山东沿海海域红藻多样性的鉴定

山东沿海海域红藻多样性的鉴定 堂堂型丝查兰竺壅兰竺丝丝茎 山东沿海海域红藻多样性的鉴定 学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 完成日期:垃丛:塑 指导教师签字 答辩委员会成员签字 棼擎一青岛科技大学研究生学位论文 山东沿海海域红藻多样性的鉴定 摘要 红藻门植物是一类古老而又特殊的藻类,其化石发现于志留纪和泥盘纪的地 层中。其种类繁多,~泛分布于世界各大洋的沿岸和淡水环境中。红藻中含有丰 富的碳水化台物、微量元素以及生物活性物质等营养成分,在食用性和药用性等 方面体现了巨大的应用潜力和极高的经济价值。红藻的分类与鉴定是红藻研究的 基础,对红藻种质资源的调查与鉴定可以为红藻的开发利用提供可靠的信息和依 据,因此红藻的分类鉴定一直是藻类学家研究的重要课题。 红藻的分类的研究最早可以追溯到半个世纪前, 等曾根据红藻生殖方 式和形态特征,并辅助超微结构观察和红藻生活史,对其进行传统分类学研 究, 最终将红藻纲分个亚纲,初步确:口了红藻的分类系统,为红藻的形态分类学研 宄奠定基础。本研究对山东主要沿海城市青岛、威海和烟台近海海域的潮司带 红藻进行采样调查,共采得株红藻样本。为了获得更确切的鉴定结果,先以 传统的形态分类学为基础,对红藻样本形态特征进行对比分析,初步鉴定所采藻 两条条形码 样的多样性;再结合分子生物学分类方法.扩增和 从分子水平上进行鉴定.并就其系统发育关系作进‘一步分析。 研究结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:从形态学角度分析,山东沿海海域采得的红藻样本,在 色泽、大小、形态、叶片形状与厚度等外观上均有一定差异,表现出很好的物种 多样性。对山东海域采得的株红藻样本的基凶片段扩增分析,株 藻样分别属于个属,此外还表现出很好的属内种间多样性。采用邻接法 ,最大简约法、最大似然法和非加权组平均法完成 和 系统树的构建,在两种标记中均得到相似的拓扑结构,在以后的研 究中可选取其中两株进行分析。有些藻样形态特征明显,可以用传统形态学 方法就能够快速鉴定。有些红藻样本从其形态特征上分析不能得到确切的结论, 借助分子生物学方法协助鉴别得到了醍好的研宄结果。在采用的红藻样本 中, 有的藻体从其形态特征上分析,与扩增某个序列片段鉴定结果差异很大, 若想得到红藻物种清晰明确的鉴定结果,还需借助其他鉴定手段对有争议的 物种 进一步鉴别研究。属内种间的关系也在文中有所探讨,如蜈蚣藻属山东沿海 海域红藻多样性的鉴定 和拟伊藻属斥均存在很好的属内种问多样性。 基冈遗传多样性 关键字:山东海域红藻形态学吐基冈青岛科技大学研究生学位论文 . . , .. .. .. . 九 ., . .. . ., , ,,,’ ; 山东沿海海域红藻多样性的鉴定、’.. : ,.. ‘,’ . ,.? ..,,. 、’ . . , . .. , 。 : :;青岛科技人学研究生学何论文 目 录 弓言第一章文献综述 .红藻门植物的背景资料. . 藻类植物的概况?.. ..红藻的牛物学特性及牛活史??. . 红藻的经济价值?.. .遗传多样性??.. .遗传多样性的概念及表现形式?. ..遗传多样性的研究方法?. ..遗传多样性的研究目的及意义?. 红藻传统分类学的研究概况?.. .红藻分子,物学的研究.. .. 分子牛物学在藻类分类的地位?.. .. 条形码的提出. .几种常见的条形码? .系统发育树的构建??.. .本文研究的目的皮意义.. 山尔沿海海域红藻多样性的鉴定 第二章红藻的形态特征分析? .实验材料‘方法. ..材料来源?.. .试剂与仪器.. ..红藻样水的形态学观察?.. .本章小结.. 第三章利用和基因分析样本的多样性 实验材料与实验仪器?. .材料来源?.. .试剂配制?.. ..所需仪器?.. .实验方法. ..基因组的提取 .. 和? 序列扩增弓检测. 克隆及测序?.. ..序列比对和系统发育树的构建?.. .结果与分析.. 基因组提取结果?. . 扩增结果. ,.基因序列分析 . 叫攮因序列分析??.. ..形态学’分子牛物学研究结果比较 本章小结 结论? 参考文献致谢? 攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录. 独创性声明” 关于论文使用授权的说明??青岛科技大学研究生学位论文 引 言 山东沿海海域,位于中国东部,北邻渤海海峡与辽东半岛相望,东临黄海 与朝鲜半岛相对,东南临靠宽阔的黄海、遥望东海及日本南部列岛“。山东海 岸线全长约公里,占中国大陆海岸线总长的/,居全国第二位,仅次于广 东省。山东海域属季风气候暖温带区.有丰富的海洋生物资源.尤其是海藻。山 东海域定生的海藻大约有一百多种,其中经济价值较高、产量大的海藻有余 。该海域 种。主要有浒苔、石花菜、石莼、礁膜、海萝、紫菜、海带、江蓠等 分布的海藻种类主要是属于暖温带、冷温带的物种,但也具有一定的亚热带性, 红藻门海藻属于亚热带种类分布非常广泛。 红藻是藻类植物所以门类中,比较有代表性的门之一,简称 为红藻 。红藻门大部分是多细胞体的,少数是单细胞体。红藻门只还 红藻纲一纲,约有个属,多种】。红藻纲通常又被分成两个亚纲,分别 为真红藻纲和紫菜亚纲。红藻门绝大多数存在于海洋中,少数生活在淡水环境: 世界各地均有分布,包括极地地区也存在部分红藻。