【word】 盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件

【word】 盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件 盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件 第53卷第4期 2007年8月 武汉大学(理学版) J.WuhanUniv.(Nat.Sci.Ed.) Vol|53No.4 Aug.2007,5O3,508 文章编号:1671—8836(2007)04—0503—06 盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件 孙国华,隋正红,张学成 (中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003) 摘要:采用了两种电激模式,高电场强度低电容模式下3,7kV/cm和低电场强度高电容模式下300~500 V/cm转化质粒pBI221一cat;PCR扩增检测cat基因部分序列及组织化学染色法GUS检测也同时证明质粒pBI221一 cat在盐生杜氏藻中瞬时表达.在此基础之上,插入pds基因的正反向重复序列,构建RNAi表达载体pBIRNAI- Dsa,电激 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 转入杜氏盐藻细胞,荧光定量PCR结果表明,转入干涉载体pBIRNAI—Dsa的实验组的pds基因表达 显着下降,最低达对照组的28,表明表达受到抑制. 关键词:盐生杜氏藻;电激转化;RNA干扰;基因表达 中图分类号:Q17;Q78文献标识码:A 0引言 杜氏藻,一种单细胞真核绿藻,绿藻门绿藻纲团 藻目多毛藻科中的一个属(也有单独归为杜氏藻目, 杜氏藻科,杜氏藻属Eli),包含约3O个种,其中最有 代表性和应用最广的是盐生杜氏藻(DunalillaSa— lina),能耐受生活环境中0.05,5.0mol/LNaC1 的盐浓度],是现在世界上抗逆境胁迫的生物之一, 生长于海水及咸水湖,盐湖等高盐环境下.盐生杜氏 藻无细胞壁,仅由一层糖蛋白和神经氨酸组成的外 膜包裹,为天然原生质体,由于极强的耐盐能力,简 单的细胞结构以及便利的培养条件使盐生杜氏藻成 为研究植物适应高盐度的分子 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 的重要模式生 物]. RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsR— NA)始动的序列特异性基因沉默机制,是确定特定 基因功能的有效方法,也是功能基因组的有力工具, 在很多动植物中都有应用[5].在植物中,RNAi现 象可以通过向植物体转入一定构造的表达载体以产 生大量同源于目的基因的自身互补DNA(即发夹 DNA)而获得_7].要在盐生杜氏藻中实现以RNAi 的方法研究功能基因,必须找到有效的方法将外源 质粒转入盐生杜氏藻细胞并得以表达.电激作为一 种介导外源DNA进入细胞的方法,广泛用于植物, 动物,微生物的遗传转化研究,已在悬浮培养细胞, 原生质体,组织,花粉,胚等材料上导入外源基因获 得瞬时或稳定表达_9.探索获得电激转化杜氏盐 藻的条件,能够在盐生杜氏藻中表达的质粒基础之 上构建RNAi表达载体,实现特定目的基因沉默,是 研究盐生杜氏藻基因功能及耐盐机制的有效方法. 本文以Dunaliellasalina为材料,采用电激的 方法将质粒pBI221-cat导入盐生杜氏藻细胞,实现 瞬时表达,并在pBI221一cat基础上构建RNAi表达 载体pBIRNAI—Dsa,在盐生杜氏藻中初步建立以 RNAi的方法研究基因功能. 1材料和方法 1.1材料和仪器 盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)由本实验室分 离纯化并保存.培养基为改良的Johnsons盐生杜氏 藻培养基口,培养条件:光/暗周期为12h/12h,温 度(25?1).C. 实验所用质粒pBI221一cat为本实验室由 pBI221构建而来,含有氯霉素乙酰转移酶(cat)基因 和8一葡糖醛酸酶(gus)基因,两者可同时作为筛选标 记基因. 电脉冲仪(Bio—rad公司生产的GenePulserII 收稿日期:2007—01—09十通讯联系人E—mail:xczhang@OHC.edu.cn 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30471317) 作者简介:孙国华(1979一),女,博士生,现从事藻类分子遗传学研究.Email;sghqingdao@hotmail.corn 504武汉大学(理学版)第53卷 和Controllerplus).