灰树花β-葡聚糖的高效凝胶渗透色谱行为

灰树花β-葡聚糖的高效凝胶渗透色谱行为 灰树花β-葡聚糖的高效凝胶渗透色谱行为 2007年5月 May2007 色谱 ChineseJournalofChromatography Vo1.25No.3 353,355 灰树花一葡聚糖的高效凝胶渗透色谱行为 宋乐天,于广利,赵峡,高昊东,杨晓华,杨海 (中国海洋大学海洋药物与食品研究所,山东青岛266003) 摘要:以4种不同蛋白质含量的灰树花口?1,3/1,6-葡聚糖(GF1,GF2,GF3,GF4)和1种?1,4/1,6-葡聚糖 (P100)为研究对象,探讨了它们在不同盐浓度和不同pH下的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)行为.结果表明:灰树 花口.葡聚糖相对分子质量在低于0.025mol/L的氯化钠溶液中急剧降低,在0.1—0.2mol/L的氯化钠溶液中趋于 平稳.在pH3—6时,其相对分子质量随pH增加而急剧增加;在pH6—9范围内变化较小;pH高于9后又稍微增 加.在相同条件下,?1,4/1,6-葡聚糖的相对分子质量不受盐浓度和pH值变化的影响.灰树花口一葡聚糖在水溶 液中可形成超螺旋结构,该结构受溶液盐浓度和pH值变化的影响,导致分子聚集状态不同,从而呈现不同的凝胶 渗透色谱行为,表现为相对分子质量升高或降低. 关键词:高效凝胶渗透色谱;相对分子质量;聚集状态;卢?葡聚糖;灰树花 中图分类号:0658文献标识码:A文章编号:1000?8713(2007)03?0353?03栏目类别:研究论文 BehaviorsofJ6『一GlucanfromGr~folafrondosaiIIHigh PerformanceGelPermeationChromatography S0NGLetian,YUGuangli,ZHAOXia,GAOHaodong,YANGXiaohua,YANGHal (InstituteofMarineDrugandFood,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China) Abstract:Thehighperformancegelpermeationchromatographic(HPGPC)behaviorsoffour 口-1,3/1,6-glucans(GF1,GF2,GF3,GF4)withdifferentproteincontentsandone-1,4/1,6- glucan(P100)fromGrifolafrondosawereexaminedwithdifferentconcentrationsofNaClSO- lutionandpHvalues.Theexperimentalresultsshowedthattherelativemolecularmass(M) ofthe口 -glucanssharplydroppedastheNaCIconcentrationwaslessthan0.025mol/Landthen tendedtobestableastheNaClconcentrationwasraisedfrom0.1to0.2mol/L,theMin- creasedquicklyfrompH3to6,andthenmaintainedstablefrompH6to9,butslightlyin- creasedasthepHvaluewashigherthan9.However,theMofthe-1,4/1,6一glucanwas slightlyaffectedbyeitherdifferentconcentrationsofNaClordifferentpHvalues.The一 glucan existedinasuper—helixstructureinaqueoussolution,whichcouldbeinfluencedbytheNaCl concentrationandpHvalue.Thesefactorsledtothedifferentmolecularaggregationstates, andtheincreaseordecreaseoftheMof一glucans,displayingavarietyofHPGPCbehaviors. Keywords:highperformancegelpermeationchromatography(HPGPC);relativemolecular mass;aggregationstate;口一glucan;Grifolafrondosa 灰树花(Grifolafrondosa)是一种药食两用真 菌,其子实体和发酵菌丝体中的-1,3/1,6一葡聚糖 具有抗肿瘤活性,且其抗肿瘤活性与分子结构, 分子质量大小以及是否具有超螺旋结构等密切相 关..高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)具有测定 快速,重现性好的优点,被广泛应用于多糖相对分子 质量的测定. 