[word格式] 辅助性T细胞亚群在肝移植患者术后早期变化的研究

[ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 格式] 辅助性T细胞亚群在肝移植患者术后早期变化的研究 辅助性T细胞亚群在肝移植患者术后早期 变化的研究 北京医学2008年第30卷第1期 辅助性T细胞亚群在肝移植患者 术后早期变化的研究 裴艳香郝建宇夏成青2齐曼2 . 论着? 【摘要】目的分析肝移植患者术后早期外周血中Thl/Th2细胞亚群的变化及其在免疫反应中的作用.方法 采用细胞内细胞因子免疫荧光染色技术和流式细胞仪检测技术.在单细胞水平上检测l1例未发生排斥反应的肝移 植患者外周血中Th1/Th2的动态变化.结果l1例患者外周血中Th1/Th2在术后3d,1周及2周分别为3.16~2.06, 1.83+-1.49和2.13+-1.80,与术前(5.04+-5.27),1~t比无显着性差异(P>0.05),术后3周时Thl厂I’}l2为1.49+-1.15,与术前相比 显着下降(P<0.05).结论Thl厂I’}l2的平衡与肝移植术后免疫反应密切相关,当Th1厂I’}l2向Th2偏移,易发生免疫耐 受反应. 【关键词】肝移植免疫耐受辅助性T细胞 ChangesofThelpercellattheearlystageofpatientswithfivertransplantation PEIYan-xiang,HAOJian-yu,XIACheng-qing,etal (DepartmentofGastroenterology,BeringChaoyangHospital,Beijing100020) 【Abstract】 OMeetiveToanalyzethechangeofThl/Th2cellsubsetinperipheralbloodfrompatientswithliver transplantation.MethodsThechangesofThlandTh2ofperipheralbloodof11patientswithlivertransplantationwere detectedonthesinglecelllevelbycytokineimmunefluorescencestainingandflowcytometry.ResultsTherewasnosig— nificantdifferenceofThl/Th2inthefirsttwoweeksafteroperationinthenon-ARgroup.Butwef0undthattheTh2was elevatedandThl/Th2significantlydeclinedinthethirdweek.ConclusionsTherationofThl/Th2iscorrelatedwiththe acuterejectionandimmunetolerance.RecipientsinwhomTh2ispredominantaresignificantlypronetodevelopimmune tolerance. 【Keywords】LivertransplantationImmunetoleranceThelpercell 目前.肝移植已成为治疗终末期肝病的一种有 效方法随着外科手术技术的完善.肝移植术后免疫 反应成了影响疗效的主要因素近年来.辅助性T淋 巴细胞(helperTlymphocyte.Th)在肝移植术后免疫 反应中的作用愈来愈受到重视为进一步研究Th细 胞在肝移植术后的作用.我们对2005年5,10月收 治的11例因肝炎肝硬化失代偿期进行肝移植且未 发生排斥反应患者外周血中的Thl细胞及Th2细 胞进行了动态监测.以观察Th细胞及机体细胞免疫 状态的变化规律.为临床进行免疫干预治疗提供依 据.报告如下 对象与方法 一 , 一 般资料 本组11例,男8例,女3例;年龄35,55岁,平 均41.6岁受者术后服用免疫抑制剂他克莫司 (tacrolimus,FK506)0.1mg/kg,剂量根据血药浓度调整; 每12h麦考酚酯(MMF)750mg:术中给予甲泼尼龙 lOmg/kg.