电激小杯(Bio—Rad公司生产,公司生产iCycleriQ). 电极距离为0.2cm).荧光实时定量PCR仪(伯乐本实验所用所有引物序列见表1. 表1本实验所用引物序列 NameSequence(5,3r) CAT1 CAT2 RiO1 Ri02 Ri03 Ri04 Rir01 Rir02 DACT1 DACT2 AGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG CTGCCACTCATCGCAGTACTGT TCCCCCGGG(Sinai)TGCACTGAACCGCTTCCTG CGTGTACA(Bspl407J)GGTACC(KpnI)AGAAGTTTGAGATGGGTG T CGTGTACA(Bsp1407DTGCACTGAACCGCTTCCTG CGGGGTACCfKpnI)ACTGTGGATAGCTTGCGGTC_____________ ____.-.._-._??____一 一 GATGTGCTGGGTGGCAAGGTG GGGCAGGGATGTCTGGGAACT CGKGACATVAARGARAAGCT TCCTTGCTCATRCGKTCRGC 1.2电激转化 收集100mL生长于对数期盐藻细胞,4?, 5000r/min,离心5min,悬浮于电激缓冲液(0.08 mol/LKC1,0.005mol/LCaC12,0.01mol/L Hepes,0.2mol/L甘露醇,0.2mol/L山梨醇)中; 重悬浮的溶液中加入质粒(终浓度2Omg/L)和鲑 精DNA(终浓度25mg/L),混匀,冰置10min,取 400L样品加入电激小杯中,将电激小杯置于电激 室,选择合适的电激条件(电场强度,电容)进行电 激;电脉冲结束后,取出电激小杯,冰上放置10 min,然后将电激后的藻细胞转入新鲜培养基中. 1.3半致死电场强度的确定 盐藻虽是单细胞真核藻类,但是没有细胞壁,由 于其特殊的细胞结构,分高电场强度(植物细胞和细 菌)和低电场强度(哺乳动物细胞)两种模式探索其 合适的电激条件.电激后要求细胞的成活率应达到 40,60%[1引,设定宽范围的电场强度范围(表2), 高场强1,10kV/cm,电容25F(模式1);低场强 2001000V/cm,电容500”F(模式2),电激不加 质粒空白样品,电激3次.电激后光学显微镜下统计 细胞数量. 表2电场强度参数的选择 1.4转化前及转化后处理 电激转化原理是细胞在外加电场强度下细胞膜 局部被击穿,形成瞬时孔洞,要保证这种通透性可 逆,不使细胞遭到不可逆的损伤或死亡,探讨转化前 前电激缓冲液冲洗及冰置处理和电激后的暗恢复培 养必要性.前处理方式:收集藻细胞重新悬浮于前电 激缓冲液(0.2mol/L甘露醇,0.2mol/L山梨醇), 冰置,5000r/min,离心5min,沉淀,再重悬电激. 取不做预处理,处理40min和8Omin3组,电激转 化质粒pBI221-cat后分两部分,一部分直接添加氯 霉素(Cm)培养,另一部分暗恢复培养24h后添加 氯霉素,4天后细胞计数. 1.5不同电压电激转化 根据前半致死场强确定范围,选定3,7kV/ cm和350,500V/cm,电激转化质粒pBI221-cat. 收集盐生杜氏藻细胞,重悬于前电激缓冲液,冰置 40min,电激转化后细胞暗恢复培养24h,加入氯霉 素,光/暗12/12h培养.实验设不加质粒平行为空 对照组.每次处理重复3次.电激样品实验组和对照 组恢复培养后每隔两天取样显微镜下观察并计数. 1.6PCR方法检测cat基因 取电激转化后培养藻液0.5mL,4000r/min, 离心30S,蒸馏水冲洗两次,加入DNase工温育30 min以降解可能的细胞外来源的cat基因,提取 DNA.根据cat基因序列设计引物,CAT1和CAT2 (表1).PCR反应条件:94?预变性5min;94.C1 min,55?1min,72.C1min,30个循环;72?延伸 5min,扩增长为597bp的片段.电激后每两天取 样,检测至第16天. 1.7gus表达的检测 电激转化后样品每两天取1mL,离心,根据 Jefferson等的方法[13]作组织化学染色,在倒置荧光 显微镜明视野下观察,检测gus基因表达. 1.8RNAi表达载体的构建 八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)由于其缺失的 可见显性而常被用作植物RNAi研究的靶基因. pB1221一cat载体cat基因之后有Sma工和Bsp14071 第4期孙国华等:盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件的研究 单酶切位点,在两个位点之间插入pds基因的正反 向片段,以表达形成双链发夹RNA.