胶片进行染色。 C.7.2.5 固定 把凝胶片放在置有400mL核酸固定液(4.12)的培养皿中，轻轻振荡10 min，固定0.5 h,1 h，然后用50 mL注射器(5.8)吸净固定液。 10 DB51/T 818—2008 C.7.2.6 染色 向培养皿中加入400 mL染色液(4.13)，轻轻振荡10min，染色30 min,40，然后吸出染色液(可重复使用)。 C.7.2.7 漂洗 用蒸馏水清洗凝胶板，以除掉残留的染色体，共冲洗四次，每次用水400 mL，每次冲洗15 S。 C.7.2.8 显影 加入核酸显影液(4.14)400 mL，轻轻摇荡，直到核酸带显现清楚为止。 C.7.2.9 增色 吸出显影液，加入增色液(4.15)400 mL，增色5 min左右。吸掉增色液拍照。 C.8 计算结果 与阳性对照相同位置有谱带出现者为阳性。 呈阳性反应样品数量 马铃薯纺锺块茎类病毒(PSTVd)检出率,————————————×100, 实验室样品数量 结果用两次重复的算术平均值表示，修约间隔为1，并标明经舍进或未舍未进。 阳性对照(PSTVd的RNA)泳道下方约1/4处应有拖后的黑色核酸带。 C.9 判定 用全数值比较法，标准规定各级别种薯马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)允许率应为零，检出变大于零。或经舍弃为零者均不合格。 11 DB51/T 818—2008 附 录 D 种薯切块操作程序 D.1 器材: 切刀:2 把; 塑料盆:2 个; 箩筐:2 个 消毒药液:2000 m1(0.1 ,酸性升汞、0.1 ,高锰酸钾、75 ,乙醇、5 ,碳酸任选一种即可)。 D.2 操作程序 D.2.1 将配好的药液倒入盆，切刀柄朝上浸入药液中。 D.2.2 先取出一把刀，切完一个种薯后放回药液;取另一把切刀，再切完一个种薯又放回药液。如此两把刀交替使用。 D.2.3 切薯块时，边切边肉眼观察切面，发现病薯或可疑薯块即全部淘汰。 D.2.4 切好的薯块用放入清洁箩筐备用。 附 录 E 主要病虫害防治 防治对象 药剂及剂量 防治时期、方法 脱毒苗扦插成活出棚后至收40 ,乐果乳油、威力特、万灵等按产蚜虫 前15 d，网室内外每隔d 7,品说明交替使用 10 d喷一次。 安克锰锌、克露、抑快净、甲霜铜等按发病初期开始用药，每隔7 早、晚疫病 产品说明交替使用 d ,10 d喷一次。 尼索朗、阿巴丁、浏阳霉毒、阿维哒螨初见虫或卵时用药，每隔7 螨类 等按产品说明交替使用 d ,10 d喷一次。 万灵+阿维哒螨或威力特等按产品说明早上9点以前用药，每隔7 潜叶蝇、块茎蛾 使用 d ,10 d喷一次 12 DB51/T 818—2008 附 录 F (规范性附录) 马铃薯主要虫害症状与防治方法 F.1 马铃薯瓢虫 F.1.1 症状 又名28星瓢虫，俗称花大姐，其成虫和幼虫均能危害马铃薯，咬食叶片背面叶肉，使被害部位只剩叶脉，形成有规则的平等透明网状细纹，植株逐渐枯黄。 F.1.2 防治措施 F.1.2.1 捕杀成虫 消灭成虫越冬场所。 F.1.2.2 药剂防治 发现成虫开始为害后，利用杀虫剂，参照使用标准进行防治。 F.2 马铃薯块茎蛾 F.2.1 症状 俗名马铃薯蛀虫、串皮虫等，幼虫蛀食马铃薯叶和块茎，当幼虫潜入马铃薯叶片内造成隧道为线形，幼虫孵化后在芽眼处吐丝结网蛀入内部，造成弯曲的隧道，严重的可被蛀空，外形皱缩，并能引起腐烂。 F.2.2 防治措施 F.2.2.1 严格检疫，杜绝有块茎蛾为害地区种薯外运。 F.2.2.2 种薯入窖前用杀虫剂熏蒸，消灭成虫。 F.2.2.3 种薯田进行高培土，防止块茎露出土面。 F.3 马铃薯蚜虫 F.3.1 症状 又名腻虫，以成、若蚜密集在幼苗、嫩茎、嫩叶和近地面的叶背，剌吸寄主汁液。