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蛋白纯化步骤.doc

蛋白纯化步骤

陈小小小小华
2017-09-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白纯化步骤doc》,可适用于自然科学领域

蛋白纯化步骤纤溶(溶栓)酶的分离及其性质研究血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病近年来发病率逐年增加已成为常见病和多发病是造成死亡和病残的首要原因。纤溶酶对纤维蛋白(原)具有专一水解活性纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构纤维蛋白多聚体从而达到溶解血栓栓子的目的因此药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。对“理想”溶栓药物的要求是:快速溶栓对纤维蛋白特异只作用于血栓而全身反应低效力持久出血危险性低无全身性副反应无抗原性避免全身性纤溶、价廉等。目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。近几年寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取微生物更是纤溶酶的一种重要来源如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。从作用机理上纤溶酶分成两类:一类是纤溶酶原激活剂能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白(原)另一类是纤溶酶类活性物质直接可以降解纤维蛋白(原)都具有溶解血栓的作用(见下图)。纤溶酶原激活剂血栓的溶解过程纤溶酶原纤溶酶纤维蛋白原或纤维蛋白纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP)(血栓栓子)(血栓溶解)发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物是提高纤溶酶的选择性溶栓效果延长半衰期减少用药剂量和变态反应降低成本的重要手段。制药工程研究室已从土壤中筛选出多株纤溶酶产生菌上学期的毕业生对其中株菌进行了鉴定并提取了外泌蛋白检测后其中()()()()()()()()()()()(菌号(硫酸铵沉淀浓度))具有纤溶活性。本学期主要工作有:纤溶酶活性测定:琼脂糖纤维蛋白平板法蛋白含量测定:考马斯亮蓝法比活力测定分离和纯化:离子交换层析DEAESepharose或CMSepharoseSDSPAGE电泳:硝酸银染色和考马斯亮蓝G染色,检测分子量大小和分离效果。活性电泳:检测活性带位置等电聚焦电泳:分离纤溶蛋白、测定等电点转膜、测序性质鉴定:包括Km值测定激酶活性最适作用温度和温度对活性的影响最适作用pH和pH对活性的影响金属螯合剂、酶抑制剂、蛋白变性剂、蛋白酶对活性影响体外对小鼠血凝块的溶解作用分离和纯化:DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析(或CMSepharoseFastFlow阳离子交换层析)试剂TrisHCl平衡液的配制:用超纯水配置molL的Tris然后用HCl调pH至(或)记为molLTrisHCl。NaCl洗脱液的配制:用配好的molL的TrisHCl液当溶剂配制不同浓度的NaCl溶液即为含molL的平衡液的NaCl溶液。DEAESepharoseFastFlow阴离子交换树脂的处理:()先用molLNaOHmL浸泡min倒掉NaOH加超纯水每半小时轻轻搅拌一次每小时换水一次洗至中性为止。()再用molLHClmL浸泡min倒掉HCl同前方法洗至中性。()最后用molLNaOHmL浸泡min倒掉NaOH加超纯水每半小时轻轻搅拌一次每小时换水一次洗至中性加molL的TrisHCl平衡液浸泡。装柱:先在层析柱中装入cm超纯水打开柱下边的出水口让水自然流下以赶走柱下部的气泡待柱中的水留有一部分时用塑料吸管将树脂和水的混合物绕柱内壁缓缓加入柱中使树脂达柱长的。柱上部留一部分水不能使柱子干裂。注意加入树脂时不要产生气泡或出现断层柱面一定要平以防止样品不均匀的下降。平衡柱子用molL的平衡液平衡柱子打开紫外检测仪先在A下细调平衡至然后在A下粗调再平衡至。平衡体积大约ml。上样关闭柱下出水口用塑料吸管吸取蛋白溶液ml均匀的加入到树脂中。样品的配制:用molL平衡液溶解粗蛋白配成mgml。rpm离心min。树脂再平衡待样品快要进入树脂时向树脂中加入平衡液待紫外吸收值上升到以上时用灭菌的三角瓶收集此峰即为未结合到树脂上的蛋白。直至平衡至A为不在变化大约ml。洗脱平衡好树脂后先用molL的含molL平衡液的NaCl洗脱打开记录仪紫外吸收值上升到以上时收集洗脱峰并在瓶上做好标记。