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家畜繁殖学实验指导

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家畜繁殖学实验指导家畜繁殖学实验指导 《家畜繁殖学》实验实习指导 娜仁花 李英 张家新 余凤玲 内蒙古农业大学自编教材 第一部分 实验指导 实验一 公畜母畜生殖器官观察 一、目的要求 认识各种公畜母畜生殖器官的位置、形态、大小及解剖结构特点,为更好地应用繁殖技术奠定解剖学基础。 二、材料和方法 (一)材料 牛、羊、猪生殖器官各4套 (二)器械 大搪瓷盘,解剖刀,剪刀,镊子,金属探针 三、内容和步骤 (一)公畜生殖器官的观察 公畜生殖器官包括:睾丸(及阴囊和精索)、附睾、输精管、尿生殖道、副性腺及阴茎。 1...

家畜繁殖学实验指导
家畜繁殖学实验指导 《家畜繁殖学》实验实习指导 娜仁花 李英 张家新 余凤玲 内蒙古农业大学自编教材 第一部分 实验指导 实验一 公畜母畜生殖器官观察 一、目的要求 认识各种公畜母畜生殖器官的位置、形态、大小及解剖结构特点,为更好地应用繁殖技术奠定解剖学基础。 二、材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 (一)材料 牛、羊、猪生殖器官各4套 (二)器械 大搪瓷盘,解剖刀,剪刀,镊子,金属探针 三、内容和步骤 (一)公畜生殖器官的观察 公畜生殖器官包括:睾丸(及阴囊和精索)、附睾、输精管、尿生殖道、副性腺及阴茎。 1(睾丸 家畜睾丸成对,分别位于阴囊的两个腔内,其形状均为长卵圆形。一侧有附睾附着,叫附睾缘,另一侧为游离缘。随畜种不同大小有差别。牛、羊、猪的睾丸相对比较大,以羊的睾丸为最大。马(驴)阴囊位于两股之间的腹股沟区,睾丸长轴与地面平行,附睾位于睾丸的背外缘,附睾头在前、尾在后。牛、羊阴囊较马阴囊稍靠前,位于前腹股沟区,睾丸长轴与地面垂直,附睾位于睾丸的后侧,附睾头在上尾在下。猪的阴囊位于股部之后,睾丸长轴倾斜,前低后高,附睾位于睾丸的前上缘,附睾头在前下方尾在后上方。 2(附睾 位于睾丸的附着缘,分头、体、尾三部分。头膨大,由睾丸输出管相连结,睾丸输出管汇合成一条较粗而长的附睾管盘曲成附睾体和附睾尾,最后过渡为输精管。 3(精索、输精管 输精管由附睾管延续而来,而后进入由睾丸系膜、血管、淋巴管、神经、睾内体提肌共同组成的精索(成锐三角形)。沿腹股沟管进入腹腔,此后即和精索内的其它部分分开,单独向后上方进入骨盆腔至膀胱背面,两侧输精管都进入尿生殖皱襞内,在此处输精管变粗,形成输精管壶腹。马(尤其是驴)的输精管壶腹发达;猪的输精管壶腹不明显;牛、羊的输精管壶腹比较明显,粗细介于马和猪之间。输精管壶腹部的实质为分支管状腺体组织,有分泌物排出。 4(副性腺 (1)精囊腺成对位于膀胱颈背面的两旁,输精管末端的两侧。与同侧的输精管形成射精管共同开口于尿生殖起始部的精阜上。马的精囊腺呈梨形囊状,向后缩小成输出管。牛、羊、猪的精囊腺都是由致密的分叶腺体组织构成,牛、羊的精囊腺比马的小,而猪的精囊腺特别发达。 (2)前列腺位于膀胱尿道开始处精囊腺之后。马的前列腺由两个侧叶和一个峡部所构成,形似蝴蝶的复管状腺,有许多排出管开口于精阜的两旁。牛和猪的前列腺分为体部和扩散部两部分。体部位于膀胱颈与骨盆尿道交界处,牛的为棱形,猪的为纽扣形。猪的体部小,而扩散部很大,包在骨盆尿道部尿道粘膜外面尿道海绵体肌间,由体部向后延伸而来,其腺管成行开口于尿生殖道内。羊的前列腺最不发达,仅有扩散部,而且为尿道肌所包围,外观看不到。 (3)尿道球腺成对位于尿生殖道骨盆部出口的外侧两旁,各有一个排出管(马有7~8个)开口于尿道内。猪的尿道球腺最为发达,为圆柱状,上面覆盖的尿道球肌很薄,所以能看出它的分叶。马的尿道球腺比猪的小,牛、羊的最小,均成球状,上面覆盖的尿道球肌较厚。 5(尿生殖道、精阜 尿生殖道是公畜尿和精液排出的共同管道。可分为骨盆部和阴茎部,以坐骨弓为界,在交界处管腔变窄,形成尿道峡部。阴茎部位于阴茎海绵体腹面的尿道沟内。在尿生殖道骨盆部的腹面正中线上作纵行切口,可以看到起始部尿道上壁有一圆形隆起的精阜,上有射精孔,是输精管和精囊腺的输出管共同形成的开口。前列腺的开口在其两侧,尿道球腺开口在其后。 6(阴茎 阴茎由阴茎根、阴茎体和龟头组成。阴茎借助于两个阴茎脚固定于坐骨弓,从这里开始,在两股之间沿着下腹壁走向脐部,龟头位于其末端。阴茎由两个阴茎海绵体和腹面的尿道海绵体组成,为阴茎的勃起组织。马的阴茎长而粗大呈扁圆柱状,龟头膨大,其前下侧有一龟头窝,内有尿道突。