鸡催乳素基因外显子5的多态性及Taq Ⅰ位点与边鸡繁殖性状的相关性分析

鸡催乳素基因外显子5的多态性及Taq Ⅰ位点与边鸡繁殖性状的相关性分析 鸡催乳素基因外显子5的多态性及Taq ? 位点与边鸡繁殖性状的相关性分析 20TI颦麓47携第9期G酵f~eticsand卧eeding?溱惩鬻翮 鸡催乳素基因外显子5的多态性及TaqI位点 与边鸡繁殖性状的相关性分析 张跟喜,丁馥香z,赵秀华,王金玉,金崇富,张李俊z (1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009;2.山西省农科院畜牧兽医研究所,山西太原030032) NA池直接测序法寻找边鸡催乳素基因外显子5区域的多态位点.摘要:研究采用D 用PCR—RFLP技术检测发 现的roeI位点在边鸡以及3个对照鸡品种(京海黄鸡,尤溪麻鸡和AA鸡)中的单核苷酸多态性,并与边鸡的繁 殖性状进行相关性分析.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:在外显子5区域检测到3个突变位点(C5749T,T5821C,C5956T).T5821C位 点经ToqIX切显,-7v.3种基因型(AA,AB和BB).在4个鸡品种中都以A等位基因为优势等位基因.最小二乘分析 表明,边鸡3种基因型个体的繁殖性状无显着差异(P>0.05). 关键词:动物育种;催乳素基因;繁殖性能;边鸡 中图分类号:$831.2文献标识码:A 催乳素(PRL)是动物垂体前叶嗜酸细胞分泌的 多肽类激素,在所有的脊椎动物中都存在.禽类中, 催乳素具有调节渗透压,促进嗉囊分泌嗉囊乳,调节 代谢,引起就巢,抗促性腺等功能lll.鸡PRL基因定位 于2号染色体,由5个外显子和44-内含子组成,催乳 素前体由30个氨基酸残基的信号肽和199个氨基酸 残基的成熟肽组成l2_. 边鸡是一个耐粗抗寒,蛋重大,肉质好,适应性 强的肉蛋兼用型优良地方鸡种,它是山西省唯一被 列入"国家级畜禽遗传资源保护名录"的地方家禽品 种L31.本研究采用直接测序和PCR—RFLP技术,以饲 养在山西省农科院畜牧兽医研究所的1世代边鸡为 研究对象,用京海黄鸡,尤溪麻鸡和AA鸡对照,研究 ,J基因外显子5的多态性,同时分析外显子5的raq I酶切位点与边鸡繁殖性状的关系,旨在寻找与边鸡 繁殖性状相关的标记,为边鸡的标记辅助选择提供 基础资料. 1材料与方法 1.1实验动物及DNA池构建118只1世代的边鸡 母鸡血样采自山西省农科院畜牧兽医研究所,同时 收稿日期:2010—7一O1;修回日期:2010—09—08 资助项目:国家肉鸡产业技术体系(nycytx一42一G1—05);山西省科 技攻关(20100311041);山西省自然基金项目(2009011043—2); 山西省农业科学院育种基础研究(YYZJC0901) 作者简介:张跟喜(1981一),男,江苏溧阳人,博士研究生 通讯作者 文章编号:0258-7033(2011)09-0001—04 记录开产日龄,开产体重,开产蛋重,300日龄产蛋 数,300日龄蛋重等指标,采取的边鸡群体来自同一 批次,单笼饲养,管理和营养水平一致;30只京海黄 鸡(6:早=l:1)和30只AA)I~(6:早=1:1)血样采自江 苏京海禽业集团有限公司;30只尤溪麻鸡(6:=1:1)血 样采自中国农业科学院家禽科学研究所国家地方禽 种遗传资源基因库.翅静脉采集血样1.5mL,肝素钠抗 凝,置冰盒带回实验室,一200(;保存.常规苯酚一氯仿法 抽提基因组DNA,对基因组DNA进行OD值测定(260nm 和280nm),计算其浓度.从边鸡20个DNA样本中各取 10L混合构建品种DNA池,用于SNPs的搜索. 1.2引物设计和PCR扩增根据GenBank中的鸡 PRL基因序列(GenBank登录号为AF288765)针对外 显子5设计2对引物(扩增片段包含PRL的整个外显 子5),扩增产物大小分别为232bp和271bp.引物由 上海生工生物工程有限公司合成.