待紫外吸收值在一段时间内不再下降时换molL的含molL平衡液的NaCl洗脱。重复上述步骤依次用molL、molL、molLNaCl洗脱。待蛋白完全洗脱后用平衡液再平衡树脂以备下次使用。洗脱的蛋白装透析袋透析(h)然后冻干。检测活性跑SDSPAGE电泳检测纯度。SDSPAGE电泳试剂胶:丙烯酰胺(Acr)g甲叉双丙烯酰胺(Bis)g水定容至mL。PHbuffer:Trisg,NHclmL水定容至mL。PHbuffer:Trisg,NHclmL水定容至mL。APS:过硫酸铵g水定容至mL。SDS:SDSg,水定容至mL。电泳液:TrisgGlygSDSg水定容至mL。染色液:gG溶于甲醇中过滤加冰乙酸mL水定容至mL。脱色液:甲醇mL乙酸mL水定容至mL。还原样品液:PHbuffermL甘油mLSDSmL巯基乙醇uL少量溴酚蓝定容至mL。非还原样品液:PHbuffermL甘油mLSDSmL少量溴酚蓝定容至mL。胶的配置所用试剂分离胶浓缩胶单位mL胶PHbufferPHbuffermLmL水SDSuLTEMDuLAPSuL操作步骤灌胶按照上面分离胶的浓度像玻璃槽中现灌入分离胶大约灌mL然后用水压平待分离胶凝固后倒掉水然后灌入浓缩胶迅速把梳子插入浓缩胶中凝固后迅速拔下梳子用吸水纸吸掉胶孔里的水。样品处理在加样之前把样品蛋白水煮min然后加入还原样品液(如果还原样品液是倍则两者比例为比)在rpm下离心min用进样器把上述蛋白注入胶孔内用煮过的蛋白maker注入一个胶孔内作对比。机上样品加入顺序和胶版正反面。接电源插上电源先用v等样品跑过分离胶后改用v。后处理电泳跑完后用考马斯亮蓝G染色min脱色液脱色摇晃过夜观察出现的条带。活性电泳试剂胶:丙烯酰胺(Acr)g甲叉双丙烯酰胺(Bis)g水定容至mL。PHbuffer:Trisg,NHclmL水定容至mL。PHbuffer:Trisg,NHclmL水定容至mL。APS:过硫酸铵g水定容至mL。SDS:SDSg,水定容至mL。电泳液:TrisgGlyg水定容至mL。染色液:gG溶于甲醇中过滤加冰乙酸mL水定容至mL。脱色液:甲醇mL乙酸mL水定容至mL。天然样品液:PHbuffermL甘油mL少量溴酚蓝水定容至mL。凝血酶:mgmL,PBS配制。纤维蛋白原:mgmLPHbuffer配制。胶的配置所用试剂分离胶浓缩胶单位mL胶PHbufferPHbuffermLSDSmLuL凝血酶纤维蛋白原TEMDuLAPSuL步骤FibrinPAGE参照KimSH等方法在制备分离胶时加入十二烷基硫酸钠(SDS)使其终浓度为加入用pH的TrisHCl缓冲液配制的mgmL的纤维蛋白原使其终浓度为mgmL加入适量凝血酶以催化纤维蛋白原形成纤维蛋白进行SDSPAGE电泳。电泳结束后将凝胶置于TritonX溶液中浸泡h而后放入PBS(pH)溶液中浸泡于保温h用考马斯亮蓝G染色min脱色液脱色观察透明带是否出现以及出现的位置。转膜步骤:按常规条件进行SDS,PAGE对于分子量大于KD的蛋白质可采用Tris,苷氨酸缓冲系统而Tris,Tricine系统既可用于低分子量蛋白也可用于高分子量蛋白。a)配制CAPS电印迹缓冲液。方法如下:×CAPS(mmolL)CAPSg加去离子水至ml用molLNaOH(约ml)将pH值调至然后定容至L贮存于ºC。b)CAPS电印迹缓冲液(含,甲醇的×CAPS)×CAPSml甲醇ml去离子水mlc)CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是,一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。d)取出PVDF膜用甲醇浸泡数秒钟然后放入CAPS电印迹缓冲液中。(注:以后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干须重复本步骤的操作。e)取出电泳凝胶在CAPS缓冲液中浸泡分钟。(注:转移某些强碱性蛋白pI>时可省略本步骤。)f)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好并放入小型电转槽中在V恒压条件下(mA)于室温下进行电印迹转移转移时间为小时。(注:务必小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。上述转移条件适用于BioRad小型电转槽和分子量不太大的蛋白。在不同的实验中应根据具体的电转移装置和具体蛋白适当调整电转移条件。例如对kD以上的蛋白质须延长转移时间。g)取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗用甲醇浸泡数秒钟然后进行染色。h)考马斯亮蓝染色可将,考马斯亮蓝R溶于,甲醇,乙酸染色秒(切勿超过分钟)用,甲醇脱色(注意勤换脱色液)并用去离子水充分洗涤然后即可剪下待测序的条带。

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