牛的阴茎在阴囊之后形成“S”形弯曲,并由阴茎伸缩肌固定于阴茎根上,交配时伸直。龟头上下较扁且前端有些扭转。羊的阴茎与牛的相似,但比牛的细小,尿道突细长,呈蚯蚓状,绵羊的较长,山羊的较短,猪的“S”状弯曲在阴囊之前,其龟头呈螺旋状,上有一包皮盲囊。 (二)母畜生殖器官的观察 母畜的生殖器官包括:内生殖器官包括卵巢、输卵管、子宫、阴道和外生殖器官包括尿生殖前庭、阴唇和阴蒂。内生殖器官位于腹腔和骨盆腔内,上面为小结肠和直肠,下面为膀 胱。前下方为小结肠和大结肠。牛的左前侧为瘤胃,马的右前侧为盲肠。子宫颈以前的内生殖器官,靠子宫韧带连到腹腔背侧。子宫颈以后的各部分,靠结缔组织及脂肪固定在骨盆腔侧壁上。 1(卵巢 家畜的卵巢由卵巢系膜悬吊在腹腔的腰部、肾的后方。 马:卵巢似蚕豆形或肾形,附着缘宽大,游离缘内陷形成排卵窝。根据发情周期的不同时期,卵巢的直径大小为3~7 cm不等。由于卵泡发育,卵巢的外形也随之改变,带有黄体的卵巢体积虽然增大,但外形变化不明显。卵泡排卵后,首先形成红体(血凝块),在黄体组织初形成时,呈皱襞状包着红体。然后在黄体的形成过程中,红体逐渐被吸收。老黄体的体积缩小,一端指向排卵窝。 牛:卵巢位于两侧子宫角尖端的外侧下方,耻骨前缘附近。其形状为卵圆形,比马的卵巢小(约12~16 g),中等大的母牛,卵巢平均长2~3 cm,宽1.5~2 cm,厚1~1.5 cm。排卵后多不形成红体,黄体往往凸出于卵巢表面。 羊:卵巢位于两侧子宫角尖端的外侧下方,耻骨前缘附近,形状比牛的圆而小,长1~1.5 cm,宽、厚各0.8~1.0 cm。 猪:有发达的卵巢囊,卵巢和输卵管有时包在卵巢囊内。卵巢体积和形状随着母体的成熟程度而有不同。初生仔猪卵巢形似肾脏,一般是左侧稍大,约5 mm×4 mm,右侧为3 mm×4 mm;在接近性成熟时,由于卵巢上许多的小卵泡,体积增大成2 cm×1.5 cm,形状好似桑椹;达到性成熟时,卵巢上有许多大卵泡、红体及黄体,很象一串葡萄,此时卵巢体积最大。 2(输卵管 成对的弯曲管道,从卵巢附近开始延伸到子宫角尖端。输卵管的前1/3段较粗,称输卵管壶腹,是精子和卵子结合受精的部位;后2/3段变细,称为输卵管峡部。两者的连接部称为壶峡连接部。输卵管的子宫端和子宫角尖端相连接,成为宫管连接部。 马:输卵管有许多弯曲,腹腔端扩大呈漏斗状,其边缘不整齐,形成许多皱襞,称为输卵管伞,伞附着在卵巢的排卵窝旁边。卵巢囊比较发达,宫管连接部界限明显。 牛、羊:输卵管弯曲较少,伞部不发达,由于子宫角尖端细,所以输卵管和子宫角之间的界限不明显。 猪:输卵管有许多小弯曲,伞部比较大。其开口接近卵巢囊的底部。输卵管和子宫角之间界限明显。 3(子宫 大部分位于腹腔,少部分位于骨盆腔,前接输卵管,后接阴道,借助于子宫阔 韧带悬于腰下。各种家畜的子宫都分为子宫角、子宫体、子宫颈三部分。也可分为两种类型:牛羊子宫角基部之间有一纵隔,将两角分开,称为分子宫;马无此隔,猪也不明显,均称为双角子宫。子宫角有大小两个弯,大弯游离,小弯供子宫阔韧带附着。 马:子宫角呈扁圆筒状。子宫角小弯在上,大弯在下,小弯上的浆膜和子宫阔韧带相连接。子宫体前端与两个子宫角交界处为子宫底。马的子宫体较其它家畜的发达。子宫粘膜上有大量纵行皱褶,充塞于子宫腔。子宫颈前接子宫体,子宫颈外口突出于阴道腔2~4 cm,构成明显的子宫颈阴道部。马的子宫颈比牛短而细,壁也较薄较软。子宫颈管的粘膜形成许多高低不等的纵形皱襞。子宫颈通常是自然关闭的,但收缩不紧,可容一指伸入,发情时开放 。 很大 牛、羊:子宫角弯区如绵羊角,位于骨盆腔内。经产多次的,子宫并不能完全恢复原来的形状和大小,所以经产母牛的子宫常垂入腹腔。子宫粘膜上有突起的子宫阜(成为怀孕牛、羊母体胎盘),阜上没有子宫腺,但其深部富含血管。牛和羊的子宫阜不同之点在于羊的子宫阜的中央有一凹陷。牛、羊的子宫体均比较短。牛、羊的子宫颈肌肉层发达,质地较马的坚硬,在牛的直肠检查时很容易摸到。牛的子宫颈管道内不仅有纵形皱襞,而且还有大而横行的皱襞,羊的这种皱襞更明显。不发情时管壁封闭很紧,发情时也只是稍微开放。牛子宫颈阴道部粗大粘膜有放射状皱襞,经产牛的皱襞有时肥大呈菜花状。羊子宫颈阴道部仅为上下二片或三片突出。 猪:子宫角形成很多弯曲,很似小肠。子宫体不明显,子宫粘膜也形成皱襞,充塞于子宫腔。子宫颈管内粘膜有两排交错的半圆形突起,呈连续性的放射状,中间的较大,两端的较小。子宫颈的前方与子宫体、后方与阴道均没有明显的界限,而是逐渐地过渡,因此没有子宫颈阴道部,人工授精时输精管很容易插入。 4(阴道 为母畜的交配器官,又是胎儿娩出的通道。其背侧为直肠,腹侧为膀胱和尿道。