大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征

大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及电流特征 大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征 [字体:大 中 小] 【摘要】 目的 研究 大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基 因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。 方法 利用脂质体介 导大鼠HCN4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体，转染HEK293细胞进行扩增，用 逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测HCN4 mRNA表达，采用全细胞膜片钳技术 记录HEK293细胞上HCN4电流。结果 大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞， 记录到一系列超极化内向离子流，该电流呈电压、时间依赖性，没有明显的失 活，在-150 mV时电流幅值为(540?24.1)pA，电流密度为(9.6?0.7)pA/pF(n ,12)，半激活电压(V1/2)为(-105.7?12.0)mV，稳态激活曲线斜率(k)为- 15.7mV，HCN4电流翻转电位为(-84.0?7.9)mV。结论 应用 脂质体转染方法成 功进行了起搏通道HCN4基因的异源性表达。 【关键词】 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道;异源性表达;膜片钳;大鼠 Abstract: Objective To explore the current characteristics and expression of HCN4 myocytes in rat ventricular myocytes into HEK293. Methods The HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pTracer-CMV-GFP to form the transfer vector.The mRNA expression was detected by reverse transcriptase-PCR method after bEing transfected into the HEK293 cell using Lipofactamine2000 reagent for amplification，then to use whole cell patch clamp recording the current.Results An inward current was recorded in response to hyperpolarization activaton in transfected HEK293 cell The mHCN4 channel began to activate in voltage and time dependent manner without deactivation threshold voltage and potential of half-maximal activation(V1/2)was -70mV,(-105.7?12.0)mV ,respectively. Conclusion HCN4 gene is successfly heterologously expressed by the method of Lipofactamine transfected. Key words: hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated cation channel;heterologously expressed;patch clamp recordings;rat 心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。作为组织自 动除极最主要电流之一，起搏电流(pace maker current，If)无论在自律细胞 的起搏,1,，还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If 通道的基因家族在鼠和人类已经被克隆,2-3,，分别是HCN1,HCN4，超极化 激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基 础，起博电流表现为广泛的区域电压依赖性，心脏主要表达HCN2和HCN4,4,， 在窦房结的HCN含量最高，HCN4是绝对优势的亚型，占总HCN mRNA的80%以上。 HEK293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5)DNA的永生化细胞，贴 壁生长，能转运多数核苷酸翻译后的成熟蛋白。本实验应用含目的基因HCN4和 携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的质粒表达载体pTracer-CMV-GFP进行共转染 ,5,，通过瞬时表达进行检测，结合膜片钳技术记录转染细胞后的mHCN4通道 电流的特征。