在我国,经鉴定分析,已知 的红藻有属,包括三百多个种,分布于中国各沿海海域”。红藻的不同种间 形态学差异较大.并且红藻藻体的钙质结构较难处理,研究红藻的解剖学特症便 有一定的难度.因此长期以来,对红藻系统的研究并不是十分明确。目前.对于 山东海域分布的红藻分类学研究仅仅停留于目录水平,只是在有限数篇有关海藻 资源调查的文献中,涉及到几种红藻的名称,并没有对其具体形态、地理分布和 内部构造等特征做出较全面详细地描述,尤其是对红藻的生殖器官的特征及构造 等.没有做深层的描述与分析。 本研究借助于传统分类方法,依据藻体的外部形态特征,主要包括:颜色与 色泽、藻体大小、形态、叶片形状与厚度等特征,先对红藻的形态特点进行 基因序列片段作为分子标记,对红藻样本 了初步比对研究,再利用和 从分子水平上进行鉴定,并就其系统发育关系作进一步分析。日的在于对山东沿 海海域红藻的归属分类及地理分布等多样性问题作较深入的调查研究,为更深层 次地探讨山东海域红藻的系统发育关系和红藻经济种的开发与利用等研究方法 提供理论参考。山东沿海海域红藻多样性的鉴定 第一章文献综述 .红藻门植物的背景资料 ..藻类植物的概况 我国约有万平方公里的邻海海域,属于世界上海域面积最辽阔的国家 之一.就中国整个海域的范围分布而言,东西横穿约个经度,南北跨度约 个纬度,海岸线总长度达多公里.其中包括岛屿海岸线总长达多公 里,大陆海岸线总长达多公里。在中国连绵伸延的海岸线上,南至北部湾 的西沙群岛、北仑河口和南沙群岛,北至黄海的鸭绿江口、渤海的辽河等辽阔的 海域中都广泛分布着各种海藻 ,大约生长着多达三干到四千种的海藻,其中包 括大型底栖藻类植物,如红藻、绿藻、褐藻等,也包括大量的小型浮游藻类植物. 如金藻、蓝藻、甲藻、硅藻等。由于中国有较大海岸线纬度跨度,因此在我国底 栖海藻大多数属于热带、亚热带和暖温带海藻种类,但也包括少数的冷温带藻属 和极少数的北极海洋植物种类”。 藻类植物是一类含有光合色素即叶绿体,能够通过光合作用合成自身需 要的有机物,较依赖水环境生长,无胚、无维管束的叶状体植物。藻类植物种类 繁多,不同藻类植物的生存环境差异较大,根据藻类的生存适应能力,在世界备 处均有分布。大多数藻类植物生活于海洋环境,少数生存于淡水中。在零下几十 度的南北极或终年积雪的高山上也有能找到藻类的踪迹,有些蓝藻能生存于温度 高达。的温泉中。有些藻类植物生活于潮湿的草丛、树皮、土壤、岩石等环 境中。生活在水中的藻类植物.有的浮游于水中,如浒苔、水绵:有的固着于水 中岩石或附着于其他植物体上,如海带、石花菜。有些海藻可生活在深达西米的 海底,也有些藻类能漂浮在海面生活。还有极少数藻类能与真菌共生.形成共生 复合体,如地衣等。 藻类植物体形态各异,各藻体的体积大小有很大的悬殊:最大的多细胞藻体 长达几十米,其结构较为复杂:而最小的单细胞藻体直径仅有几微米,需借助显 微镜才能清晰观察,结构也比较简单;还有藻类植物其藻体是由许多单细胞个体 群集而成组成。许多藻体尽管在形态、体积等外观上,有类似于高等植物的 根、 茎、叶,在功能上也可以进行光合作用产生营养、释放氧气:但它们并不具备高 等植物那样的内部构造和功能,因而不是真正的根、茎、叶的分化,通常只能称 之为假根、叶状体或原叶体等。 藻类在植物界属于低等植物,又称为孢子植物,裂殖植物等名称十。现在藻 一一重曼型丝奎兰堕壅竺兰堕丝兰 类学家根据藻类细胞内所含色素种类、细胞核的构造和细胞的成分,不同的贮藏 物、以及植物体的形态构造、繁殖方式、鞭毛的有无、着生位置和类型、细胞壁 成分及生活史等方面的差异,一般将藻类分为八个门:红藻门、绿藻门、 金藻 门、裸藻门、蓝藻门、褐藻门、轮藻门、黄藻门、硅藻门甲藻门。其中,本研究 中的红藻门是藻类中一个重要的门类。 藻类植物在地球上属于最重要的初级生产者,据研究,藻类合成的有机碳总 量约为高等植物的七倍”。在藻类植物中,大多含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、 盐类以及维生素类等营养成分,在人类的工农业生产生活中扮演重要的角色。例 如,近年来发生的水华、赤潮等现象均与藻类植物有关。因此,对藻类植物进 行 深入研究具有重要的意义。 ..红藻的生物学特性及生活史 红藻门种类繁多,广泛分布于世界各大洋的沿岸和淡水环境中【?。红藻 的生长环境主要是在海洋特别是沿海海域,常见于热带和亚热带海岸附近。 红藻的藻体体积一般较小,长约十厘米左右,少数红藻长度可超过一米。藻体 形状有的成简单的丝状体,有的形成假薄壁组织的枝状体或叶状体。 假薄壁组织的红藻中,分为单轴和多轴两种类型。单轴型的藻体中央 仅有一条主轴丝,向各个方向分出多个小分枝作为侧枝,侧枝之间相互密 贴成~皮层”。而多轴型的藻类,其中央有若干条中轴丝组成的髓,由髓向各 个方向发出许多侧枝,侧枝之间相互密贴。形成“皮层”。红藻在生长过程中, 大多是从一个半球形的顶端细胞分裂而来.少数红藻为居间生长,也有很 少藻株是弥散式生长,任何部位的细胞都可参与分裂生长,如紫菜藻体。 绝大多数红藻为多细胞体,体态颜色一般为紫红色或褐色.也有些藻体呈 褐色或绿色的。少数红藻为单细胞体。也有极少数红藻为多个个体群集生 长。根据红藻的‘状体形状可分为丝状、羽状、分枝状和片状等。红藻各 细胞之间均由纤细的原生质丝相连接。藻体中通常含有叶绿素、叶绿素、 胡萝素和叶黄素,以及大量的藻蓝蛋白和藻红蛋白等,常因藻体中各类 色素的含量差异,使藻体出现不同的颜色,如鲜亮红或粉红色,紫色、紫 红色或暗紫红色等。 