免疫荧光 免疫组化 实验技术免疫荧光 免疫组化 实验技术
1甲醛(formaldehyde)
是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37,,40,得甲醛溶液，商品名为福尔马林(formalin)。用作固定的浓度习惯为10,福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)，实际含甲醛4,。
10,福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。 2 乙醇
无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作...
免疫荧光 免疫组化 实验技术
1甲醛(formaldehyde)
是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37,,40,得甲醛溶液，商品名为福尔马林(formalin)。用作固定的浓度习惯为10,福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)，实际含甲醛4,。
10,福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。 2 乙醇
无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液(混合固定液)
甲醛(浓)120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠(NaH2PO4•H2O)4g，磷酸氢二纳(Na2HPO4)13g。此液固定效果比单纯10,福尔马林要好。
4 AF液(混合固定液)
95,乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95,乙醇85ml，甲醛(浓)10ml，冰醋酸5ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95,乙醇脱水。 以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10,福尔马林，乙醇应尽量不用。
IF免疫细胞化学和免疫荧光实验
载玻片/盖玻片处理
聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。
无菌水冲洗盖玻片(3次 ，每次5分钟)。
可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。
在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。 磷酸盐缓冲液( PBS )进行简短的冲洗。
第一步:细胞固定
用预冷的甲醇、丙酮( 1-10分钟)，或3-4 ,甲醛(PBS的pH值7.4)室温(或者-20 ?)固定细胞片15分钟。
用预冷的PBS冲洗细胞片两次。透化:如果目的蛋白是胞内表达，透化细胞非常重要。注:丙酮固定标本不需要透化。
用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。Triton X - 100是目前最流行的通透剂，可提高抗体的渗透程度。但这不适合与膜相连抗原的使用，因为它会将膜破坏。
PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。
第二步:封闭和孵育
PBST孵育细胞(1 ,牛血清白蛋白)，室温30分钟，以封闭抗体非特异性结合位点(封闭液也可以是1 ,明胶或10 ,的血清，此血清需来自二抗产生的物种体内) 。
加入一抗在湿盒内孵育细胞片(在使用含1% BSA PBST稀释抗体的)，室温1
小时或4 ?过夜。
缓慢倒出溶液，PBS清洗细胞片的3次，每次5分钟。
加入含1 ,BSA的二抗稀释液，室温避光孵育1小时(避光)。 缓慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分钟(避光)。
第三步:复染
在0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育细胞1分钟。 PBS清洗。
第四步:封片和观察
滴加一滴封片剂封片剂质，盖上盖玻片。
用指甲油密封盖玻片，以防止干燥和显微镜观察时移动。
观察后的细胞片可避光保存在-20或4?C。
二、免疫荧光方法中的重要环节
1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。
3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。 4、一抗孵育条件:在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度，其中4度效果最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 5、二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。 6、复染:目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。 7、封片:为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 8、切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染。(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式;(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7,8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解)
9、拍照:
多聚赖氨酸防脱片处理:
1、一般，先按照说明书稀释成工作液。
2、清洗干净玻片或盖玻片:先用洗衣粉水浸洗1h左右，然后再用自来熟清洗数次，60度
烤干;浸酸(重铬酸钾100克，溶入100ml水中，缓缓加入硫酸1000ml)过夜，也可用超声波仪中浸洗;自来水冲洗3次，然后用双蒸水漂洗3次，60度烤干;放入95%乙醇浸6—12h，60度烤干;
3、包被:工作液恢复至室温，传统用浸泡法，还不能回收利用，比较浪费，一般100ml大约100张左右;但我现在不稀释原液，改用棉签涂抹法，只涂一面，所以增加了好几倍。 4、60度烤干1h或室温过夜晾干，即可使用。
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