引物序列如下: PRI5—1:F:5一TrCTACACCCAGACAGATFGA一3. R:5一TGGAqTAGGCGGCACTFC一3:PRLE5—2:F:5 — —GAAGTGCCGCCTAATC一3:R:5一GTGAGGAAATTA— CACAGAAAGG一3. PcR扩增体系为25,包括上,下游引物(1Ot,mol/L) 各1L;10XPCR缓冲液2.5tzL;dNTPs(2mmol/L) 2.5tzL;DNA聚合酶(5u/)O.2;DNA模 板(50ng/~L)2L;Mg2(25mmol/L)1.5L,超纯水 14.3L. PCR扩增程序:94?预变t~6rain;94oC变性30S, 56?复性30S,72oC延f~3oS,30个循环;最后72?延 中固螽教东患参 遗褥秘?GeneticsandBreeding 伸10min,IO~C保存. 1.3PCR产物的纯化测序与酶切位点的分析将2 对引物的PCR产物送往上海生工生物工程有限公司 进行纯化直接测序(双向测序),用DNAman软件分 析测定序列多态位点的酶切位点. 1.4RFLP分析酶切扩增体系为20IxL:10xBuffer I2txL;PCR产物1L;TaqI内切酶0.5L;超 纯水16.5L,65?水浴2h. 酶切产物用交联度(Acr:Bis)为29:1的10%的 非变性聚丙烯酰胺凝胶200V电泳3h,银染显色. 1.5统计分析配合下列模型进行最小二乘方差 分析,比较边鸡繁殖性状在PRL各基因型之间的差 异:+G+. 其中,,,为性状记录值;为群体均值;G为基因型效 应,为随机残差效应,应用SPSS11.0的广义线性模 型(GLM)过程完成. 2结果与分析 2.1PCR扩增结果由图1可见,2对引物PCR扩增 结果与预期一致,且没有非特异扩增条带,可直接用 于测序和PCR—RFLP分析. 2011年第47卷第9期 500bp 250bp 1130bp 注:1,3:PRLE5—1的PCR产物,4,6:PRLE5—2的PCR严物,M:DL2000 DNA分子量标准 图12对引物的PCR产物 2.2直接测序结果通过与GenBank中的鸡PRL基 因序列(GenBank登录号为AF288765)进行比对, PRLE5—1引物DNA池直接测序结果表明,在5749bp 处发生C—T突变,在5821bp处发生T—C突变; PRLE5—2引物DNA池直接测序结果表明,在5956bp 处发生c—T突变(图2).前2个SNPs位于外显子5的 编码区,后1个SNP位于外显子5的非编码区,位于编 码区的突变均未导致氨基酸的改变,为沉默突变. 2.3酶切和序列分析结果DNAman软件分析测定 序列的3个多态位点,结果表明,T5821C位点为TaxiI 酶切位点(T/CGA).用TaqI内切酶消化PRLE5—1引 物的扩增产物,显示3种基因型,分别命名为AA,AB 和BB型(图3).将AA和BB2种纯合基因型的个体进 5749hp582 . 1hf1595 . 6bp 4-+4- AA(:TNGCTGAAATNGACACTTTANGAAAA 图2DNA池测序结果 行直接测序,序列比对显示,AA和BB相比在5821bp 处有1个T—c的突变(图4).当5821bp处为T时, Tat/I酶切产生183bp和39bp的片段;当5821bp处 为C时,无I酶切位点. 123456789M 注:1,4,5,8,9AA型,3,6AB型,2,7BB型 图3PRLE5—1的酶切产物图 中固荔教强是 bp bp bpp AAATTGACAAAATCGACA 图4鸡PRLE5-1中AA和BB型的序列比较 2.4统计分析结果4个鸡品种中PRL基因外显子 5的I位点的基因型频率,等位基因频率由表1 可见,在边鸡和京海黄鸡中检测到3种基因型,尤溪 麻鸡和AA鸡中只检测到2种基因型.在4个鸡品种中 等位基因A都为优势等位基因.卡方独立性检验显 示,Wqi位点3f~基因型在各品种间分布不一致,边 20t]年第47卷第9期GeneticsandBreeding?