藻类植物的生殖器官有两种,大多数藻类的生殖器官为单细胞.也有少数藻 类是多细胞的,但因缺少一层包围的营养细胞,所以所有细胞都可直接参与生殖 作用,形成孢子或配子,极少数红藻种类在外围形成胞层。藻类植物的生殖方式 可分为营养生殖、无性生殖和有性生殖三种。营养生殖,是指单细胞藻类植物以山东沿海海域红藻多样性的鉴定 细胞分裂方式产生新的个体,或者多细胞藻类植物其藻体断裂,长成的新个体。 无性生殖方式,即成熟的藻类个体生成孢子囊,由孢子囊产生的孢子可生长成新 的个体。有性生殖,是指藻体形成配子囊,由孢子囊产牛配子,藻体以同配、 异配或卵配等方式形成合子,最终由合子直接发育为新个体。在藻类的有性生 殖方式中,生殖细胞是不能够运动的。藻类的雌性器官称为果苞,是由单 核区和受精丝组成。有性生殖方式的藻体.其不动精子是在精子囊中产生 的单生?。我国沿海地区的红藻生殖季节与地理位置密切相关,这主要受沿 海地区的气候及水温等环境条件影响.在山东海域沿岸,红藻的生殖季节 一般在月份和月份“?”。 ..红藻的经济价值 我国海域面积辽阔,海藻植物也是我国的重要海洋资源。红藻是海藻植物的 一个重要组成部分,藻体中含有非常丰富的营养成分。如红藻中富含藻胶、甘露 醇、海藻酸等碳水化合物:钾、钙、硒、碘等微量元素:还含有类胡萝、素、蛋 白质和食物纤维素等营养物质,此外还含有许多特殊的活性成分。在食品应用方 面,有些常见的红藻像紫菜、石花菜、海萝等均 可以直接食用:有些角叉菜属红藻可作为明胶的替代品用于布丁、牙 膏、冰淇淋及保藏食品的生产有些红藻的提取物可用于生产食品添加剂、海洋 药物、功能食品、食品包装材料、动物饲料等。红藻的应用价值不仅仅体现在食 用方面.还在生态保护、微生物培养基、生物活性物质开发、有机肥料、化妆品、 化工业以及生物能源等诸多领域日益发挥重要的作用,体现出了红藻极高的应用 潜力和巨大的经济价值””。在药用方面.部分红藻中可提取出抗真菌、细茼与病 毒的活性物质,可作为某些生物药品的有效活性成分。例如,鹧鸪菜 和海人草的提取物常用作驱虫药的有效成分。在微生物培养基生产 方面.从麒麟菜属栅.蓠属.红..藻藻体中提取出的琼 可用于制备的琼脂,是细菌和真菌固态和半固态培养基的重要成分。此外,红藻 中的珊瑚藻属在形成珊瑚礁与珊瑚岛的过程中起重要作用。攀于红藻 门具有很高的经济价值和开发前景,近年来国内外均有许多关于红藻栽培技 术方 面的研究和报导?”。 .遗传多样性 ..遗传多样性的概念及表现形式 生物多样性是指生物本身与环境形成的生态复合体以及与此相关的锌青岛 科技大学研宄生学位论文 种生态过程的总和。生物多样性包括数以百万计的微生物、植物、动物所 拥有的所有基刚以及它们与生存环境之间长期形成的复杂的生态系统。生 物多样性包含了遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性 四个层次【“】。其中,遗传多样性也称为基因多样性,是生物多样性的核心 环节,在生物多样性中占用很的重要地位。遗传多样性是指在自然界中, 在同一种群内不同物种个体之间在分子水平上的差异性.表现出来的是生 物体形状在遗传上的干差万别 。 广义上.遗传多样性是指地球上所有生物携带的所有的遗传信息总和: 狭义上来讲.物种的遗传多样性主要是指不同种群之间的种内或者同一种 群内的不同个体的遗传变异,我们通常所说的多样性是从狭义上定义的遗 传多样性】。 遗传变异性的高低是遗传多样性最直接的表达形式?】。在自然界中, 由于每个个体的生命期是有限的,各个物种个体都有其特定的分布格局, 种群或者种群系统宗、种、亚种才能作为基本的进化单位,因此遗传多样 性不仅包括遗传变异程度的高低,还要包括遗传变异的分布格局,也就是 种群的遗传结构。 种群遗传结构上的差异性也是遗传多样性的一种重要体现,每一个物 种抵御不良环境的能力和物种进化潜力都取决于种内自身的遗传变异大 小,也依赖于遗传变异的种群结构?。 ..遗传多样性的研究方法 遗传多样性可以从物种的个体、细胞以及分子等不同水平上进行研究。 从个体水平来看,可表现在物种的形态发育、生理代谢以及行为习性等众 多方面的差异性。在细胞水平上,能明确地显示遗传多样性的各种细胞学 特征,如细胞结构与功能的多样性以及染色体结构的多样性等方面,通过 比较不同物种中细胞之间的差异性来反映其内在的遗传多样性。从分子水 平上讲,遗传多样性可表现为核酸、蛋白质等生物大分子的差异性。 在遗传信息的表达过程中,是遗传信息的携带者,蛋白质是遗传 信息的执行者,所以用他们的分子标记能直接体现遗传信息的改变,可以 说是目前最具说服力的分析手段。蛋白质多态性一般通过两种途径分析, 一是氨基酸小序列分析,二是同工酶或等位酶电泳分析。水平的遗传 多样性表现为核苷酸序列的任何差异。遗传多样性是一个综合和复杂的指 标,其最直接的表达形式就是遗传变异的分布格局,即种群的遗传结构?。山 东沿海海域红藻多样性的鉴定 ..遗传多样性的研究目的及意义 研究物种的遗传多样性具有非常重要的理论意义和实践价值。物种遗 传多样性水平的高低,直接涉及到物种遗传基础的宽窄,进而决定了物种 对环境条件波动的适应能力。若遗传水平较低,则遗传基础就窄,进而对 环境变化的适应力也差。从这个角度上,可以说物种的遗传多样性在某种 程度上体现了对周围环境的适应能力,也制约了物种的进化水平.为资源 现状的评估提供了非常重要的信息。 