由于繁殖量大，密集为害，故使受害株严重失去养分和水分，形成叶面皱缩、发黄。 F.3.2 防治措施 F.3.2.1 早春和晚秋清除残株，枯叶和杂草，消灭部分越冬蚜虫和卵。 F.3.2.2 在点片发生阶段，利用杀虫剂防治。 F.4 马铃薯金针虫 F.4.1 症状 以幼虫为害幼苗根茎，但不完全咬断，断口处不整齐，呈丝状，并可蛀入块茎中取食为害。 F.4.2 防治措施 F.4.2.1 春耕或春播前耙地时，药剂处理土壤。 F.4.2.2 苗期撒施毒谷、毒饵诱杀。 F.4.2.3 及早秋耕，消灭即将入深土层越冬的幼虫或成虫。 F.5 地老虎 F.5.1 症状 1~2龄幼虫昼夜在植株上取食为害，咬食嫩叶的叶肉，残留表皮，造成针孔状花叶，3龄可将叶片咬成小孔或缺刻，4龄后则可咬断幼苗基部嫩茎。 F.5.2 防治措施 13 DB51/T 818—2008 F.5.2.1 精耕细作，清除杂草，减少初龄幼虫食料来源。 F.5.2.2 利用黑光灯、糖醋液诱杀成虫。 F.5.2.3 苗期对于2龄幼虫盛期撒施毒土或喷雾，对于3龄以上幼虫可进行毒饵诱杀。 F.6 蛴螬 F.6.1 症状 有的种类以幼虫为害为主，咬断幼苗根茎，断口整齐，还可蛀入块茎内取食。有的种类以成虫为害为主，食马铃薯嫩芽及叶片。 F.6.2 防治措施 F.6.2.1 深耕细耙，适时浇水，中耕除草，合理施肥。 F.6.2.2 苗期利用毒饵诱杀。 F.6.2.3 在金龟甲大量出土活动到产卵之前，用药防治成虫。 F.7 蝼蛄 F.7.1 症状 成、若虫均为害严重。咬食幼苗根部或近地面的嫩茎，断口处呈乱麻状，造成幼苗枯死或生长不良。在表土层串行活动，掘成隧道，使苗根与土壤分离，导致幼苗失水枯死。 F.7.2 防治措施 F.7.2.1 苗期蝼蛄为害时，利用其趋向香甜气味及马粪的习性，用毒饵诱杀。 F.7.2.2 早春越冬蝼蛄苏醒后，据地表特征毒杀。 F.7.2.3 夏季在产卵期内，挖窝灭卵。 F.8 斑蝥 F.8.1 症状 以成虫为害马铃薯，有群聚取食习性，最喜食嫩叶，也可为害老叶及嫩茎，常吃完一株，再转株取食，一般田间呈点片被害状，发生严重时，可将叶片吃光，仅留叶脉。 F.8.2 防治措施 F.8.2.1 应以消灭成虫为重点，在成虫发生为害期用药，“敌克杀”或“斑蝥素”喷洒、辅人工围歼。 F.9 草地螟 F.9.1 症状 主要以幼虫为害。初孵幼虫群聚叶背，活动甚微，2,3龄多在叶背面叶丝结网，潜于网中取食叶肉，3龄后食量增大，并出网咬食叶片，严重时常将植株上叶片吃光，仅留粗大叶脉和叶柄。 F.9.2 防治措施 F.9.2.1 彻底铲除田间、地埂杂草，减少初龄幼虫食料。 F.9.2.2 进行春、秋耕耙，破坏越冬环境，增加越冬代幼虫和蛹的死亡率。 F.9.2.3 利用黑光灯诱杀成。 F.9.2.4 药剂防治幼虫，40 ,乐果乳油800 倍，加兑8 g洗衣粉连续喷洒2,3 次。 14 DB51/T 818—2008 附 录 G 脱毒种薯繁育体系(参考件) 茎尖脱毒、病毒鉴定 具备组培和具检测 抗病新品种 脱毒苗的获得 条件的单位检测 选 育 科研、育种 脱毒试管苗切段快繁脱毒中心或具备 单 位 网室扦插生产原原种 相同条件单位 有网室或海拔2000 m省级植检 以上自然隔离条件良好网室或自然隔离地 部门检验 (800 m内无茄科、十生产一级原种 字花科作物，无商品薯 种植)的地块 ? 当 地 高海拔自然隔离条件植繁种地生产二级原种 好(500 m内无茄科和 检十字花科作物，无高代 部薯种植的地块 门 检 有自然隔离条件(300 m验繁种地生产一级种薯 内无茄科和十字花科作 物)的地块 有自然隔离条件(300 m 内无茄科和十字花科作繁种地生产二级种薯 物)的地块 供给商品薯生产 15 DB51/T 818—2008 16 DB51/T 818—2008 17