术后第1~50mg,第2天40mg,第3天 30mg,第4天20mg.以后逐渐减量. 二,方法 分别于肝移植术前.术后3d,1周,2周,3周采 基金项目:北京市优秀人才基金项目(20o4ID0300517) 1.首都医科大学附属北京朝阳医院消化内科(邮编100020) 2.病理科 取外周静脉血2ml并用肝素抗凝,备用.同时检测血 清谷丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(ASrr)及总 胆红素仃一BIL)的变化. 1.主要试剂及仪器:细胞因子刺激剂fPMA), Ionomycin(Sigma公司),膜封闭剂Golgistop(B.D pharmingen公司1.FITC标记鼠抗人CD8抗体,percp 标记鼠抗人CD3抗体,溶血素,膜通透剂permeabi. 1izingSolution,PE标记白介素一2(IL一2)抗体及PE 标记白介素一4(IL一4)抗体(B.D公司).CO孵育箱(型 号:BB50601.流式细胞仪(BECTONDICKSON公司, FACScalibur). 2.全血细胞刺激培养:向1只试管中加入PMA 25ng,Ionomycin1g及Gogistop0.7Ixl,再向管中 加入0.5Hll抗凝外周血,混匀后放入CO孵育箱中 4h(37?,CO,浓度为40%1. 3.CD4+,I’细胞获取:向两只试管中分别加入 10ixlFITC标记鼠抗人CD8抗体,10t.dPercD标记 鼠抗人CD3抗体再各加入50t-d孵育后的抗凝外 周血,混匀,室温下避光孵育15min;加入lml溶血素 后混匀.避光孵育10min:离心5min(1000r/min)去上 清.CD3+CD8一T细胞即为CD4+,I’细胞. 4.1亚群及Th2亚群的标记:向上述两试管 中加入膜通透剂permeabilizingSolution0.5mlf与蒸 馏水1:9稀释1混匀后避光孵育10min:加入2ml磷 酸盐缓冲剂(PBS)离心洗涤(5min,1000r/min1,去上 清:再分别加入10IMPE标记IL_2抗体.和lOIxlPE 标记IL一4抗体.混匀,室温下避光孵育30min:加入 PBS2ml离心f5min,1000r/min)去上清,分别向试管 中加入300t-dPBS.避光待测. 5.流式细胞仪细胞检测:用流式细胞仪检测.检 测样本前用BD公司 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 Beads校准流式细胞仪. 北京医学2008年第3o卷第1期 使CV值在2%以内.检测时收集50000个细胞,分 别测出CD4+细胞,CD8+细胞,Th1细胞(即IL一2抗体 标记细胞)和Th2细胞(即IL一4抗体标记细胞1的百 分数.并计算Thl细胞与Th2细胞比值. 6.肝功能(ALT,AST,T—BIL)检测:采用美国倍 克曼公司进口I2(20全自动生化分析仪检测. 三,统计学方法 应用SPSS11.0统计软件.数据以露?s表示.采 用配对t检验 结果 一 ,术后患者一般情况 11例患者病情稳定,无明显发热,乏力,肝区胀 痛等表现,胆汁引流通畅,色量正常,肝功能示ALT, AST,T—BIL与术前相比无显着性差异(P>0.05),见 表1. 二,外周血中1,Th2及1,rh2的变化 本组患者外周血中.Thl在术后较术前下降,但 无显着性差异.Th2和Thl/Th2在术后3d,1周,2周 时与术前相比无显着性差异.而3周时,Th2有所升 高,Thl/Th2下降,与术前相比有显着性差异(尸< 0.05),见表2. 讨论 目前肝移植已成为治疗终末期肝病的有效措 施.但急性排斥反应是造成术后早期移植肝损伤及 失活的主要障碍.如何预防急性排斥反应的发生并 诱导免疫耐受的出现是目前研究的热点.