对遗传多样性的研究可提供物种的多种信息,如揭示物种或种群的遗传 结构,生活环境和生存条件.分析物种的进化历史和变异潜力,可用于探 讨濒临绝迹物种的减少原因和现状,进而提出合理有效的保护手段及措旋 【?。首先,物种或种群的遗传多样性是物种长期进化以及周围环境变化的 产物,是物种适应和进化的基础和前提。因而对物种遗传多样性的研究, 可以用于揭示物种或种群的进化史,也能为进一步分析物种进化潜力提供 重要理论基础和分析资料,尤其对稀有物种的濒危原因及过程的探讨提供 信息帮助【?。其次,遗传多样性是物种保护生物学研究的核心内容之一, 遗传多样性在某种程度上决定了物种的地理分布以及种类和数量的多样 性。只有在对物种遗传多样性进行深入了解的基础上.才能有针对性的对 物种进行有效的保护。此外,遗传多样性的研究信息,是生物学各分支学 科的重要背景资料。遗传多样性的研究结论.可以为遗传育种作和种质 资源管理提供科学的理论基础和研究依据。 随着人类加剧对自然资源的利用程度,致使物种灭绝速度的加快. 是最严重后果之一。基于此,对生物多样性的研究,物种保护和及自然资 源的可持续利用,已然成为全球瞩目且急需解决的重大问题【】。 .红藻传统分类学的研究概况 红藻的分类与鉴定是红藻研究的基础,对红藻种质资源的调查与鉴定 可以为红藻的开发利用提供可靠的信息和依据。传统的藻类分类学原理是 基于形态特征的相似程度即“物以类聚”,是一个基于实物标本的“比 较”过程。主要依据外部形态、内部构造和生理特征,尤其是生殖器官的差 异,将红藻鉴别开来。红藻传统分类学的研究最早可以追溯到半个世纪前, 年,等根据红藻生殖方式和形态特征对其进行分类研究.并辅助 超微结构观察和红藻生活史分析进一步对红藻的系统发育关系研宄验证, 最终将红藻纲个亚纲,初步确立了红藻的分类系统,为红藻分类学研究 ..重些型塾奎兰堕壅圭堂垡堡奎 奠定了基础,他的这项研究对红藻的分类而言具有划时代的意义。据此, 我国将红藻门分成个纲 个目,其;原红藻纲包含个目,红藻纲包含 个目 直至在世纪年代,红藻的分类研宄主要是处于传统的形态 学分类和对红藻组织解剖分析的研究水平上,如年,对海膜科 红藻的不同种雌性生殖器官解剖分析并做了详细研究,提出将该科的所有 种依据其助细胞瓶状体的形态分为五种类型的建议。 传统的形态分类学方法存在?定局限性。首先,对于亲缘关系相近的 藻类之问在藻类形态、生理特征等指标表现的差异很小,且很难制定一套清 晰的区分不同物种形态特征的界限:另外,藻类因其简单的形态学和解剖 学,经多代遗传后,表型的变异可塑性与环境因子的相互作用,而且这种 变异不只在属间被发现,在单个种内也同样存在。在不同地点的个体间及 在同一地点不同季节的个体问可观察到大量的变异。生长在不同环境下的 藻体在形态、色泽以及大小等方面表现出明显的不同,在自然状态下的与 实验室培养条件下的形态也会存在差异【?。因此,传统形态学分类学者需 要向世界各地的标本馆借阅更多的标本,借助显微镜等工具对其仔细观察 分析,才能获得更确切的鉴定结果。可见,对于部分难以鉴定的生物类群, 这个过程往往需要花费大量的时间和金钱。这样极大增加了红藻的鉴定难 度。 因此,为快速揭示藻类的生物多样性,现在海藻分类学家越来越多地 依赖分子生物学工具解决藻类的物种归属问题【?。 .红藻分子生物学的研究 .. 分子生物学在藻类分类的地位 自年代后期以来,随着双螺旋模型的提出和技术的发明, 分子鉴定技术得到了快速的发展和广泛的应用。对红藻的分类及多样性 分析,进入了分子生物学分类的研究阶段。红藻的分子生物学分类方法. 是通过红藻核营酸序列的分析比较研究红藻多样性和红藻分类的学科。分子 生物学研究的目的主要是从核苷酸序列中尽量找出物种间的差异。对高级分 类单 位如门纲目科的分子生物学分类问题,和序列都可以很好的用于解 决。但对于小的分类水平来说,如属.种及亚种,序列要比序列更有 优势。由于序列是纯粹的 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,其序列中含有编码区和非编码区的全部核 转录区域并不会出现在 苷酸。而序列是转录的产物,即 中九,因而,序列提供的信息量要比的信息量丰富得多。其次,核 ..山东沿海海域红藻多样性的鉴定 苷酸可组成不同类型的单元,如单拷贝区和重复基因区,非基因重复序列及 转录 单元等,每一个单元都有其特殊的进化速度和进化方式。因而,通过相同区域的 序列片段比较可在矸同的分类水平上找到所需要的信息。 采用序列片段对红藻进行分类.被认为是最有效的遗传分析方法。对 藻类序列片段进行比对是在分了水平上的研究,这相对于根据表现 型来推断基因型的分类方法具有很明显的优势.如个体水平、细胞水平、蛋白质 水平等均在推断基因型时可能产生遗传多态性等问题。此外,分子水平与 其他不同水平上的遗传标记相比还具有以下优越性【”:分析结果直接以 序列的形式表现,不会受到环境和其他外因的影响;物种的表现型为中性,不会 影响目标性状的表达:在物种发育的不同阶段,其不同组织的提取后都可 用于分子生物学分析。与传统形态学分类方法相比,分子生物学检测手段更加简 单、迅速且获取的结果较客观。 综上所述,使用分子生物学对鉴定藻类多样性有以下优点:首先,突 破了对传统形态特征的过度依赖,利用有机体的残片即可进行快速有效的 鉴定:其次,不受实验室、实验者差异的限制,对经验的没有过度依赖, 获取的同一个基因片段的生物学信息便可得到相同的结论,研究结果较客 观;再次,数据比对不受地区限制,由于它采用数字化形式,使样品鉴定 过程能够实现标准化,鉴定结果可以使用网上数据库进行比对。 .. 条形码的提出 年,一条形码之父“一一 提出了条形码 技术。条形码技术是利用统一标准的、有足够变异的、易扩增 且相对较短的片段.在物种种内的特异性和种问的多样性可进行物种身份 自动识别的生物系统,可用于对物科,进行快速的自动鉴定【?。自条形码的概 念提出以来,根据条形码的标准进行开发和应用【”,明确的提出了条 形码选择的标准:选取的序列片段要尽量短,两端要连接相对保守的区域 可以利用通用引物进行扩增操作:条形码的核苷酸基因片段要有足够多 的变异位点,便于将不同物种区分开来【 :用作条形码的基因片段,要 具有该生物独有的核苷酸序列特征,即该生物的个性:且要包含该生物所属类群 共有的核苷酸序列,要有该类群生物的共性。 因此.在传统形态学分类的基础上,寻找在各种生物中普遍存在的且具有该 物种代表性的片段并应用于生物分类便是当前的分子生物学的研究热点之 一。根据条形码选择的标准,选取两条或以上合适的序列片段,并用青岛科技大学研宄生学位论文 不同的条形码技术来区分属、种及亚种问的遗传差异,成了为当前红藻分类 学研究的主要方向例。 近年来,条形码被视为进展最迅速的学科前沿之一。在红藻的分子生 物学研宄中.借助分子生物学工具对红藻的分析鉴定得到了突飞猛进的发展。主 要采用叶绿体基因组 ,、线粒体基因组 ,核基冈组,的基因序歹】。 .. 几种常用的条形码 目前用二红藻分类鉴定々条形码,并统一。较常用的条形码有叶 绿体基因组中的,二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因‘】;线粒体基因组中 基因吐编码核糖体的基因 的细胞色素氧化酶亚基 .等‘”。 及转录间隔区/ 基因序列 叶绿体基因组约占植物总的%~%“。研究表明,任何 种植物之间其叶绿体基因组至少有%的同源性,并且同源性越高,在分类 群中亲缘关系越近删。 对叶绿体基因组中的保守区域,如反向重复序列区的研究,可应用于 大类群植物的系统进化分析。由于其序列结构特征而出现突变热点的非编码 区,可广 泛用于藻类物种的分类。 叶绿体基因组中的,.二磷酸核酮糖羧化酶大亚基,‘基因.其进化速 率比较适于研究高等级类元间的系统关系”,目前常用于远缘属问及科级上 分类 群的研究【。,?基因总长约. ,以单拷贝形式存在,能提供较多的分子 ’”。该基因序列进化速率比 性状,是叶绿体中相对保守的基因片段【 较适于研究高等级类元间的系统关系,因而在植物分子系统学研究中受到广 泛重视。研究表明,使用,,基因片段鉴定藻类多样性有以下优点叫。首 先,突破了对传统形态特征的过度依赖,利用有机体的残片即可进行快速 有效的鉴定:其次,不受实验室、实验者差异的限制,对经验的没有过度 依赖,获取的同一个基因片段的生物学信息便可得到相同的结论;再次, 数据比对受地区限制,由于它采用数字化形式,使样品鉴定过程能够实 现标准化【 ”,鉴定结果可以使用网上数据库进行比对。年, 等人利用基因的编码产物,一二磷酸核酮糖羧化酶的表达程 度作为浮游植物增殖的指标,对赤潮的发生进行早期预报。年,刘永山东沿海 海域红藻多样性的鉴定 健等通过扩增胶州湾表层海水浮游植物基因片段,建立了该基因片段 变异类型文库,并初步分析了胶州湾表层海水浮游植物,基因分子遗传 多样性【。年,杨立恩通过,?基因对产于中国的红毛菜科植物,进 行系统分类学及生物地理学【】。年,李强等人获取的来自世界各大洲 串珠藻目植物种的,?基因序列。结合其形态和生物地理特征,构建 了该目的系统发育关系【】。 基因序列 线粒体基因组大小约×~× ,:同种群之间差异 很大。重排率较高且突变率低并具有遗传渗漏的特点””,在植物 基因组中线粒体组的拷贝数低,很难提取与纯化,所以在植物分类学 上的应用不够广泛。在现阶段的研究中,主要利用的高重排率,采用 限制性片段长度多态性等研究方法分析物种变异,为植物的系统研 究、分类及鉴定工作提供依据【”。此外,线粒体基因组中的细胞色素氧化 酶基因,常用于物种分子鉴定与分类的研宄中。如年,等人利用线 粒体编码的细胞色素氧化酶第一亚基基因对种硅藻进行了系统进 化研宄”】,分析了硅藻之间的系统关系.证明了 基因也可适用于藻类 的分类鉴定.如年,等人利用细胞色素氧化酶皿基和细 胞色素氧化酶弧基、基因片段对不同地理株系的红藻进行 了分类研究,对同属不同种和不同亚种的个体进行了区分,且获得了理想的 研究结果【删。除用于藻类的分子鉴定外.,基因片段在后生动物物种的 鉴定分类工作中应用也很广泛?。如叭年.王仁诚等人利用 序列片 段对胶州湾浮游动物物种组成进行分析.成功鉴定了生活于胶州湾的日本 蝠、太平洋牡蛎等动物的浮游幼体并构建环境样品的 序列文库,便于 海区浮游动物的物种丰度以及群落组成情况的快速鉴定与评估。 核糖体基因序列 核糖体基因在植物基因组中通常存在不同长度和频率的重复序列,这也 是染色体的主要特征。真核生物基因组中,用于编码核糖体的基因包 和. 括 , 种。它们在染色体上头尾相连、串 联排列,相互之间由转录间隔区分隔。转录间隔区是位于核糖体大小亚基基 因之间的核苷酸序列【?。其中,位于 的’端和. 的’ 端之间的序列称作核糖体转录间隔区 , ,位于. 的’端与 的’端之间的基因序列称为核 一?青岛科技大学研究生学位论文 的’ 糖体内转录间隔区 ,。 端与 的’端之间的片段称为核糖体转录问隔区 ,。