遗传高种 表144"鸡品种#oPRL基因外显子5TaqI位点的基因型频率和等位基因频率分布 注:括号内的数字是个体数;(df=1)=3.841;x(df=1)=6.635 表2TaqI位点与边鸡母鸡繁殖性状的关联分析 鸡与京海黄鸡,AA鸡相比差异极显着(P<0.001).京 海黄鸡与尤溪麻鸡,AA鸡相比差异极显着(P<0.001). 卡方适合性检验表明,边鸡,尤溪麻鸡和AA鸡符合 哈代一温伯格平衡(P>0.05),京海黄鸡极显着地偏 离哈代一温伯格平衡(P<0.01). 2.5职基因外显子5TaqI位点的多态性与边鸡母 鸡繁殖性状的关联分析由表2可知,不同基因型对 5个繁殖性状均无显着影响(P>0.05). 3讨论 3.1鸡PRL基因的多态性分析研究表明,催乳素基 因的多态主要集中在5调控区和3侧翼区以及信号 崔建勋等【】采用直接测序法筛查鸡 肽的编码区【】. 催乳素基因5调控区,外显子区和部分内含子区的 多态,共检测到13个SNPs和2个短片段(24bp和 l5bp)插入/缺失多态,其中在5调控区筛查到9个 SNPs(C一2402T,C一2192T,C一2161G,C一2134G,C一2062G, A一2040G,A一1944G,C一1884A和T一737G)及2个短片 段插入/缺失多态,在第2外显子筛查到1个SNP (C+I660T),在第5外显子筛查到2个SNPs(C+5874T 和C+5935G),在第2内含子筛查到1个SNP (C+1818T).刘华贵等通过对鸡催乳素基因编码区 基因扫描,发现3个SNPs,分别是外显子2的C1607T, 外显子5的C5749T和T5821C.通过分析发现,这3个 SNPs在崔建勋等【6l的研究中的对应位置分别为 C+1660T,T+5802C和C+5874T.即在外显子2处发现 的为同一突变,在外显子5区域发现的C+5874T为同 一 突变.崔建勋等【6J与刘华贵等l7_在外显子5区域都 检测到一个对方没有检测到的突变,这可能是由两 方面的原因造成的:?所采集鸡品种的差异;?采 用的检测技术的差异.前者采用的是直接测序法, 而后者采用的是PCR—SSCP法. 本研究运用DNA池直接测序法对边鸡群体的 外显子5区域进行多态性检测,发现了3个多态位 点,通过与GenBank中鸡的PRL基因序列(GenBank 登录号为AF288765)进行比对,发现这3个突变分 别位于5749bp(c_?T),5821bp(Tc)及5956bp (c—T)处.前2个突变与刘华贵等l7】的研究一致, 5956bp(c—T)处的突变为新发现的突变.经过分析 发现T5821C位点为TaqI酶切位点,在4个鸡品种 中等位基因A都为优势等位基因.卡方适合性检验 表明边鸡,尤溪麻鸡和AA鸡符合哈代一温伯格平 衡,表明在人工选育,迁徙和遗传漂变等因素作用 下,这3个品种职基因的I位点处于动态平 衡;京海黄鸡极显着的偏离哈代一温伯格平衡,该 鸡种是经过若干世代的选择而形成的培育品种,为 了提高京海黄鸡的整齐度和生产性能,每一世代都 进行了选择,可能是每个世代连续的人工选择对该 位点造成了影响. 3.2鸡艘基因的多态性与繁殖性状的关系Cui 等罔的研究表明,PRL基因5调控区24bp的成1个Evi一1 可能的结合位点(93分),Evi一1可能通过结合Evi一1结 中固螽教东怨. 避黧耥?.一senetfc~,andBreeding 合位点抑制,J基因的表达而阻止就巢,最终使鸡 的产蛋量得到提高.Jiang等l10研究发现,24bp的插入 纯合型鸡表现出非就巢性,插入/缺失变异对绿壳蛋 鸡的就巢性状有显着的影II~(p<o.05),该研究结果在 一 定程度上证明了上述推论的合理性.姜润深等I.1 同时研究了职基因24bp的插入/缺失变异与非就 巢状态下鸡产蛋性能的关系,结果表明该位点不同 基因型对300日龄产蛋性能无显着影响(P>0.05),与 Cui等1的研究结果存在差异表明,鸡品种可能也会 对该位点的功能产生影响.