肝移植术 后由于异体肝的植入,肝功能状态的好转及免疫抑 表111例患者手术前后主要生化指标的比较忙?) Thl(%) Th2(%) Th1,I2 23.38~4.84 11.10~10.26 5.04+_5.27 17.80__.14.O5.18.20~11.O017.404-10.14 14.00~10.7013.09+9.3116.464-8.80* 1.83~1.492.13~1.801.49_+1.15’ 与术前比较.P<0.05 ; 3O6D 182 ?士? O76 381 723 21 北京医学2008年第3O卷第1期 制剂的应用,使患者的免疫状态发生了很大的变化. 诸多细胞及细胞因子参与肝移植术后的免疫反应. 其中Th细胞作用尤为重要根据分泌细胞因子的不 同,Th细胞可分为Th1亚群和Th2亚群[1_.Thl细胞 主要分泌IL一2,干扰素(IFN一)等细胞因子介导细 胞免疫应答,Th2细胞主要分泌IL一4,IL一5,IL一6, IL一9,IL一10,IL一13等细胞因子介导体液免疫.通过 分泌的细胞因子的相互影响.机体Thl厂rh2处于平 衡状态.Thl厂rh2的平衡与机体的免疫状态密切相 关传统上常应用生物活性检测法来间接检测Th细 胞的功能和数目.但此方法比较费时.且易受细胞培 养中某些因素的干扰.我们采用荧光标记抗细胞表 面抗原和抗细胞内细胞因子单抗,结合细胞固定,破 膜打孔技术.通过流式细胞仪动态检测肝移植术后 外周血中Thl厂rh2的变化.与传统方法相比,此方法 能够增加对Thl厂rh2亚群检测的敏感性和特异性. 同时能更好地反映出两者之间的动态关系 Thl细胞是介导移植排斥反应的重要效应细 胞.同种移植中Thl细胞分泌IL一2,IFN—等细胞因 子,与迟发型超敏反应T细胞(TDTH)和细胞毒T细 胞(CTL)I~增殖,分化,成熟有关,也可激活巨噬细胞 和自然杀伤fNK1细胞,特异性地杀伤移植物抗原.启 动排斥反应.IL一2在肝移植免疫中起重要作用.IL一 2受体分布于T细胞,B细胞,NK细胞及巨噬细胞 表面.IL一2与受体结合后.可引起上述细胞的增殖, 分化,成熟.移植术后急性排斥反应fAR)发生时.外 周血IL一2含量增高.而应用IL一2受体阻断剂巴昔 单抗抑制了细胞免疫应答.因此有效降低了术后急 性排斥反应的发生率[2’.与Thl参与急性排斥反应 不同.Th2被认为与慢性排斥反应及免疫耐受有关 Th2细胞通过IL一4使Th0细胞向Th2细胞分化.同 时IL一4还可以竞争IL一2的受体而减弱IL一2的活 性,下调Thl细胞驱动的排斥反应而促进移植的接 受E4,5】.近年来部分动物移植耐受研究显示,增强Th2 细胞功能的同时常可抑制Thl细胞的表达.从而有 利于免疫耐受的建立?6.71 正常情况下,通过分泌的细胞因子的相互影响. 机体Th1厂rh2处于平衡状态.Thl厂nl2失衡可导致多 种疾病.本研究结果显示未发生排斥反应的肝移植 患者术后早期Th1较术前轻度下降.Th2逐渐升高. 使Thl厂rh2向Th2漂移.随着Thl厂rh2向Th2漂移, 肝功能各项指标也逐渐下降.接近正常.考虑适量的 免疫抑制剂可抑制辅助性T淋巴细胞的发育增殖. 并可防止IL一2的生成与释放.诱导Thlfrh2向Th2 漂移因此,抑制了急性排斥反应的发生,从而诱导 免疫耐受的出现.本研究进一步证实了Thl亚群与 急性排斥反应密切相关.而Th2亚群则与免疫耐受 密切相关.为通过诱导Thl/Th2向Th2漂移来诱导 免疫耐受提供了依据.另外.本研究结果显示.外周 血Thl厂rh2的变化较肝脏酶学改变更敏感.因此外 周血Thl/Th2的变化.可用于肝移植术后患者免疫 状态监测及疗效观察 参考文献 [1]MaggiE,BiswasP,DelPreteG,eta1.AccumulationofTh一2-like helperTcellsintheconjunctivaofpatientswithvernalconjunc- tivitis.JImmuno1.199】,146:1】69—1】74. 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