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和主要试剂 携带大鼠心室肌起搏通道亚型mHCN4/pTracer-CMV质粒由美国西弗吉尼亚大学的Han-Gang Yu博士惠赠;脂质体转染试剂采用LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;高糖DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;QuickprepTMMicro mRNA purification试剂盒购自pharmacia公司。 1.1.2 主要仪器 膜片钳放大器:Axopatch 700B Axon Instruments，USA;数模转换器:Digi Data 1320 Axon Instruments，USA;垂直微电极拉制仪:Model PP-830(NARISHIGE，日本);荧光显微镜(Olympus，日本)。 1.1.3 溶液的配制 电流记录的电极外液(mmol/L):MgCl2 5.0，KCl 130，Na2ATP4 5.0，EGTA 11.0，HEPES 10.0，Glucose 5.6，pH值用KOH调至7.2;记录电流的电极内液 CaCl2 1.8，MgCl2 0.5，NaH2PO4 成分(mmol/L):KCl 5.4;NaCl 143， 0.25;HEPES 5.0;葡萄糖5.6;pH用NaOH调至7.3。 1.2 方法 1.2.1 mHCN4基因瞬时转染HEK293细胞 细胞培养用高糖DMEM培养基，含10%胎牛血清，100IU/mL青霉素，和100μ,/mL链霉素，种植在直径35mm培养皿，置于温度37?、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，细胞长满后用0.25%胰蛋白酶消化3,5min，制备成单细胞悬液，以每瓶1×105/mL接种传代。转染前一天取HEK293细胞(0.5,2)×105个接种于500μL无抗生素的培养液中达80%,90%时作瞬时转染。将(4,8)×105细胞重悬接种于500μL无抗生素的培养液中，待细胞平铺皿底。溶液?将质粒DNA 4μ,用50μL无抗生素和血清的培养液稀释混匀。溶液?将10μL LipofectamineTM2000用50μL无抗生素和血清的培养液稀释混匀5min。将溶液?和溶液?混合，在室温下孵育20min。加到已用无血清培养基冲洗过的待转染HEK293细胞皿中，置于培养箱。6h后，培养皿中加入等体积的含有胎牛血清的培养基，继续培养24,96h后，取出载玻片，在含4%福尔马林的PBS中固定30min。在荧光显微镜观察结果，另外以未转染mHCN4的细胞作为对照。取5个不同视野分别计数表达绿色荧光蛋白的细胞核总细胞数， 计算 转染效率。转染效率(%)=荧光显微镜下细胞数/总细胞数×100%。 取材新鲜瞬时转染后的细胞速冻于液氮中保存备用，参照 QuickprepTMMicromRNA purification说明书提取mRNA后，进行cDNA的合成， 并且进行HCN4的cDNA文库的鉴定，用目的基因HCN4特异的蛋白基因引物作PCR，鉴定文库。正义引物:5-gAggACAACACggAgATCATCC-3;反义引物:5-TTgATggACACCCAgCAgT-3。扩增条件为:预变性94?，3min;变性94?，45s;退火56?，45s;72?，1min，72?，10min延伸，总共35个循环。 1.2.2 全细胞膜片钳记录 将含有贴壁HEK293细胞置于倒置显微镜工作台，选择与周围细胞无明显接触、边缘整齐的细胞，在22,24?下进行实验。膜片钳放大器与计算机连接，刺激信号及电压输入信号的采集均由软件控制。玻璃毛坯经微电极拉制仪拉制成电阻为2.5,3.5MΩ的电极。调节三维操纵器进行封接，使封接电阻达1GΩ以上，吸破细胞膜形成全细胞记录模式。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(pA/pF)表示。信号经截止频率为1kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样频率为5kHz。 1.2.3 电流记录的参数设置 HCN4电流的记录:保持电位-40mV，施予3000ms，-150mV的去极化脉冲，可引出超极化激活的HCN4内向电流。HCN4电流-电压(I-V)曲线，保持电位-40mV，施予3000ms，阶跃10mV，-120,-50mV系列脉冲刺激，将各电压下的电 V曲线刺流和尾电流密度对相应刺激电位作图。HCN4电流稳态激活过程:按I-激模式，获得各电压下电流，换算为电导，以各去极化电位下电导与最大电导的相对值对脉冲电压作图，得If的激活曲线。依Bolzmann方程I/Imax=1/{1+exp,-(Vm-V1/2)/k,}求出半稳态激活电压(V1/2)和稳态激活曲线斜率(k)。 1.2.4 统计学方法 实验数据测定采用pCLamp9.2软件进行，数据 分析 和图像处理采用SPSS 13.0和Sigma Plot软件，实验计量数据以x?s表示。 2 结果 2.1 目的基因HCN4瞬时转染HEK293细胞后的荧光检测 倒置显微镜下观察培养细胞的形态:接种4h后开始贴壁，呈分散生长的金字塔形和菱形，培养2,3d可见明显分裂增殖的细胞，形成形态均一的细胞增殖集落(图1，见封2)。荧光鉴定HCN4蛋白的表达:瞬时转染mHCN4后6,8h，荧光显微观察可见转染细胞的细胞核和胞浆区均有GFP的表达，以细胞核内的表达更加明显，24,48h阳性细胞明显增多，强度增强(图2，见封2)。