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[精品]蛋白质分离提纯.doc

[精品]蛋白质分离提纯

杜永福
2017-11-27 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《[精品]蛋白质分离提纯doc》,可适用于综合领域

精品蛋白质分离提纯蛋白质的分离纯化(一)材料、选材、破碎、混合物的分离(二)粗分级(三)细分级(四)结晶蛋白质的分离方法根据蛋白质的溶解度差异分离沉淀技术根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质的荷电差异分离根据蛋白质与某些物质的吸附差异吸附分离利用生物分子专一性结合的特性亲和层析蛋白质的分离方法可逆沉淀:等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀不可逆沉淀:热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀透析只用于除盐类和小分子杂质超过滤除小分子杂质分离、浓缩蛋白质凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质有天然的也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件:惰性水不溶性能高度水化。常用分子筛:葡聚糖凝胶(Sephadex)型号:G、G、G、G、G、G、G分离大蛋白质、小蛋白质除盐琼脂糖凝胶(瑞典Sepharose、美国BioGelA)孔径大用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶(BioGelP)原理:、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来所以大分子物质迁移速度快、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部所以小分子物质迁移速度慢。密度梯度离心电泳法类型:、区带电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括:琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括:垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。、自由界面电泳:支持物为溶液很少用。垂直板电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS(十二烷基磺酸钠)和少量巯基乙醇则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量而与原来所带电荷、分子形状无关。SDS是变性剂它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。导致:、由于SDS是阴离子使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量消除了原来的电荷差异。、改变了蛋白质单体分子的构象不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同长轴长度随其分子量的大小成正比变化。由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质比并具有相似的构象因而有如下公式:lgM=KKμR(K、K为常数μR为相对迁移率)实际测定时以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对其μR作图根据样品的μR值从标准曲线上就可查出其分子量。、等电聚焦(Isoelectricfocusing)()以不同蛋白质的等电点的差异分离。()凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。()载体两性电解质:a是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同但又不能相差太大(小数点后位)最常用为范围还有、。b混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导以保证能顺序排列c混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物d要求各组分分子量要小易于与蛋白质分离。通电后在介质中由于H与OH的相向移动形成了从的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时就停止移动不带电荷并维持pH梯度(电导、缓冲能力)。即:pH梯度由H与OH建立而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处结束。注意事项:、时间相对长对分离有利、也可用来测定蛋白质的等电点。离子交换层析可分为阳离子交换与阴离子交换。、树脂类:分离氨基酸孔径小、纤维素类:分离蛋白质孔径大。,通过改变盐浓度辅助改变pH值进行梯度洗脱吸附本质:非共价连接常用吸附剂:结晶磷酸钙、硅胶脱附方式:、改变蛋白质带电状态、改变环境溶液的pH、离子强度等。小结粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方法细分级一般采用层析法包括凝胶层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时还可采用电泳法包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。蛋白质的纯度鉴定各种细分级的方法都可以用于纯度鉴定常用各种电泳法比较权威的有:等速电泳、梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。沉降分析和扩散分析测定沉降系数和扩散系数。溶解度恒定法加入样品量为横坐标样品溶解量为纵坐标作图。如只有一个拐点则说明样品纯蛋白质分子量的测定最小分子量测定法如Mb含Fe为则M==。这就是最小分子量。其实真实分子量是最小分子量的n倍n指Fe的数目Mb的n=所以M=而Hb用其他方法测得分子量为则说Hb含个Fe原子。渗透压法、超离心法、凝胶过滤法经验公式:lgM=KKVe(K、K为常数)用几种已知蛋白质测其Ve再对lgM作图得标准曲线。再测定未知蛋白质的Ve可得M。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳lgM=KKμR(K、K为常数μR为相对迁移率)凯氏定氮法Folin酚试剂反应紫外吸收法考马斯亮蓝法双缩脲反应样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀为了保存和鉴定的目的往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的:减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低减压的真空度愈高液体沸点降得愈低蒸发愈快此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液表面不断通过空气流或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室用电扇对准吹风使透过膜外的溶剂不沁蒸发而达到浓缩目的此法浓缩速度慢不适于大量溶液的浓缩。冰冻法生物大分子在低温结成冰盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体然后缓慢地融解利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面蛋白质和酶则集中于下层溶液中移去上层冰块可得蛋白质和酶的浓缩液。吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应对生物大分子不吸附易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等使用聚乙二醇吸收剂时先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里外加聚乙二醇复盖置于度下袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法不液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时溶剂和小分子透过大分子受阻保留这是近年来发展起来的新方法最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐并具有成本低操作方便条件温和能较好地保持生物大分子的活性回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择不同类型和规格的膜水的流速分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量值)等参数均不同必须根据工作需要来选用。另外超滤装置形式溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo超滤膜的分子量截留值用上面的超滤膜制成空心的纤维管将很多根这样的管拢成一束管的两端与低离子强度的缓冲液相连使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时则小分子很易透过膜而扩散大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法由于透析面积增大因而使透析时间缩短倍。干燥生物大分子制备得到产品为防止变质易于保存常需要干燥处理最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温易于氧化物质的干燥和保存整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外同时增加了温度因素。在相同压力下水蒸汽压随温度下降而下降故在低温低压下冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点适用于各类生物大分子的干燥保存。贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化贮藏要求简单只要将干燥的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封保持,度冰箱即可液态贮藏时应注意以下几点。、样品不能太稀必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏样品太稀易使生物大分子变性。一般需加入防腐剂和稳定剂常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常、、用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。、贮藏温度要求低大多数在度左右冰箱保存有的则要求更低应视不同物质而定酶活力的测定酶的活力表现为催化某一反应的速度反应速度越大酶的活力也越大酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量(或生成的产物量)μmol数表示之。测定酶活性的方法很多常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应如氧化酶则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP如一些激酶或是有NAD存在如一些脱氢酶和氧化还原酶或者反应产生HO如一些氧化酶这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之测定酶活性的方法很多应根据具体情况选择合适的方法

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