设计带酶切位 点的引物,目标片段采用RT—PCR的方法从杜氏盐 藻cDNA中获得.引物Ri01(含Sma工酶切位点)和 引物Ri02(含Kpn工和Bspl407I酶切位点)扩增 328bp的正向序列加368bp间隔序列;引物Ri03 (含Bspl407I酶切位点)andRi04(含Kpn工酶切 位点)扩增反向序列(引物序列见表1).正义片段与 间隔序列插入质粒pBI221一cat得到中间载体pBIR- NAI—Ds,在已插入正向序列的中间质粒pBIRNAI- Ds的基础上再插入反向片段,最终形成正反向重复 结构的RNAi表达载体pBIRNAI-Dsa(图1). SmaIBspl407I a pds-Sspacerpds— 图1载体pBIRNAI—Dsa构建示意图 cat:氯霉素乙酰转移酶基因;pds-s:pds基因正向片段; pds-a:pds基因反向片段;spacer:间隔序列NOS-ter: NOS终止子;CaMV35S:CaMV35S启动子 1.9pBIRNAI-Dsa转入杜氏盐藻细胞及干扰效果 检测 在前述确定电激条件基础之上,以电压4kV/ cm,电容25F条件将pBIRNAI—Dsa转入杜氏盐 藻细胞,暗恢复培养24h,加入氯霉素,质粒 pBI221一cat为对照.每隔3天收集样品3OmL,直至 16天6组样品,提取RNA,反转录.设计引物 Rir01,Rir02(表1),扩增219bp的部分pds基因序 列,以荧光定量PCR的方法检测pds基因的表达. PCR体系:cDNA2肛L,1O肛L2×SYBRGreenRe— al—timePCRMasterMix(包括MgC12,dNTPs, TaqDNAPolymerase,SYBRGreenI)10L,引物 Rir01/Rir02各1L,ddH2O补足2OL.反应程序 为推荐两步法:95?60S,1循环;95.C15S,60? 60S,40循环.DACT1及DACT2(表1),扩增320 bp的部分actin基因序列为内参.每个样品3个平 行管,采集荧光信号. 2结果 2.1半致死电场强度的确定 不同电场强度对细胞存活率有不同影响,统计 不同电激条件处理一天后细胞数量如图2和图3. 电激场强越大,细胞存活量越少.根据电激后要求有 4O,6O的成活率,确定半致死电场强度,高场强 低电容模式下的电场强度(E)为3,7kV/cm,低 电压高电容模式下的电场强度(E)为300,500 V/cm,以此作为电激转化的初步电场强度范围. 目 . 一 \ 最 图2不同脉冲(高)场强对藻细胞存活的影响 ? 皇 : 恳 0200400600800l0001200 E,/V.cm 图3不同脉冲(低)场强对藻细胞存活的影响 2.2转化前及转化后处理对电激的影响 不同处理后杜氏藻细胞计数结果显示:就电激 前处理而言,未经前处理的细胞存活数量少于经前 电激缓冲液冲洗并冰置40min处理组的细胞存活 数量,而经80rain冰置处理的实验组由于时间过长 而数量较少.同样,暗恢复培养也有利于杜氏藻的电 激转化,未恢复培养的存活细胞数为恢复培养的 7O.由此说明电激前及电激后必要的处理有利于 减少电激的损伤,提高转化效果. 2.3转化后盐生杜氏藻的形态与生长 电激转化后盐生杜氏藻细胞加氯霉素培养后, 血球计数板计数结果.电激后盐生杜氏藻细胞有聚 团,破裂,死亡现象,且随时间增加,细胞死亡数增 多.实验组细胞数量与对照组于第4天起有差异,实 验组活细胞数量大于对照组,未加质粒的对照组第 16天存活很少,2O天后完全死亡,加质粒的实验组 死亡速度明显慢于对照组,t检验各实验组和对照 组数据差异显着(P<0.05).转化实验组盐生杜氏 藻在4,6天期间有一小幅的增长,而对照组细胞数 一 直呈减少趋势.由此初步推断,质粒pBI221-cat 在盐生杜氏藻中表达,因此具有氯霉素抗性,存活细 第4期孙国华等:盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件的研究 5O7 表达的研究口叫引.本文探索了在盐生杜氏藻中电激 转化的条件,将表达载体pBI221一cat导人盐生杜氏 藻细胞,电激后实验组和对照组细胞生长数量的差 别说明盐生杜氏藻获得氯霉素抗性,对cat基因的 PCR扩增检测说明质粒已进入细胞,GUS的组织 染色进一步证实了质粒已在盐生杜氏藻中表达.转 化恢复培养后至16天,氯霉素抗性存在且表达 GUS,16天后检测不到质粒的存在以及GUS组织 染色无蓝色反应,最后藻细胞的全部死亡也说明质 粒在盐生杜氏藻中的存在表达是瞬时的.此外,盐生 杜氏藻在GenePulser?