核糖体基因及间隔区有着不同的进化程度.有的序列比较 保守进化较慢,有的可变序列进化较快【“】。因而,可以根据各个基因序列的 遗传特点.将藻类分类鉴定到属、种、亚种以至变种的水平通过核糖体基因 序列分析方法广泛用于藻类分子的鉴定与分类。年.陈月琴等人通过 分析核糖体序列的差异.区分有毒和无毒的藻种;年.蔡青松 等人利用核糖体 列设计种特异性探针对常见赤潮微藻进行定性定量 基因序列成功鉴别两种 分析五。年,胡自民等人运用核糖体 形态特征和生活环境境极为相似的红藻【”。 相对于编码核糖体的基因而言,核糖体大、小亚基基因序列之间的转录 【”,隔区即区,具有相对较快的进化速率,因此主要用于为遗传高变区 域,可以为藻类较低分类等级的种间或近缘属间等系统发育研究提供更多 的信息,是用于属内种间水平研究很好的条形码指标【””】。因此,转 录间隔区在藻类的分析鉴定工作中的应用也很普遍】。早在年, 等人就以核糖体基因区作为条形码,对口本海域. 『 .,肠/.“不同地理株进行研究分析,得知日本海域 属的不同种之间基因序列有着显著的差异,而种内个体间的区序列则 差异不大【】。年,陈月琴等人对我国南海海域的.和 .口,?”不同地理株的区进行研究分析,确定这两个藻属种间的界 定标准,并为设计.和. ?的专一性核酸分子探针提供了 可靠的理论依据和研究基础”】。年,苟万里等人应用基因序列对容 易产生毒素的裸甲藻属进行初步研究,为有毒赤潮预警监测提供了重要的 理论依据。年,粱成伟等运用基因序列作为条形码,对青岛 海域绿潮爆发后的石莼属藻类进行多样性分析,通过区域多序列比对结 果鉴定得出青岛海域石莼藻属存在很好的种间多样性【”。 .系统发育树的构建 日前,用于生物系统发育树的构建方法主要有:邻接法 , , 、最大简约法 .、最大似然法 . 非加权组平均法 ? 。 邻接法是年由和提出,也是目前常用的距离算法之一。. 山东沿海海域红藻 多样性的鉴定 邻接法是根据两两序列的遗传距离构建生物进化树的拓扑结构。该算法是根 据距 离矩阵构建进化树的过程,它在每一步尽量使得当前村的所有分支长度之和 最 小,每个阶段序列在聚合的过程中都遵从最小进化距离,因而通常被认为是最小 进化法的一种简化【?。但通常不会检测到所有可能的拓扑结构,因而其 分析程序相对简单.分析过程耗时少,可以快速分析较多的数据。但是法在 序列较短时很容易出现较大的误差,此外.因无法全面顾及每个位点而会遗漏一 些遗传信息.而且法估算出来的枝长在物种的进化意义上不予考虑”。 最大简约法遵循奥卡姆哲学原里,即所需假设数目最少的那 一个便认为是解释一个过程最好的理论。世纪年代,提出将最大简约法 用于核苷酸序列的分析.若实验获得的序列之间问差异较小则属于近缘序 列,若序列较长但核苷酸替换率较稳定的情况下,则找出碱基替代数日最少的拓 扑结构,从而得到比较真实的系统发育树【”。该方法的核心 思想 教师资格思想品德鉴定表下载浅论红楼梦的主题思想员工思想动态调查问卷论语教育思想学生思想教育讲话稿 是对任一个给 定的拓扑结构,推断出其中每个位点的祖先状态并计算出该拓扑结构在整个系统 进化过程中所需的最小替代数。最后挑选出所有所需拓扑结构的最小替代数进行 分析,构建出最优系统进化树。但最大简约法在运算过程中有时会出现长枝的类 群聚到一起的现象,即长枝吸引,一般由取样的序列进化速率异常或者异源同型 导致四。 最大似然法是一种统计方法,它是用于求一个样本集的相关信息 出现的密度概率函数。这个方法早在 年至年间,遗传学家和统计 学家罗纳德?费雪爵士开始使用的。世纪年代末,提出将最 大似然法应用于序列运算。对于一组序列,其最大似然值越高则构建 的系统进化树就越接近于真实的进化树【。因而,基于最大似然法构建的 进化树算法的基本思想是先求出每一个可能进化树的最大似然值,然后从 中找出其中似然值最高的进化村作为最终结果。研究表明,如果研究的分类 群数目较大.或者研究的序列较长,用最大似然法的分析结果优于其它运算方 法【”。从运算理论上讲,最大似然法在分子系统学研究中优于最大简约法法和 邻接法,但是如果研究的分类群较多数据量较大,最大似然法的算法过于费时, 运算起来较慢,限制了其应用博”。 非加权组平均法也是分了生物学研究中较常用的聚类分析方 法,常用于解决物种的分类问题。非加权组平均法在算法上比较简单,研 究物种序列聚类时,首先将距离最小的个序列聚在一起,并形成一个新 的,其分支点位于个间距离的中心处;然后计算出新的 与其它间的平均距离,找出其中的最小个进行聚类;如此反青岛科技大学研宄生学位论文 当 复,直到所有的都聚到一起,最终得到一个完整的系统发生村。 用来重建系统发生树时,其假定的前提条件是:在进化过程中,每一研究 序列发生趋异的次数均相同,即氨基酸或核苷酸的替换速率是均等且恒定 的。通过非加权组平均法法所构建的系统发生树是物种系统进化的简单体 现,在每一次趋异发生后,从共祖节点到个问的分支长度相同。因 此,这种方法也常用于物种发育树的重建。无论是哪一种统计算法法,对 分支格局进行置信度的检验都是构建系统树的关键。 .本研究的目的及意义 本研究采集了山东主要沿海城市海域的红藻。先用传统的形态分类学方 法对样本进行初步分析研究。对藻体的颜色、形态、叶片形状等外观进行 观察分析.详细描述各藻样的形态特点,初步对藻样进行形态学分类。以 形态学分类方法为基础,寻求合适的分子生物学方法对样本深入研究。