雷公藤多苷致体外幼鼠睾丸生精细胞凋亡的初步研究

雷公藤多苷致体外幼鼠睾丸生精细胞凋亡的初步研究 雷公藤多苷致体外幼鼠睾丸生精细胞凋亡 的初步研究 ?8?黑龙江医药科学2010年8月第33卷第4期 雷公藤多苷致体外幼鼠睾丸生精细胞凋亡的初步研究 刘立新,张羽男,张楠楠,袁寰 (佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯l54007) 摘要:目的:研究雷公藤多苷对幼鼠睾九生精细胞凋亡的影响.方法:将含雷公藤多苷的培养液加入受试细胞中,使药物 终浓度分别为2.59g/L,5pg/L,10~g/L,20~g/L,40,ug/L同时设立不加雷公藤多苷的对照组,共同培养.采用MTT比色法测 定细胞的相对存活率,应用吖啶橙荧光染色法和TUNEL法对细胞的凋亡进行定量和定性测定.结果:MTT比色法结果显示 雷公藤多苷能抑制幼鼠睾九生精细胞的活性,并呈剂量一效应关系,其IC.为23.32士3.26.吖啶橙荧光染色法和TUNEL法 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明雷公藤多苷作用后生精细胞凋亡数量较对照组明显增加.结论:雷公藤多苷能明显地导致幼鼠睾九生精细胞凋亡, 并且浓度越大,细胞凋亡数目越多 关键词:雷公藤多苷;幼鼠;睾丸生精细胞;凋亡 中圈分类号:R285文献标识码:A文章编号:1008一O104(201O)04—0008—02 近年来,雄性动物生殖机能减退现象逐渐受到人们的重 视,出现了诸如性欲减退,精液品质下降,受精能力降低的现 象,人类更是受到了"ED(勃起功能障碍)"的困扰.当然,生 殖功能下降是由多方面原因引起的,但药物是其主要因素之 一 .雷公藤多苷是从植物雷公藤根提取精制而成的一种脂溶 性成分混合物,是目前临床上使用较多的中成药制剂,其临 床应用范围广泛,几乎涉及内科,外科,皮肤科,眼科,儿科等 广泛生命科学领域.但随着雷公藤多苷应用范围的扩大,其 毒副作用也越来越受到人们关注,尤其在生殖毒性方面.动 物实验表明,雷公藤多苷可使雄性大鼠产生可逆性不育,有 关雷公藤多苷生殖损害方面的报道多见集中在体内的研究, 且仅限于成年鼠,而对于体外和有关幼鼠的研究鲜有报道, 本试验以体外培养的幼鼠睾丸生精细胞为研究对象,从细胞 水平探讨雷公藤多苷对幼鼠生殖细胞的毒性,为进一步揭示 雷公藤多苷生殖毒性 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 提供理论依据. 1材料和方法 1.1主要材料 动物:15d龄SD雄性大鼠,购自哈药集团制药总厂实验 动物中心.药品:雷公藤多苷片(江苏美通制药有限公司);四 噻唑蓝(MTT)(Amresco产品);其他化学试剂均为分析纯试 剂. 1.2主要仪器 二氧化碳培养箱(HPP--9162Jg京东联哈尔仪器制造有 限公司);97OcRT荧光分光光度计(上海棱光精密科学仪器 有限公司);318型酶标监测仪(上海科学仪器三厂). 1.3方法 1.3.1幼鼠睾丸生精细胞悬液的制备 参照文献方法n略有改进,取15d雄性幼鼠,颈椎脱臼法 处死.无菌收集两侧睾丸用无菌PBS(O.01M,pH7.3)洗涤, 去包膜,将生精小管剪为约3,4mm小段,加入0.O1MPBS 2mL,吹打成悬液,300目筛网过滤,1000r/rain,离,L,5min,弃 上清液;沉淀物加入2mL0.O1MPBS清洗,吹打均匀后,以 1000r/rain,离心5min,弃上清液;如此重复清洗2次;用2mL 7O冰乙醇将细胞沉淀吹打,制成悬液,备用. 1.3.2M1vr比色法 将分离的细胞接种于96孔培养板,待细胞长满单层后, 弃去培养液,加人含雷公藤多苷的培养液,使雷公藤多苷的 终浓度分别为2.5~g/L,5~g/L,lO~g/L,20ug/L,40vg/L同 时设立不加雷公藤多苷的对照组和无细胞对照组,培养24h 后,每孔加入MTT溶液使其终浓度为0.5mg/mL.37?恒温 孵育4h,吸去上清,每孑L加入200~L酸化异丙醇,震荡10min, 使结晶物充分溶解,取100vL溶液并转移到一个新的96孔培 养板,用酶标仪在570nm波长测定吸光值,记录结果.