阴道腔为扁平的缝隙,前端子宫颈阴道部突入其中,后端和尿生殖前庭之间以尿道外口、阴瓣为界。马的阴道长15~35 cm,牛的阴道长22~28 cm,猪的阴道长10 cm、羊约8,14 cm。阴道粘膜层为复层扁平上皮细胞,发情时发生角质化,无腺体。子宫颈阴道部周围的阴道腔称为阴道穹隆,其中猪无阴道穹隆。牛、羊交配时,精液射到阴道穹隆附近;马、猪精液则射到子宫颈或子宫内。 5(外生殖器官 包括尿生殖前庭、阴唇和阴蒂。 (1)尿生殖前庭 是指从阴瓣到阴门裂的部分。前庭两侧壁的粘膜下层有前庭大腺,发 情时分泌增强。 (2)阴唇、阴蒂:阴唇分左右两片而构成阴门,两片阴唇的上端及下端联合起来形成阴门上角和下角。马的阴门上角较尖,阴门下角较圆;牛、羊及猪的阴门相反,下角较尖,呈锐角,且垂至坐骨弓的下面。在阴门下角内包含有球形凸起物即阴蒂,由勃起组织(海绵体)构成,有丰富的感觉神经分布。阴蒂与雄性龟头同源。 6(子宫动脉(子宫中动脉) 牛的子宫动脉位于岬部之前、最后腰椎处,与脐动脉共同起源于髂内动脉,沿子宫阔韧带走向子宫角小弯进入子宫。马的子宫动脉起于髂内动脉之前的髂外动脉,或者与髂外动脉共同起于腹主动脉,它沿子宫阔韧带的中部行走,到达子宫角小弯而进入子宫。子宫动脉向前与卵巢动脉子宫支,向后与尿生殖动脉子宫支吻合。 四、实验报告 通过观察和比较说明牛羊猪公、母生殖器官的形态、大小、相互关系和大体构造以及在活体上的位置有何特点。 实验二 公畜睾丸、母畜卵巢组织学及精子发生、卵泡发育过程的观察 一、目的要求 通过观察家畜睾丸和卵巢组织切片,了解家畜睾丸、卵巢的组织结构及其形态。掌握精子的发生和卵子的发生、卵泡的发育过程及其形态,为学习家畜繁殖学及更好地掌握和应用繁殖技术奠定组织学基础。 二、材料和方法 (一)材料 公畜睾丸,母畜卵巢组织切片及挂图 (二)器械 显微镜 三、内容和步骤 (一)公畜睾丸的组织学观察 教师先结合挂图进行讲解,使学生对公畜睾丸、母畜卵巢组织学结构及精子发生、卵泡发育过程有了初步的了解。然后再用显微镜观察睾丸、卵巢组织切片。 1(低倍镜观察 (1)被膜 由浆膜和白膜构成。外层浆膜为一较薄的固有鞘膜,其下为致密弹性结缔组 织构成的白膜,其中富有血管。白膜下为实质部分,即睾丸的功能层。内层白膜 (2)睾丸纵隔和中隔 睾丸纵隔是白膜由睾丸的一端伸向睾丸实质的结缔组织索。睾丸中隔是纵隔向四周发出许多放射状的结缔组织小梁伸向白膜构成。 (3)睾丸小叶 睾丸中隔将睾丸实质分成许多小叶,小叶的尖端朝向中央,小叶的基部朝向睾丸的表面。每个小叶由2~3条盘曲的曲精细管及血管和间质细胞组成。曲精细管在各小叶的尖端先各自汇合成直精细管,穿入睾丸纵隔结缔组织内,形成弯曲的导管网,称为睾丸网(马无此结构),为精细管的收集管道。睾丸网又分出12,15条睾丸输出管,汇入附睾头形成附睾管。 2(高倍镜观察 睾丸小叶的结构由曲精细管及其间质细胞构成。此外,还有血管、淋巴管等。 (1)间质细胞 体积较大,分布于曲精细管之间,近似卵圆形或多角形,核大而圆。具有分泌雄激素的功能。 (2)曲精细管的结构 曲精细管的管壁自外向内由同心圆状排列的结缔组织、基膜和复层生殖上皮构成。生殖上皮细胞主要由足细胞和生精细胞两种细胞构成。 (3)足细胞 又称Sertoli细胞、支持细胞、营养细胞。体积较大而细长,数量较少,属体细胞。呈辐射状排列在曲精细管中,分散在各期生殖细胞之间,其底部附着在曲精细管的基膜上,游离端朝向管腔,常有许多精子镶嵌在上面。该细胞高低不等,界限不清,细胞核较大,位于细胞的基部,着色较浅,具有明显的核仁,但不显示分裂现象。由于它的顶端有数个精子伸入胞浆内,故一般认为此种细胞是对生精细胞起着支持、营养、保护等作用。足细胞失去功能,精子便不能成熟。 (4)生精细胞 数量比较多,成群的分布在足细胞之间,大致排列成3~7层。根据不同发育阶段的形态特点又可分为:精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。 ?精原细胞 位于最基层,紧贴基膜。细胞体积较小,呈圆形,常有分裂现象,是精子生成的干细胞。细胞质比较清亮,细胞核大而圆,富含染色质,因而着色较深。 ?初级精母细胞 位于精原细胞上面,排成几层,常显示有分裂现象。细胞体积较大,呈圆形,细胞核呈球形,富有染色质,故着色较深。分裂时,因染色体所处不同的活动时期而呈线状、棒状或粒状。在最初阶段与精原细胞不易区别。随着细胞离开基膜向管腔移动,同时胞浆不断增多,胞体不断变大,具有明显的胞核。 ?次级精母细胞 位于初级精母细胞的内侧,体积较小,细胞呈圆形。细胞核为球形, 染色质细粒状。由于该细胞很快分裂为两个精子细胞,因而在切片上很难找到它。 ?精子细胞 位于次级精母细胞内侧,靠近曲精细管的管腔,常排列成数层。并且多密集在足细胞游离端的周围,细胞体积更小,胞浆少,核呈球形,着色深。 ?精子 位于或靠近曲精细管的管腔内。有明显的头和尾,呈蝌蚪状。头部含有核物质,染色很深,常深入足细胞的顶部胞浆中。尾部朝向管腔。精子发育成熟后脱离曲精细管的管壁,游离在管腔中,随后进入附睾。精子是一种独特的细胞,不含细胞质。成熟后还有前进运动的能力。 3(精子发生过程 精子发生过程可分为明显的两个时期。第一时期,精原细胞经一系列分裂形成精子细胞。第二时期,精子细胞变形成为精子。精子发生整个过程的完成需要近两个月的时间。 (二)母畜卵巢的组织学观察 1(低倍镜观察 在低倍镜下找出卵巢表面上皮和白膜,区分卵巢的皮质部和髓质部。 (1)表面上皮 位于卵巢皮质的最外层,在幼年家畜为单层柱状或立方上皮细胞所组成,随着年龄增大,这些细胞变成扁平细胞。马卵巢表面上皮仅分布于排卵窝。其余部分被浆膜覆盖。 (2)白膜 位于表面上皮之下的一薄层致密结缔组织。 (3)皮质部 位于白膜下面、卵巢的外周部分(马的则位于卵巢中央靠近排卵窝处)。由许多大小不等的发育卵泡和闭锁卵泡、少量黄体以及较致密的结缔组织所构成。占卵巢的大部分,与髓质无明显界限。由于皮质部含有卵泡和产生卵巢激素的细胞,故也称“功能层”。 (4)髓质部 位于卵巢中央(马则在卵巢周围)。内含有许多细小的血管、神经和富有弹性纤维的疏松结缔组织。 2(高倍镜观察 (1)卵泡发育的观察 每个卵泡都由位于中央的卵母细胞和围绕在卵母细胞周围的卵泡细胞所组成。有的卵泡在发育过程中可能退化而形成闭锁卵泡。卵泡可根据发育程度不同而分成下列五期。 ?原始卵泡 卵原细胞有丝分裂增殖停止,形成初级卵母细胞。初级卵母细胞进入第一次减数分裂不久休止在前期的双线期。初级卵母细胞位于中央,周围包有一层扁平的卵泡(颗粒)细胞。卵母细胞的体积比较大,中央有一圆形的泡状核,核内染色质稀少,着色较浅, 核仁明显。卵泡细胞体积小,核扁圆形,着色深。所有的原始卵泡在出生前就形成了。它处于贮备状态未进入生长。常常在皮质外层外周成群的出现。据估计,一头出生牛犊卵巢中央有大约75 000个原始卵泡。 ?初级卵泡 初级卵母细胞迅速生长,外有一层立方形的颗粒细胞包围。此时,卵母细胞已有透明带形成,并由卵泡颗粒细胞长出绒毛渗透到透明带内,为卵母细胞提供营养。 ?次级卵泡 初级卵泡经过发育和生长,即成为次级卵泡。卵母细胞体积基本不变,但外围的卵泡颗粒细胞生长。卵母细胞由多层颗细胞所包围。其外有卵泡膜形成。 ?三级卵泡 卵泡体积增大。颗粒细胞之间有液体形成并将它们分开形成卵泡腔。小卵泡腔合并成为大卵泡腔。初级卵母细胞逐渐发育增大,胞浆中卵黄颗粒增多。透明带为较均一的厚层蛋白质膜,卵泡细胞层增厚。 ?成熟卵泡 也叫Graafian卵泡。三级卵泡进一步成熟,形成充满卵泡液的水泡,卵泡突出于卵巢表面。卵泡体积很大,卵泡腔扩大。此时初级卵母细胞长大成熟,核呈空泡状,染色质很少,核仁明显。胞浆内富有卵黄颗粒。排卵前即恢复并完成第一次减数分裂,结果形成大小不等的两个细胞,大的细胞为次级卵母细胞,小的叫第一极体。透明带变厚。极体呈卵圆形,位于透明带与次级卵母细胞之间的卵黄周隙,只有核质构成,以后逐渐退化。Graafian卵泡的卵泡壁由几个功能细胞层构成。最外层为有较多纤维细胞层的外膜,向内为内膜层。这两种细胞层由毛细血管网提供血液。外膜与内膜层分界明显,常合称为卵泡膜。内膜增厚,内膜细胞肥大,呈圆形或多角形,类脂质颗粒增多,细胞核为椭圆形。在内膜层下面有一层基膜,将内膜与最内层细胞即颗粒细胞层分开。基膜阻止血管系统进入颗粒细胞层。随着卵泡腔扩大,颗粒细胞层变薄,包围卵泡腔。颗粒细胞排列整齐。有时可见到细胞分裂。 此外,卵丘位于卵泡腔的一侧,卵丘和其它颗粒细胞包裹卵母细胞。与卵母细胞直接接触的颗粒细胞呈辐射状排列,称作放射冠。排卵开始时,放射冠细胞与周围的卵泡壁颗粒细胞之间开始出现裂隙,彼此的联系疏松。 牛、羊、猪的卵泡在排卵前(马排卵后)完成第一次减数分裂,形成次级卵母细胞。随即开始第二次减数分裂,然后休止在中期(M)。受精过程才使第二次减数分裂恢复并完成,结果产生合子(受精卵)及第二极体。因此,牛、羊、猪、马等家畜没有真正的卵子存在。 闭锁卵泡:初级卵泡退化后,一般不留痕迹。但生长卵泡退化时,卵母细胞萎缩,透明带皱缩塌陷,卵泡液被吸收,卵泡壁凹陷,以后结缔组织侵入泡内。 (2)黄体形成过程 排卵后的卵泡转变成富有血管的内分泌器官。牛、羊、猪的黄体位于卵巢皮质浅层突出于表面。马的黄体则完全埋藏在卵巢深部。根据黄体发育阶段而分成下列几期: ?