本文以发酵灰树花菌丝粉为原料,经提取分离 和一消除反应,获得了4种不同蛋白质含量的灰树 花一葡聚糖,并利用HPGPC法考察分析了不同盐 浓度及不同酸碱度对其色谱行为和聚集状态的 影响. 1实验部分 1.1仪器与试剂 HP1100型高效液相色谱仪,示差折光检测器 收稿日期:2006?09?04 第一作者:宋乐天,男,硕士研究生,Tel:(0532)82031790,E?mail:lskysong@163.COIl1. 通讯联系人:于广利,男,博士生导师,Tel:(0532)82031560,E?mail:glyu@OUC.edu.cn. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30370345)及国家重点基础研究发展计 划项目(No.2003CB716401) ? 354?色谱第25卷 及GPC专用软件(美国Agilent公司);Shodex OHpakSB一804HQ不锈钢色谱柱(8.0mm×300 mm,日本昭和电工);系列葡聚糖标准品(P一82,日 本Shodex公司);牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公 司);Folin酚试剂(北京鼎国生物技术发展中心); 其余试剂均为国产分析纯. 1.2灰树花卢一葡聚糖的制备 以灰树花发酵菌丝粉(山东仁和生物公司)为 原料,分别制备3批灰树花一葡聚糖(GF1,GF2和 GF3).利用一消除法脱除GF1中的蛋白,经 纯化,冷冻干燥得到GF4. 1.3蛋白质含量的测定 以BSA为标准品,利用Folin一酚法测定样品 中的蛋白质含量. 1.4高效凝胶渗透色谱条件 色谱柱:ShodexOHpakSB一804HQ;不同盐浓 度流动相:氯化钠浓度分别为0,0.025,0.050, 0.075,0.10,0.15,0.20mol/L的水溶液,均含 0.02%NaN;不同酸碱度流动相:分别用1moVL HC1与1moVLNaOH调节0.02%叠氮钠水溶液, 使溶液的pH值分别为3,4,5,6,7,8,9,l0;流速: 0.5mL/min;柱温:35oC.各种相对分子质量 (404000,212000,112000,47300,22800,11800, 5900)的葡聚糖标准品和样品均用含有不同浓度 NaC1的0.02%NaN,水溶液配成质量浓度为5g/L 的溶液,然后于5000r/min速率下离心lOmin,取 上清液进样,进样量20L.用AgilentHP1100专 用GPC软件采集和分析数据,制作标准曲线并计算 样品的相对分子质量. 2结果与讨论 文献[6]利用刚果红结合法证明灰树花一1,3/ 1,6一葡聚糖具有分支结构,在中性水溶液中能形成三 股螺旋的超螺旋结构.为了进一步评价该多糖在溶 液中的存在状态,尤其是其中蛋白质含量,盐浓度和 酸碱度对其分子聚集状态的影响,本文制备了蛋白质 含量分别为8.03%,3.52%,2.46%和0.10%的灰树花 1,3/1,6一葡聚糖样品及1种.1,4-和.1,6一连接方 式为主的线性连接的一葡聚糖(Pullulan,P100)为对 照,探讨了它们的色谱行为.实验结果表明,标准葡 聚糖的色谱行为几乎不受洗脱液中盐浓度或pH值 大小的影响,具有很好的重复性.图1为不同浓度 NaC1溶液中标准葡聚糖的校正曲线,标准曲线方程 分别为logMr=9.9109—0.7368VR(0mol/LNaC1. = 0.9995);logMr=9.9788—0.7418VR(0.025 mol/LNaC1,=0.9991);log,=9.9787—0.7374 VR(0.050mol/LNaC1,=0.9994);log= 10.0223—0.7419(0.10moVLNaC1,= 0.9992);log=l0.042—0.7429VR(0.20moVL NaC1,=0.9991);式中为葡聚糖在凝胶柱上的 保留体积. 图1系列标准葡聚糖在不同浓度氯化钠溶液中的校正曲线 Fig.1CalibrationClLrvesofaseriesofglucanstandards indifferentconcentrationsofNaClsolution 2.1盐浓度对灰树花.葡聚糖色谱行为的影响 从图2可知,流动相中NaC1浓度为0,0.025 moVL时灰树花一葡聚糖的急剧减小,下降幅 度为70%左右;但NaC1浓度为0.05,0.10moVL 时,其缓慢减小;NaC1浓度为0.10—0.20 moVL时其,趋于稳定.此外,虽然4种灰树花一 葡聚糖的起始值和蛋白质含量不同,但其,变 化规律相同,表明一葡聚糖中蛋白质含量的多少并 不是引起.葡聚糖分子聚集状态变化的主要因素. 张志花等曾在云芝糖肽中发现了类似现象,即其 相对分子质量随流动相盐浓度的增大而变小.采用 相同的实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 测定一葡聚糖P100的色谱行为, 发现其,不受盐浓度及pH值变化的影响.