刘华贵等【7l研究表明,尸兄,J 基因3个SNPs尽管没有导致编码氨基酸的改变,但 是由于不同的密码子使用频率和不同的tRNA丰度 也会影响蛋白质的合成效率,3个SNPs形成的7种单 倍型对鸡44周龄平均产蛋量有显着影响,使用高频 密码子的单倍型个体产蛋量相对高.刘华贵等】没 有研究单个位点对鸡44周龄平均产蛋量的影响.本 研究分析了职,J基因I位点(T5821C)与边鸡繁殖 性状的关系,结果表明不同基因型对边鸡5个繁殖性 状均无显着影响,该位点的突变为同义突变,没有导 致编码的氨基酸发生改变,该位点可能不是影响边 鸡繁殖性状的位点.本研究发现的TaqI酶切位点是 否会对边鸡的生长性能,屠体性状等产生影响以及 对其他鸡品种的有关性状的效应如何,有待于进一 步研究 20{1聋第47卷篼9期 参考文献: [1]梁勇,杨关福,张细权.催乳素基因转录调控及其在鸡中多态 性与表达关系的研究….中国家禽,2008,30(16):26—31. 【2]额尔和花.与鸡抱性相关的催乳素基因SNP研究[D].湖北:华 中农业大学,2003. 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RelationshipBetweenPolymorphismsofExon5ofProlactinGeneandTaqI LocusandReproductiveTraitsinBianChicken ZHANGGen-xi,DINGFu-xiang2ZHAOXiu—hua,WANGJin-yu,JINChong— fu,ZHANGLi-jun (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity, JiangsuYangzhou225009,China;2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary, ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,ShanxiTaiyuan030032,China) Abstact:Theexon5oftheprolactin(PRL)geneweredetectedinBianchickenusingDNApoolingandsequencing singlenucleotidepolymorphisms(SNPs)of.TaqIlocusoftheprolactin(PRL)geneweredetectedintheBianchicken (Callusgallus)andthreereferencechicken(G.gallus)populations(theJinghai,YouxiandArborAcrechickens)by PCR-RFLP.TherelationshipwithreproductivetraitsintheBianchickenwasalsoanalysed.Resultsshowedthatthree SNPs(C5749T,T5821CandC5956T)weredetectedintheexon5oftheprolactin(PRL)gene.3genotypes(AA, ABandBB)weredisplayedbydigestedwithincisionenzymeTaqI.ThealleleAwasthepredominantalleleinthefour chickenbreeds.Theleastsquaremeansanalysisshowedthedifferencesforreproductivetraitsamongthe3genotypesin Bianchickenwerenotsignificant(P>0.05). Keywords:animalbreeding;prolactingene(PRL);reproductivetraits;Bianchicken 黪中磊羧絮怒