血体期 卵泡破裂后,血液流入卵泡腔内,形成血凝块,也叫红体期。 ?增生期 当破裂卵泡伤口愈合,黄体细胞增生,外观呈黄色。黄体细胞一部分来源于卵泡颗粒细胞,多分布于黄体中心,着色浅,呈多角形,体积较大,胞质出现类脂质颗粒,球形细胞核明显。另一部分来源于内膜细胞,多分布在黄体边缘或颗粒黄体细胞之间,体积小,核及胞质着色较深。 ?血管盛开期 血管与结缔组织伸入黄体中心,形成花彩状,黄体细胞清晰可见。 ?成熟期 黄体增大到最高峰,黄体内各种结构明显。 ?白体期 黄体退化、萎缩,变成白色的痕迹。 四、实验报告 1(绘出并注明睾丸曲精细管及其所含细胞的构造图。 2(绘出并注明卵巢组织结构及卵泡发育各阶段示意图。 实验三 人工授精器械的认识与假阴道的安装 一、目的和要求 1(熟悉人工授精所用的采精和输精器械,了解其用途及使用方法。 2(练习安装假阴道。 二、材料和仪器设备 (一)采精器材 牛羊猪马的采精用假阴道,牛羊电刺激采精棒,猪手握法采精用的橡胶手套 (二)输精器材 牛羊猪马输精器,阴道开张器,额灯和手电筒 (三)辅助器材 高压灭菌器,酒精灯,长柄钳,镊子,玻璃棒,棒状温度计 (四)药 品 灭菌凡士林,75,和95,酒精棉球,滑石粉,来苏儿,洗衣粉 三、方法和步骤 先由老师讲解人工授精器材的构造、各部分名称和用途,并作假阴道安装的示范。然后 学生分组观察并作假阴道的安装练习。 (一)人工授精器材的认识 1(假阴道 为长筒状,由外壳、内胎和集精杯(管)三个主要部分组成。其粗细和长短因畜种而异,不同国家不同时期的设计形式也不尽相同。 (1)外壳 牛、羊和猪的假阴道外壳一般为硬橡胶或塑料制成的圆筒,中部装有可吹气、注水和排水的开关。猪用假阴道则在此处连接一个可向假阴道内打气的双链球,以调节压力。马的假阴道的外壳由镀锌铁皮或金属制成,分头、颈和体三部分。筒体的中部装有把柄,其 、排水孔,并有封闭塞或橡胶带。 侧面有吹气和注水 (2)内胎 由优质橡胶制成的胶筒,目前有些国家将其内胎面制成粗糙面,以增强采精时对阴茎的刺激,利于采精。 (3)集精杯(管) 牛、羊用双层的棕色集精杯(苏式)或有刻度的离心管(美式)。马用黑色橡皮杯(苏式)。猪用棕色有刻度的广口瓶。当用手握法对公猪进行采精时,只需备一只乳胶手套和收集精液的容器即可。集精杯(管)可借橡皮圈直接固定于假阴道的一端或借橡胶漏斗与假阴道连接。 2(输精器 苏式牛、羊输精器为一长颈玻璃注射器。目前常用的为金属或塑料制成的输精管,其后连接一个橡皮球。冷冻细管精液输精则使用金属制成的输精枪。对牛羊等家畜的输精需借助阴道开张器和额灯或手电筒照明进行。开张器的种类和大小因畜种而异。 (二)假阴道的准备 1(假阴道外壳及内胎的检查 (1)检查假阴道外壳两端是否光滑,外壳有否裂隙或开焊之处(特别是马用外壳)。 (2)检查内胎是否漏水。可将内胎注满水,用两手握紧两端,并扭转内胎施以压力,观察胎壁有无破损漏水之处,如发现应及时修补或更换。公猪的手握法采精用的乳胶手套在用前也应检查。 2(采精器材的清洗 (1)外壳、内胎、集精杯(管)等用具用后可用热的洗衣粉水清洗。内胎的油污必须洗净。 (2)以清水冲净洗衣粉,待自然干燥后即可使用。 3(内胎的安装 将内胎放入外壳,内胎露出外壳两端的部分长短应相等。而后将其翻转在外壳外,内胎应平整,不应扭曲,再以橡皮圈加以固定。 4(消毒 先以长柄钳夹取75%的酒精棉球擦拭内胎和集精杯,再以95%的酒精棉球充分擦拭。采精前,最好用稀释液冲洗1~2次。 5(集精杯(管)的的安装 牛、羊、猪的集精杯(管)可借助特制的保定套或橡皮漏斗与假阴道连接。 6(注水 通过注水孔向假阴道内、外壁之间注入50~55?温水,使其能在采精时保持38~42?,注水总量约为内、外壁间容积的1/3~1/2。 7(涂润滑剂 用消毒好的玻璃棒,取灭菌凡士林少许,均匀的涂于内胎的表面,涂抹深度为假阴道长度的1/2左右,润滑剂不宜过多、过厚,以免混入精液中,降低精液品质。当用手握法给公猪采精时不须使用润滑剂。 8(调节假阴道内腔的压力 从注气孔吹入或打入(猪)空气,根据不同家畜和个体的要求调整内腔压力。 9(假阴道内腔温度的测量 把消毒的温度计插入假阴道内腔,待温度不变时再读数,一般40?左右为宜,马可稍高,也要根据不同个体的要求作适当调整。 10(用一块褶成四折的消毒纱布盖住假阴道入口,以防灰尘落入,即可准备采精。 (三)输精器材的准备 金属和玻璃制成的输精管、输精枪,最好用高压蒸汽消毒,在输精前最好将输精管用稀释液冲洗1~2次。 细管冷冻精液的输精器一般由金属外壳和里面的推杆组成。使用前金属外套应进行消毒,前端的金属套不能连续使用。使用时将细管的一端剪去,棉栓一端插在输精枪的推杆上,借助推杆推动细管中的棉栓即可将精液推出。 