荧光结果证实转染细胞的同时表达HCN4蛋白，以细胞膜的表达为主，核周区也有表达。未转染mHCN4的细胞没有GFP和HCN4的表达。检测的转染效率达到90%以上。 , 1 , 2 , 下一页 2, 欢迎浏览更多首页 ? 医学 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 ? 临床医学论文文章 [字体:大 中 小] 2.2 RT-PCR检测结果 携带mHCN4基因转染HEK293细胞，采用RT-PCR 方法 ，扩增出HCN4片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳 分析 观察到与预期大小一致的DNA片段。如图3可见851bp的阳性扩增条带，而未转染的HEK293细胞没有条带。 2.3 HEK293细胞上表达HCN4电流的幅值和密度 在-150 mV时HCN4的电流幅值约为(540?24.1)pA，依照细胞的膜电容换算成电流密度为(9.6?0.7)pA/pF(n,12)，加入2mmol/LCsCl后电流几乎完全被阻断。对照组未转染的HEK293细胞在同样的刺激程序下未引出内向电流。见图4。 2.4 HEK293细胞上表达HCN4电流的电流-时间与I-V曲线特征 全细胞膜片钳可记录到超级化激活内向电流及较小的正向尾电流，激活速度缓慢，没有明显失活(图5)。HCN4电流-电压(I-V)曲线可以看出，电流约在-70mV即被激活，之后随着超极化电压的增加，电流幅值也随之增加，至-150mV达最大值，但随着超极化电压的增加未发现有电流的饱和现象(图6)。 2.5 HEK293细胞表达HCN4电流的稳态激活特征 在HEK293细胞上，依Bolzmann方程求出HCN4半激活电压(V1/2)为(-105.7?12.0)mV，稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV，HCN4电流的翻转电位为(-84.0?7.9)mV，见图7。 3 讨论 HEK293细胞被用于 研究 起搏通道亚型HCN4的异源性表达系统,6,。膜片钳实验表明，瞬时转染细胞中记录到的HCN4通道电流是If，其机理如下:(1)保持电位为-40mV，从-50mV逐渐超极化至-150mV，以步长10 mV递减，记录到超极化激活的内向电流，测试电压越负，电流幅值越大;(2)HCN4电流激活阈值为-70mV，至-150mV达最大值，随超极化电压增加未发现有电流饱和现象;(3)当电极外液加入2mmol/L CsCl可明显阻断超极化激活的电流;(4)其内向电流的电生理特征，包括稳态激活曲线形态、半最大激活电位等与 文献 报道的结果相似,7,，证明质粒载体能够有效的将大鼠HCN4通道基因转染到靶细胞。通过RT-PCR技术得到以起搏通道mHCN4为主的基因表达。 本实验发现转染效率与脂质体和质粒DNA纯度的比例有关，细胞培养条件在70,,80,时转染效果好，此阶段细胞处于最佳状态，增殖速度到了对数生长 期，细胞活力好，能有效表达目的基因，转染成功率高,8,。膜片钳实验时， 选取清洁，透光性清晰有丝状伪足、具有典型细胞形态的单个细胞进行封接效 率高，两个成簇有活力的细胞也适用于记录电流，三个以上成簇聚集的细胞存 在转染过度的可能，记录到电流幅值差异较大，造成实验数据的偏倚,9,。 在后天获得性疾病中，研究报道第一个HCN基因突变是患有窦房结心动过缓和 房颤病人携带的基因型中测到HCN4的四聚体结构改变，包括羧基末端的CNBD 区域，这一发现导致了降低表达If转录水平的 治疗 策略,10,。在老龄高血 压大鼠相关研究显示If表达增多，心室起搏电流值比正常鼠高5倍，与HCN4 有选择性的表达上调相一致，用血管紧张素?受体拮抗剂氯沙坦治疗会显著地 降低If电流的最大电导。HCN4的功能不仅调控静息电位，还 影响 胞膜电阻 抗。对慢性老年房颤实验表明:起搏电流贯穿心脏发育，If表达呈增加趋势。 胚胎传导系统发育前，心肌细胞已经开始产生它们自身的起搏活性。研究发现 在大鼠心脏的发育过程中，心肌组织已经有If表达，与心肌自律性发育相对应 ,11-12,，心脏传导系统发育后，工作的心肌细胞失去了起搏特性，窦房结统 领心脏搏动控制变时效应。If电流戏剧性的在心肌细胞下调其表达，限制了心 肌近一步成熟 发展 ，同时限制了传导系统的成熟。因此早期筛选候选基因， 在后天获得性心脏疾病的治疗中提供更多的选择。 【 参考 文献】 1,María Fernández-Velasco，Nora Goren，Gemma Benito.Regional , distribution of hyperpolarization-activated current(If)and hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel mRNA expression in ventricular cells from control and hypertrophied rat hearts,J,.Physiol，2003，553(2):395-405. ,2,Ishii TM，Takano M，Xie LH.Molecular characterization of the hyperpolarization-activated cation channel in rabbit heart sinoatrial node,J,. 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