高电场强度/低电容(细菌, 植物细胞)和低电场强度/高电容(哺乳动物细胞)两 种模式下均有合适电压转化范围,效果无明显差异. CaMV35S启动子已成功地应用于小球藻,麒 麟菜,坛紫菜,海带和裙带菜等藻类的遗传转 化_1.在盐生杜氏藻中,李杰等_1利用基因枪法 将外源报告基因EGFP转入盐生杜氏藻,EGFP在 CaMV35S启动下表达出绿色荧光蛋白,表达为瞬 时;耿德贵等_2利用电激的方法比较了几种启动子 转化杜氏藻,其中包括CaMV35S,表达也都为瞬 时,且转化率较低.在我们的实验中,pBI221一cat质 粒中的l3一葡糖苷酸酶基因(gus)和氯霉素乙酰转移 酶基因(cat)都在CaMV35S启动子下表达,表达为 瞬时,与前述研究结果一致;值得强调的是,gus位 于cat之后且被表达,说明CaMV35S启动子的强 启动能力,可以在gus的位置置换插入用于构建 RNAi表达载体的正反向重复序列,实现表达双链 RNA目的. 盐生杜氏藻的特殊的抗盐抗逆功能是研究者关 注的热点,采用合适的方法研究相关基因的功能, RNA干扰(RNAi)无疑是最佳选择之一.构建 RNAi表达载体,在体内表达双链RNA(dsRNA) 以诱导RNA干扰现象致使目的基因沉默,是目前 在植物RNAi研究中普遍采用的方式.瞬时抑制 (transientsuppression),在水稻,白杨等多种生物 中有研究报道l2.本文探索了pBI221一cat质粒在 盐生杜氏藻中转化的电激条件,证实了瞬时表达,在 此基础之上,根据构建双链RNA表达载体原则_2, 构建了载体pBIRNAI—Dsa,以电激的方法转入盐生 杜氏藻细胞,实现pds基因的表达抑制.在盐生杜 氏藻中尚不存在稳定的遗传转化体系,所以只能瞬 时抑制,若建立完善稳定的转化系统,则可以实现特 定目的基因的永久抑制;另一方面可建立可诱导型 表达载体,实现基因表达的可调控抑制. 参考文献: EliEttlH.TaxonomischeBemerkungenZUDenPhyto— monadinaEJ].NovaHedwigia,1983,35:731—736. E2]BrownAD,BorowitzkaLJ.HalotoleranceofDu— naliella[M]//LevandowskyM,HutnerSH.Bio— chemistryandPhysiologyofProtozoa.NewYork:Ac— ademicPress,1979:139—190. 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Electr0p0rati0nTransformationConditionof RNAiApplicationinDunaliellasalina SUNGuohua,SUIZhenghong,ZHANGXuecheng (CollegeofMarineLifeScience,OceanUniversityofChina,Qingdao266003 ,Shandong,China) Abstract:PlasmidpBI211一 catwastransferredintoD.salinaviae1ectroporationandwasprovedtransi, entlyexpressed.VectorpBIRNAI—DsawasconstructedfrompBI211一 catandtransformedintoDunalilla salinainducingpdsgenesilencing.Twomodes,high—voltageandlow—pitc hedof3-7kV/cmandlow—volt- ageandhigh—tensionof300—500V/cm,wereadoptedtotransformcellsand theresultsweredetectedfrom differentaspects.PCRamplificationandGUShistochemistrystainingalsoprovedthatpBI221一cathadbeen deliveredintocellsandexpressedtransiently.Partia1pdssensesequenceanditsreversewereinsertedinto pBI221一 cattoformtheRNAivectorpBIRNAI—Dsa.Pdsgeneexpressingofthetreatedg rouptransformed withpBIRNAI, Dsawasreduced,evento28ofthecontrolgroup,suggestingthatpdsgeneexpressing wasrestrained. Keywords:Dunaliellasalina;e1ectroporation;RNAinterference;geneexpressing