若采用开张器法输精,需对开张器先进行严格消毒方可使用。 四、实验报告 试述公羊假阴道的组成及安装时的注意事项。 实验四 精液品质的肉眼检查及精子活率评定 一、目的和要求 熟悉肉眼检查精液品质的方法;掌握评定精子活力的方法及 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 指标;验证外界因素对精子运动及生存能力的影响;掌握死活精子染色和制作抹片的方法。 二、材料和仪器 (一)精液 牛、羊、猪或兔等任一种动物的精液 (二)器械 显微镜,显微镜保温箱(或显微镜恒温台),载玻片,盖玻片,搪瓷盘,温度计,滴管,擦镜纸,纱布,有刻度试管,计数器 (三)药品 5%伊红和1%苯胺黑 三、内容和方法 (一)精液的肉眼检查 1.射精量 将采得的精液倒入有刻度试管或集精杯中,测其容量。各种家畜的射精量请参考教材。如果精液量过多或过少时, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 其原因。 2.色泽和气味 家畜的精液通常乳白色或灰白色,因畜种的不同而又浓淡的区别。马、猪的精液稀薄,呈灰白色;牛、羊的精液浓密,呈乳白色。家畜精液无味或略有腥味。 3.云雾状的观察 取原精液一滴于在载玻片上不加盖玻片,用低倍镜观察精液滴的边缘部分。可见牛羊的敬业翻腾滚动的云雾状态;猪马的精液无此现象。 (二)评定精子的活率 采精后立刻在25?左右的实验室内进行评定精子的活率,最好在37?保温箱内或加热的载物台上进行。在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。用玻璃棒蘸取一滴原精液或经稀释的精液(马、猪精液的精子密度低,不须稀释;而牛、羊精液的密度大,须用0.9%氯化钠溶液稀释,其温度须与精液密度相近)滴在洁净的载玻片上,盖上洁净的盖玻片,其间充满精液,不存留气泡。也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上。置于显微镜下,放大250~400倍检查。注意显微镜的载物台须放平,最好是在暗视野中观察。 精子活动有三种类型:直线前进运动、旋转运动和原地摆动。评价精子活率是根据直线前进运动精子数的多少而定。 目前评定精子活率等级的方法有两种: 十级制——在显微镜视野中估算直线前进运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级,90%者为0.9级,以此类推。 五级制——全部精子都呈直线前进运动,属于“5”级;绝大多数呈直线前进运动(约80%)为“4”级;前进运动精子略多于半数者(约60%)为“3”级;不及半数者为“2”级;呈直线前进运动的精子数目极少者属“1”级。 精子活率是精液品质评定的重要指标。受精能力与直线前进运动精子数的多少密切相关。新鲜精液的活率大于70%、冷冻精液解冻后的活率大于30%时,方可用于人工授精。 (三)外界因素对精子活率的影响 1(温度 (1)将采得的原精液在载玻片上滴一滴,先放在37? 显微镜下观察其活率,然后放在高温45~50?下2分钟观察精子活率的变化。 (2)将新采得的精液立即检查其活率后随即移入0~5?温度下放2~3分钟,然后把温度回升至37~38?后再检查精子活率,注意降温前后精子活率变化情况。 2(渗透压 观察原精液的活率后,分别在三滴原精液内分别加入1,氯化钠溶液、3,氯化钠溶液和蒸馏水,观察其活率及形态有何变化。 3(振荡 取1~2 ml稀释过的精液放入小试管中,检查其活率后,用手上下剧烈振动2~3分钟,再观察其活率有何变化。 4. 光照 取1~2 ml稀释过的精液放入小试管中,检查其活率后,经阳光直射10分钟后观察精子活率的变化。 5(化学药品 取3滴精液于载玻片上,用滴管分别滴入 2,煤酚皂液、1/1000新洁尔灭液和 75,酒精,观察其精子活率及形态有何变化。 (四)死活精子百分率测定 活精子头部是不易着色的,镜检时,精子头部是透明、无色的。而死精子则因伊红渗入细胞质,使整个精子头部呈红色。苯胺黑为背景染色,使着色的精子头部可见。 1.将5%的伊红和1%的苯胺黑按1:1混匀,分装于1~2ml容量的试管中(加入试管容量的1/2),并在37?水浴中加温,随后加入原精液1~3滴,摇匀后再放回水浴中,3分钟后立即取出待用。也可将染液预热后,将伊红、精液及苯胺黑按照1:1:1~2的比例及顺序滴入预热的凹玻片中混匀染色。 2.从以上混合液中用火柴棍沾上一小滴于载玻片的一端,用另一载玻片进行推动制成抹片,待干燥后,高倍镜镜检(400倍)。