计算细 胞的存活率,并计算ICs.. 相对细胞存活率c=簧暑委器主}署×.. 1.3.3幼鼠皋丸生精细胞凋亡的检测 1.3.3.1吖啶橙荧光染色法 细胞培养长成单层后,加入含雷公藤多苷的培养液,使 雷公藤多苷的终浓度分别为2.S~g/L,5gg/L,1Ogg/L, 20~g/L,同时设对照组,培养箱中培养24h,按1.3.3方法收集 细胞,调整细胞密度为1×10/mL,取95L细胞悬液加入 5L吖啶橙荧光染色液(1OOgg/mL,pH6.O),混匀后,将细胞 悬液滴加到载玻片上,于荧光显微镜下观察计数,每个样品 计数100个细胞,根据以下公式计算细胞凋亡指数和细胞坏 死指数. 凋亡指数一凋亡细胞数?(正常活细胞数+凋亡细胞数 +坏死细胞数)×100 1.3.3.2TUNEL法 按试剂盒使用说明进行测定. 1.4统计学处理 试验数据采用SPSS及Excel软件进行分析,所有值均 以士s表示 2结果 2.1MTT法检测细胞活性 采用MTT法对不同浓度雷公藤多苷作用的幼鼠生精 细胞进行细胞活性检测,结果见表1和图1.由表1和图l可见, 随着雷公藤多苷浓度的增加,细胞的相对存活率下降,而且 浓度越大细胞的存活率越低,具有一定的剂量一效应关系, 这表明雷公藤多苷对幼鼠生精细胞具有一定的毒性作用,能 抑制细胞的活性,其ICs.为23.32士3.26. 表1雷公藤多苷对鼠皋丸生精细胞活率影响的结果(z土5) 不同浓度组别vg/L细胞相对存活率() 2.5 5 1O 20 40 96.69士2.7l 89.34士3.34 68.72士2.49 56.86士2.68 37.39士3.92 100 一 一 80 讲 蜒 印 嚣 40 异 2O O510152025{C)5{0 雷憾多苷的浓鹿fg几) 图1MTI,法测定雷公藤多苷对幼鼠生精细胞相对存活率的影响 HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,Vo1.33No.4?9. 2.2雷公藤多苷致幼鼠生精细胞凋亡检测 吖啶橙染色法:不同浓度雷公藤多苷作用的幼鼠生精细 胞经吖啶橙染色后,显微镜下观察,正常细胞核呈黄绿色均 匀荧光.凋亡细胞呈黄绿色浓集在核膜内侧,可见凋亡小体. 由表2和图2可以看出,随着雷公藤多苷浓度的增加,凋亡指 数逐渐增大,加雷公藤多苷药物组与对照组比较差异均极显 着(P<0.01). 表2雷公藤多苷对鼠睾丸生精细胞吖啶橙荧光染色的结果(z士) 不同浓度组别s/L——堕壅 图2雷公藤多苷对幼鼠生精细胞凋亡指数的影响 TUNEL法:雷公藤多苷作用的细胞经染色后,显微镜 下观察,凋亡细胞的细胞核中有棕色颗粒,非凋亡细胞用苏 木素复染为蓝紫色核.随着雷公藤多苷浓度的增加,幼鼠生 精细胞凋亡指数逐渐增加,加雷公藤多苷药物组与对照组问 比较差异均极显着(P<0.01),见表2和图2. 项目来源:佳木斯大学科研立项($2009—090) 3讨论 雷公藤多苷是雷公藤根芯的提取物[3],具有广泛的药理 作用,从治疗风湿性疾病到系统性红斑狼疮,银屑病,肾小球 疾病,肿瘤,到应用于甲状腺疾病,妇科疾病,哮喘等疾病,新 近临床上又应用于器官移植如肾移植取得了重大进展[.],但 长期大量应用会对生殖系统产生损害作用,而导致不孕.卢 清显等[5]给大鼠每日喂服雷公藤总苷lOmg/kgl7周,13周和 20mg/kgl4周,1O周,结果发现大鼠精子发生及曲细精管晚 期精子细胞碱性核蛋白的替代和转换均受到明显抑制.张 彬[6等给Wistar雄性大鼠每日灌服雷公藤多苷(10mg/kg)8 周后,睾丸内的精子细胞及精子减少,曲细精管管腔缘出现 病理形态的细胞及多核巨细胞.本试验应用MTT比色法测 定了雷公藤多苷对幼鼠睾丸生精细胞活率的影响,又通过吖 啶橙染色法和TUNEL法测定了雷公藤多苷对幼鼠睾丸生 精细胞凋亡情况的影响,结果表明,随着雷公藤多苷浓度的 增加,细胞活性逐渐降低,细胞凋亡指数逐渐升高,并呈剂量 一 效应关系,揭示了雷公藤多苷对幼鼠睾丸生精细胞具有明 显的毒性作用. 参考文献: [1]杨瑞.