本 研究中,主要采用目前国际上海藻分类学研究中逐渐成熟的分子系统学分 等基因的碱基 类技术,提取红藻样本的,扩增出红藻的,?和 序列,通过序列比对和系统进化树的构建.进一步对红藻样本的归属和分 类问题进行探讨。 通过传统的形态分类学和分子生物学分类方法进行对比研宄,对山东 的烟台、青岛、威海等近海海域的红藻.特别是有疑问种进行了详细的研 究.探明红藻属的进化关系和分类地位,解决分类学上有争议的红藻分类 问题.对建立更加妥当更加科学的分类系统等研究.具有非常重要的意义。 同时.完善和丰富分子系统学的研究方法,为东海域藻的养殖、种质保 存、可持续开发和利用提供理论依据,为世界各海域红藻的系统分类研究 提供参考。同时,为探索我国海藻的分类以及分子系统学研究提供重要的 理论依据。山东沿海海域红藻多样性的鉴定 第二章红藻的形态特征分析 .实验材料与方法 ..材料来源 本实验中的材料于年月中旬,采自山东主要沿海城市青岛、烟台、 威海海域沿岸见图.。 采集红藻样 时要注意样%的均匀性和代表性,取样点尽量散开,样 品尽可能多样化。将采集到的样品分别放在一次性封口中,并加入少许海 水,在封口袋上标注好采集日期及采集点。本研究中,所采集的红藻样本 共株,其中青岛藻样 株,威海样本株,烟台藻样株。红藻样本 编号及采集日期『见表一。 渤 ,’黄 ’’海 海: 。轧 图样本采集地点 一?青岛科技大学研究生学位论文 ..试剂与仪器 海水、纯化水、吸水纸、刀片、镊子、纯白托盘、透明玻盘、 数码相机。 .红藻样本的形态学观察 将采集的样品带回实验室做最初处理:挑选出藻体比较干净,藻株较 完整的样本,藻株较大可用刀片切出其完整分枝。先用镊子小心夹取样本 茎部,放在带回的海水中清洗?遍,用吸水纸吸去多余水分,放在干净吸 水纸上,晾十分钟后,再用镊予夹取藻株放在纯化水清洗三遍以上,放在 干净的纯白托盘上。用镊子将样本摆好角度,以便于观察为准,然后用 数码相机进行拍照 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 。注意红藻样本编号的记录。 对数码相机拍摄的样品图片进行处理。将样品照片按照相同采集地导入 到软件进行整理.使每个城市海域采得的红藻样本做成一张图片, 方便红藻的形态学研究。并对红藻样品跟踪编号。 .结果与分析 本研究中所采用的红藻样本在色泽、大小、形态、叶片形状与厚度等 外观上均有~定差异,见图?。有些样本间差别并不明显,分析时可将其 归为一类:有些样本与其它藻样形态差别较大,则单独分析并记录其形态 特征。观察株红藻样本形态特征,对烟台、威海、青岛红藻样本进行分 类分析。 烟台红藻样本?,藻体呈红褐色,藻样根部有固着体,可粘附在固 定物上萌发,向周围扩散生长,形成具有假薄壁组织的枝状体,没有其它形态 较 为相似的样本。一样本呈浅红色,有明显分枝,每个分枝上叶片细长 且密集,藻叶呈簇状生长。。呈浅红褐色,藻体为树枝状.枝权末端山东沿海海 域红藻多样性的鉴定 带有小触角,形态相似的样本还有.、一、一,但一 颜色差别较大,呈灰褐色。一藻株颜色较暗.呈棕褐色,形态似干枯 。一样本呈红褐色,藻 树枝,形态相似的样本还有一、 一 体较柔软,固着器呈盘状,主枝不明显,基部缢缩,呈团状生长,.、 .与其形态颇为相似,但一藻体颜色较浅。一呈灰褐色, 有明显分枝.枝权末端带有小触角,叶片较圆, 一、一与其形 态相似。一藻株呈红褐色,有固着体.粘附在固定物上萌发,成簇生 长.叶片为双层透明膜状。 威海红藻样本.一呈褐色,有明显根部可附于固定物上生长,没有明显 主枝,从假根部萌生出多个分技.分枝呈扁平回羽状,基部缢缩。一样本呈 红褐色.从整体卜观察藻株.呈松树状,主枝明显,订许多分枝.叶片为 披针形,相似藻样有一。一颜色呈灰褐色,藻体呈扁平大叶』‘ 状,有明显主枝,分枝较多,枝权末端较尖没有小触角。一颜色鲜亮, 藻体柔软,有固着体,粘附在固定物上萌发,形成具有分枝的丝状体,末 端有触角。一呈深红色,色泽较亮,藻体呈扁平叶片状,大叶片又裂 成许多小叶片,一与其形态颇为相似。 青岛红藻样本分析:一藻体呈灰褐色,有明显分枝,叶片细长, 末端没有触角。一呈鲜亮红色,主枝较明显.有多个分枝,叶片细短, 没有触角,一与其形态相近,但颜色差距较犬,后者呈红褐色。一 呈红褐色.主枝较明显,叶片较短,没有触角,与其形态相似的藻样还有 一。样本一呈红褐色,没有主枝,从固着器萌生许多分枝,叶 片细短.叶片尖端有小触角。一呈红褐色.有明显主枝,主枝末端有 分权,叶片呈柄状,。片末端有明显触角,一形态与其颇为相似。 一呈红褐色,主枝明显,分枝较多,叶片较厚,末端较尖,呈扁平剑 状.没有触角,一 与其形态接近。一呈褐色,有明显主枝,主 枝末端有分权,每个枝权上叶片呈簇生长。叶片较厚,有的叶片末端有明 显触角,一形态与其相似。两瓣攘: 篁罐 羞警 魅摧宴 ,羹蘩一 媲掣、糕 蠖煞毒东沿海海域红藻多样性的鉴定 懦畿 蘸 删下跫 堂童臻 幽.烟台、威海和青岛红藻样本的形态图片.“一”. 一 ., .. . 为直观描述株红藻样本的形态特征,现将红藻样本以形态形状的差 异性分类分析:有些藻样与其它藻样形态特征明显,与其它样本形态差异 较大,则自成一类单独分析,如.、.、.:有些样本问差别并不明显,分析时可 将其归为一类,如表?。青岛科技大学研宄生学位论文 表红藻样本的形态分析形态相似的藻样 藻株形态特征 .、一 浅红褐色,藻体为树枝状,枝权末端 一、一 带有小触角 深红色.色泽较亮.藻体呈扁平叶片 .