分析 认为这是由于流动相中盐浓度的增加,使离子强度 增大.分子之间斥力增大,造成网状糖链分子收缩, 图2不同浓度的氯化钠溶液中灰树花一葡聚糖和 一葡聚糖相对分子质量的变化 Fig.2RelativemolecularmasschangesofGr~fola frondosa口-glucansand口-glucanindifferent concentrationsofNaClsolution 第3期宋乐天,等:灰树花一葡聚糖的高效凝胶渗透色谱行为?355- 聚集,易进入色谱柱多孔填料的孔径中,色谱保留时 问延长,相对分子质量降低;盐浓度降低时,一葡聚 糖超螺旋分子变得舒展,分子形状变大,相对分子质 量变大.一葡聚糖因不具备高级构象,分子形状不 受流动相环境的影响,相对分子质量不发生变化. 这进一步说明一葡聚糖高级构象的改变是上述现 象发生的原因. 2.2pH值对灰树花卢一葡聚糖色谱行为的影响 为了验证溶液酸碱度对口一葡聚糖相对分子质 量的影响,考虑到色谱柱填料对pH的耐受情况,我 们 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 并考察了各样品在pH3,10范围内的高效 凝胶渗透色谱行为. 图3为灰树花一葡聚糖和OL一葡聚糖样品在不 同pH下相对分子质量的变化情况,图4为GF1样 品在不同pH流动相条件下的叠加色谱图.从图3 及图4可看出,一葡聚糖的受酸碱度影响的变化 规律基本相同,不受一葡聚糖样品中蛋白质含量多 少的影响,如在pH6,9范围内,其变化平稳; pH3—5时,随着pH的降低而降低;pH高于9后, 图3不同pH下灰树花-葡聚糖和 葡聚糖相对分子质量变化 Fig.3RelativemolecularmasschangesofGr~fola frondosa-glucansand-glucanindifferentpHvalues 图4不同pH下GF1的HPGPC色谱图 Fig.4HPGPCgraphsofGF1indifferentpHvalues 又有升高趋势.但相同条件下一葡聚糖PIO0 则无此现象,其相对分子质量不受酸碱度的影响. 表明灰树花一葡聚糖和一葡聚糖在溶液中的聚集 状态不同,灰树花一葡聚糖高级结构受酸碱度的影 响,使聚集状态发生改变,导致其相对分子质量的变 化.Saito等叫和Zhang等…均证实一1,3一葡聚 糖在一定浓度的NaOH溶液中三股螺旋会被破坏 并解聚成不规则的卷曲的单链.由于色谱柱填料性 能的限制,我们尚无法运用HPGPC法评价更高pH 条件下灰树花口一葡聚糖相对分子质量的变化.关 于不同浓度碱溶液对灰树花一葡聚糖相对分子质 量或者聚集状态的影响,还需采用其他的方法进行 研究. 由于灰树花一葡聚糖是一种具有分支结构的 多糖,因此在水溶液中可形成超螺旋结构.从本 文HPGPC分析结果可知,灰树花一1,3/1,5-葡聚 糖高级结构易受溶液的盐浓度和pH值变化的影 响.由于其高级结构发生变化,导致了分子聚集状 态不同,从而使其呈现了不同的凝胶渗透色谱行为, 表现为相对分子质量降低或升高.这提示在测定某 些具有分支结构的多糖分子的相对分子质量时,应 做系统研究后选择固定的分析条件.同时也表明不 同条件下HPGPC也可以用来分析,评价某些多糖 水溶液的高级结构变化情况,从而为研究多糖分子 在水溶液中的物理性质,尤其是推测其在水溶液中 的聚集状态提供参考. 参考文献: [1]MatsuiK,KodamaN,NanbaH.CancerLetters,2001,172: l93 [2]OhnoN,IinoK,TakeyamaT,SuzukiI,SatoK,OikawaS, MiyazakiT,YadomaeT.ChemPharmBull,1985,33:3395 [3]HeH,YangF,DuY.CarbohydrRes,2002,337:I673 [4]SaitoH,YoshiokaY,UeharaN,AketagawaJ,TanakaS, ShibataY.CarbohydrRes.1991.217:181 [5]FalchBH,EspevikT,RyanL,StokkeBT.Carbohydr Res,2000,329:587 [6]LiCL,YuGL,ZhaoX,WangY,LiGQ,XuZP.Chinese JournalofBiochemicalPharmaceu~cs(李春林,于广利,赵 峡,王莹,李国强,徐泽平.中国生化药物杂志),2004,25 (1):20 [7]KarlssonNG,PackerNH.AnalBiochem,2002,305:173 『8]PetersonGL.AnalBiochem,1979,100:201 [9]ZhangZH,YangXT,FangJN.ChineseJournalofChro- matography(张志花,杨晓彤,方积年.色谱),1997,15 (2):150 [1O]SaltoH,OhkiT,SasakiT.CarbohydrRes,1979,74:227 [11]ZhangX,ZhangL,XuX.Biopolymers,2004,75:187