刚地弓形虫致小鼠肇丸生精细胞损伤机制的探讨[D].山西 医科大学,2007,9 [231心如.毒理学实验方法与技术rM-[.第4版.北京:人民卫生出版 社,2007,141 [3]周嘉陵,朱琦,杨晓凌,等.雷公藤制剂副作用的临床观察[J].中 国中西医结合杂志,1999,19(2):77-79 [4]黄真,毛庆秋.雷公藤多苷的临床应用,不良反应及预防[-j-[.药品 评价,2005,2(2):125 [5]卢清显,沈晓明,程凯,等.雷公藤总甙对大鼠生精作用及主要脏 器的影响口].国科学院,1990,12(3):203-206 [6]张彬.雷公藤多苷(GTW)抗雄性生育活动的研究[J].中国现代 医学杂志,2002,12(4):16-17 (收稿日期:2010一O1—18) 作者简介:刘立新(1978,)-k-,硕士,讲师.研究方向:药效学与毒理学. Spermatogeniccellapoptosisinjuvenileratcaused bymulti--glycosidesoftriptergiumwilfordii:Apreliminarystudy I.1ULi—in,ZHANGYu—nan,zHANGNan—nan,YUANHnan (CollegeofChemistryandPharmacyofJiamusiUniversity,Jiamusi154007,China) Abstract:Objective:Toinvestigatetheeffectsofthemulti--glycosidesoftriptergiumwilford ii(GTW)on spermatogeniccellapoptosisinjuvenilerat.Methods:Thenutrientsolutionofthemulti— glycosidesof triptergiumwilfordiiwasinjectedintothetestcells.ByusingMTTcolorimetry,thestudywasplannedtoesti— matetherelativesurvivalofthetestcellswiththenutrientsolutionsofthemulti— glycosidesoftriptergiumwil- fordiiatdifferentconcentrations:0/zg/I,2.5~g/L,5Fg/I,10/~g/L,20~g/Land40pg/L.Atthesametime, thequantityandqualityofapoptosisofgermcellswereevaluatedbyacridineorangefluorescentstainingand TUNELassays.Results:Themulti--glycosidesoftriptergiumwilfordiicouldinhibittheactivityofspermato- geniecellsinjuvenilerat.IC50was23.32? 3.26.AcridineorangefluorescentstainingandTUNELassays showedthattherewasasignificantincreaseinthemeanapoptoticinGTWgroupsthanthatofcontrolgroups). Conclusion:Themulti--glycosidesoftriptergiumwilfordiicancausetheapoptosisofspermatogeniccellsinjuve— nileratmarkedly.Thegreatertheconcentrationofthemulti--glycosidesoftriptergiumwilfordii,themorethe apoptoticcells.' Keywords:multi--glycosidesoftriptergiumwilfordii;juvenilerat;spermatogeniccells;apoptosis 隧.. % -? ?-