、一 状大叶片又裂成许多小叶片 .、一 红褐色,藻株呈松树状,主枝明显, 有许多分技,叶片为披针‘形 一、一、 红褐色,藻体较柔软,固着器呈盘状, 主枝不明显,基部缢缩,呈团状生长 灰褐色,有明显分枝,枝权末端带有 一、、一 小触角.叶片较圆 鲜亮红色,主枝较明显,有多个分枝, 、一 叶片细短,没有触角 红褐色,主枝较明显,末端有分杈. 一、一 叶片较短,没有触角 红褐色.有明显主枝,主枝末端有分 一 、 权.叶片呈柄状,末端有明显触角 红褐色,主枝明显,分枝较多,叶片 一、一 较厚.末端较尖呈扁平剑状 、一 褐色。有明显主枝,末端有分权,叶 一 片较厚呈簇生长,末端有明显触角 藻株颜色较暗,呈棕褐色,形态似干 一、一 、一 枯树枝,叶片为披针形 .本章小结 从形态学角度分析,山东烟台、威海及青岛等沿海海域采得的红藻样 本,有很好的多样性。本研究中酶红藻样本颜色大多呈红褐色,少数颜色 较鲜亮.也有些藻体颜色较暗甚至呈灰褐色。但有些藻类,即使描述起来山东 沿海海域红藻多样性的鉴定 都是红褐色,成色上也存在差异,如.和一。前者颜色偏暗, 后者颜色较亮。红藻样本形态各异,许多藻体问形态差别较大,有的样本 有主枝和分枝,有的藻样有固着器成簇生长,没有明显分枝。红藻叶片多 数为细长状,少数呈扁平树叶状:部分红藻叶片末端有触角,有的红藻末 端较尖没有触角。还有些藻类,部分叶片尖端有触角,另一部分没有触角. 如,;也有些红藻,整体看有主枝有分枝.而只看一部分就是呈簇状 或团状生长,如.。实验表明.很多红藻在形态上并没有很清晰的表 现,用语言描述起来也并不能表达得客观精准.且观察者之间也会存有误 差。因此.若想只通过形态观察对红藻样本进行明确分类,是比较嗣难的。.?? 堕些型丝.:兰堕垄?兰堂堡茎 第三章利用和基因分析样本的多样性 .实验材料与实验仪器 ..材料来源 本实验中的材料于年月中旬.采自山东青岛、烟台、威海等沿 海海域.共采得红藻样本株.编号及采集日期见表。 ..试齐配带 载体和宿主菌 一 购自大连宝生物公司:宿主菌为大肠杆菌,为本 载体 实验室保存。 实验用酶及生物产品 ,平衡酚,均采购于北京索莱科技 口聚合酶,. 有限公司。 新型植物基因组提取试剂盒离心柱型、琼脂糖凝胶回收试剂 盒.购白天根生物科技有限公司。 培养基的配制 液体培养基: 组份浓度:%/蛋白胨、.%/酵母提取物、%/ 配审量: 配制方法:.称取蛋白胨、酵母提取物、于烧杯中: .,定容至: .加入去离子水 充分搅拌溶解,调 .高温高压灭菌后,保存。 固体培养基: 组份中包括.%琼脂糖,其他同液体培养基配制。 注:如果配制抗生素选择培养基.则在高温高压灭菌后冷却至约?。, 一’.奎塑塑塑壁丝翌墨堡丝塑鳖壅 加入相应抗生素至所需浓度,摇匀后保存。 实验溶液及配制 、×电泳缓冲液 ?。,加水至室温保存: ?,.醋酸,. 使用时稀释成×缓冲液。 、琼脂糖凝胶液 倍的,电炉煮沸,拿室 小板胶:称取.琼脂糖到 ,混匀,倒入小板中。 温冷却,待不烫手,加入 倍的,电炉煮沸,拿出室 大板胶:称取.琼脂糖到 ,混匀,倒入小板中。 温冷却,待不烫手,加入肛 、液 .纯水混匀,一。保存 、高盐 ?、 / / 、 / 电泳试剂 、×宝生物工程大连有限公司 溶于 , 称取. 的甘油 的去离子水中,加热搅拌使之充分溶解,加入 后,是用调节值至.。用去离子水定容至后,室温保存。 、标准分子量标记 宝生物工程大连有限公司 宝生物工程大连有限公司 、. /溴化乙锭 称取溴化乙锭至棕色试剂瓶中加入双蒸水,配制成/ 的储液,?保存备用。使用时吸取溴化乙锭加入双蒸水中配成./的 ‘ 工作液。 、调节用试剂 .,,一立些型茎丕兰塑壅兰兰丝堡兰 /:称取,加搅拌溶解,定容至。 /:取原液,稀释倍即可。 ..所需仪器 本实验用到的主要仪器与设备见表?。 表..主要仪器与设备.实验方法 ..基凶组的提取 全基凶组提取试剂盒提取法 将采集的藻类用无菌水清洗遍,用吸水纸吸干,在液氮冷冻条件下将样品 研磨成粉末状,使用天根植物全基因组提取试剂盒提取全基因组 。 一?山东沿海海域红凛多样性的鉴定 具体提取步骤如下: ?预热缓冲液的 .取磨好的粉末约,迅速转移到预先装有 离心管中,迅速颠倒混匀后,将离心管放在?水浴分钟,水浴过程中 颠倒离心管以混合样品数次。 .加入氯仿,充分混匀,离心分钟。 .,、心的将上一步所得的上层水相转入一个新的离心管中,加入缓冲液 ,充分混匀。 .将昏晕的液体转入吸附柱中,离心秒.弃掉废液。吸附 柱容积为左右,可分次加入离心。 .向吸附柱中加入缓冲液使用前加入无水乙醇, 离心秒,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中。 秒,倒掉废液, .向吸附柱中加入漂洗液,离? 将吸附柱放入收集管中。 .向吸附柱 .漂洗液,离心秒,倒掉废液。 分钟,倒掉废液,将吸附柱 .将吸附柱放同收集管中,离? 置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。 .将吸附柱转入一个干净的离心管中.向吸附膜中问位置悬窄滴加 洗脱缓冲液,室温放置分钟,离心分钟.将溶液收集到离 心管中,一?保存备用。 提取法 由于红藻组织细胞内富含类似多糖的粘性物质,有些红藻使用天根植物全基 因组提取试剂盒提取并没有得到较高质量的红藻基因组,为提高红藻的提 取效果,参考文献采用提取法,再次提取红藻的模板。 具体提取步骤如下: .将采集的红藻