抹片时,最好在35~40?的条件下制作,而且制作过程要快。也可将制好的抹片放在37~38?保温箱内干燥30~60秒。 3.在高倍镜下数200或500个精子,其中分别数出死、活精子各占的百分率。活精子百分率总是要比精子活率高。 四、实验报告 将实验结果填入下表内。 处理前 活率评分 处理后 活率评分 37~38? 40~45? 降温前 降温后 加入1,NaCl溶液后 加入溶液前 加入3,NaCl 溶液后 加入蒸馏水后 振荡前 经剧烈振动 阳光照射前 阳光照射后 加2,煤酚皂液 加入药液前 加入1,1000新洁尔灭溶液 加入75,酒精后 实验五 精子密度测定 一、目的和要求 掌握检查精子密度的几种方法。要求学生熟练掌握血细胞计数方法,它是目前许多简单而实用方法的基础。 二、材料和仪器 (一)材料 牛、羊、猪或兔等任何一种家畜的新鲜精液 (二)器材 显微镜,血吸管,红细胞和白细胞吸管,血细胞计数室,载玻片,盖玻片, µl枪头,细乳胶管,5 ml试管,1 ml 移液枪及枪头 200 (三)药品 3%氯化钠,乙醚,95%乙醇,去离子水 三、内容和步骤 精子密度也称为精子浓度,指每毫升精液中所含的精子数。精子密度的大小直接关系到精液稀释倍数和输精量的有效精子数,也是评定精液品质的重要指标之一。评定方法一般有目测法和计数法。 (一)目测法 与检查活率的方法相同,往往与观察活率同时进行,只是精液不作稀释。 具体操作是取1小滴原精液在清洁载玻片上,加上盖玻片,使精液分散成均匀一薄层,无气泡存留,精液也不外流或不溢于盖玻片上,置于400~600倍显微镜下观察。根据精子密度的大小粗略分为密、中、稀三个等级。 “密”指整个视野内充满精子,几乎看不到精子间的空隙和单个精子的运动。 “中”指视野内精子之间相当于一个精子长度的明显空隙,可见到单个精子的活动。 “稀”指视野内精子之间的空隙很大,能容纳2个或2个以上精子。 这种评定方法带有一定的主观性,误差较大。另外,由于各种家畜精子密度相异较大,很难统一制定一个 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。此法只在基层人工授精站常用。 表1 各种公畜精子密度三级标准 密(亿/ml) 中(亿/ml) 稀(亿/ml) 10~20 8~10 牛 8以下 20~25 羊 25以上 20以下 1~2 猪、马 2以上 1以下 (二)计数法 1.血吸管计算 (1)清洗器械 吸 管:自来水 蒸馏水 95,酒精 乙醚 计数室:自来水 蒸馏水 白稠布擦干净备用 (2)精液稀释 ?用l ml移液枪吸3, NaCl 0.2 ml或2 ml,放入小试管中,用血吸管吸出10 µl或20 µl NaCl(根据稀释倍数确定)抛掉。 ?用血吸管将精液吸至刻度10 µl或20 µl处。 ?用纱布擦去吸管尖端所附的精液。 ?用姆指按住试管口,振荡2~3分钟使其均匀混合。 (3)精子的计数 ?将擦洗干净的血细胞计数室放于显微镜的载物台上,盖上盖玻片。 ?将试管中稀释好的精液滴一滴于计数室上面的盖玻片的边缘,使精液自动渗进计数室内。注意不要使精液溢出于盖玻片之外,并不可使精液不够而计数室内有现气泡或干燥之处,如有这些现象应重做。 ?静置2分钟便可在400~600倍的显微镜下检查。 ?计算计数室的四角及中央共五个中方格即80个小方格内的精子数。 ?计算每小格内的精子,只数格内及压在左线和上线者。 ?由五个中方格(80个小方格)所数到的精子数代入下式即得出每毫升的精子数。 每毫升内所含精子数=5个中方格内的精子数×400×10×1000×稀释倍数(确定精液稀释倍数时可按表2计算) 为了减少误差,必须进行两次计数,如果前后两次误差大于10,,应作第三次检查。最后在三次检查中取两次误差不超过10,,求出平均数,即为所确定的精子数。 血球吸管计算 介绍血球吸管的构造及各种家畜应该使用何种血球吸管(红血球吸管2. 或白血球吸管)。由于同学们在学习生理时已熟悉有关血细胞计数室的运用,故不再详述它的结构。 (1)清洗器械 吸 管:自来水 蒸馏水 95,酒精 乙醚 计数室:自来水 蒸馏水 白稠布擦干净备用 (2)精液稀释 ?牛、羊、鸡的精液(密度高)用红血球吸管:若将精液吸至“0.5”刻度处,然后再吸3% NaCl至“101”刻度,为稀释200倍。如将精液吸至“1.0”刻度处,再吸3% NaCl至“101”刻度,则为稀释100倍。 ?猪、马、兔的精液(密度低)用白血球吸管:若将精液吸至“0.5”刻度处,然后再吸3% NaCl至“11”刻度,为稀释20倍。如将精液吸至“1.0”刻度处,再吸3% NaCl至“11”刻度,则为稀释10倍。 (3)精子的计数 ?将计数室推上盖玻片。要求盖玻片被推上后以立起计数室不掉下来为原则,并且盖玻片在折光时可见到清晰的彩色条纹。 ?将盖好盖玻片的计数室置于低倍镜下观察,首先要求找到清晰的计数室。 ?用血球吸管吸精液,用药棉擦去吸管尖端外围附着的精液,并用3% NaCl稀释,因不同的家畜用不同的吸管稀释。 ?吸管吸好精液和3% NaCl以后,用拇指及食指堵住吸管两端进行来回的充分摇动混匀。然后弃去吸管中的前2滴,再将吸管尖端置于血球计数室和盖玻片交界处的边缘上,吸管内 的精液自动渗入计数室内,使之自然、均匀地分充满计数室。注意不要使精液溢出盖玻片,也不可因精液不足而使计数室内有气泡或干燥处,否则,应重新操作。静放2分钟,开始计数。 ?移到高倍镜下镜检和计数。首先数出四角和正中间的五个中方格中的精子数,也就是80个小方格中的精子数。载物台要平置,不能斜放,光线不必过强。计数时先数出四个角及中央的五个中方格中的精子数,然后用下列公式计算。重复次数同前。 每毫升原精液内的精子数=5个中方格内的精子数×5×10×1000×稀释倍数× X(如果是原精液不要דX”) 表2 血吸管或红、白血球吸管稀释精液的倍数 吸取时所达到的刻度 精 液 稀释管种类 稀释倍数 精 液 3,NaCl 0.5 101 200 红血球吸管 1 101 100 牛 羊 10 µl 199 µl 200 血 吸 管 20 µl 1980 µl 100 0.5 11 20 白血球吸管 1 11 10 猪 马 10 µl 190 µl 20 血 吸 管 20 µl 180 µl 10 四、实验报告 写出所得实验结果。 实验六 精子形态和畸形率的测定 一、目的和要求 由于所需时间等原因,无需对每次采精进行精子畸形率的测定。但应当每月对每一头种公畜进行一次畸形率的测定,以绘出精子畸形率变化图。畸形率突然增高,表明存在问题,应当查找和分析原因。畸形率在20,以内,牛18,,羊14,,猪18,,马12,以下时受精力一般不受影响。畸形精子一般不表现前进运动,因而随着畸形精子数增多,精子活率下降。如在检查精子运动力时,可观察到许多畸形精子,也需要进一步作形态学检查。 通过本实验,了解家畜精液中精子形态与精液品质的关系,掌握精子形态的分类和分析方法。 二、材料和器械 牛、羊、猪或兔等任何一种家畜的新鲜精液或冷冻精液 (一)材料 (二)器械 高倍显微镜,计数器,载玻片,盖玻片 (三)药品 0.5,龙胆紫酒精溶液 三、内容和步骤 畸形精子形态可分为头部畸形、尾部畸形和中段畸形三类。头部畸形的精子包括:窄头、头基部狭窄、梨形头、圆头、巨头、小头、头基部过宽、双头、顶部脱落等;尾部畸形精子包括:带原生质滴的精子(近端、远端)、无头的尾(它和无尾的头往往是一个精子的两部分,在分析时一般算作尾部的畸形)、单卷尾、多重卷尾、环形卷尾、双尾等;中段畸形的精子包括:颈部肿胀、中段纤丝裸露、中段呈螺旋状、双中段等。 (一)精子头部形态的观察(采用威廉氏染色法) 1.染料的制备 复红原液的配制:10 g复红溶于100 ml 95,的酒精中 复红染色液:复红原液10 ml +100 ml 5,的石碳酸(苯酚) 饱和伊红酒精溶液:1 g伊红溶于95,的酒精 美蓝溶液:10 g美蓝 + 1000 ml 96,的酒精 美蓝染色液:30 ml美蓝溶液,l00 m1 0.01, KOH过滤后再加入3倍量的蒸馏水混合后即可使用。 2.染色程序 ?先制作精液抹片,要求薄而均匀。然后风干或用酒精灯火焰固定。 浸入无水酒精中固定2~3 min,取出风干。 ? ?浸入0.5,氯胺T中l~2 min。 ?用清水洗1~2 min。 ?迅速通过96,的酒精,风干。 ?放人石碳酸复红染色液中l0~15 min,然后清水中蘸2次。 ?迅速通过美蓝染色液。 ?水洗后风干 经此方法染色后,精子头部呈淡红色,中段及尾部为暗红色,头部轮廓清晰。可在高倍 镜或油镜下观察200个精子计算出各类头部畸形精子的比例。 畸形精子百分率,畸形精子数/总精子数×100% (二)精子尾部形态的观察 1.福尔马林缓冲液的制备 将21.82 g NaHP0?2H0和22.25 g KHP0分别溶于500 ml24224蒸馏水中,然后取 200 ml NaHP0加80 ml KHPO配成缓冲液。再取该缓冲液100 ml加入24 24 62(5 ml 40%(v/v)福尔马林溶液,最后加蒸馏水至500 ml。 2.观察程序 ?l ml玻璃管中装入一些福尔马林缓冲液,置于37?恒温箱中备用。 ?根据原精液的浓度,向装有福尔马林缓冲液的小玻璃管中滴2~5滴精液并混匀。 ?取一滴上述混合液置于载玻片上,加盖玻片静止数分钟后在400倍的相差显微镜下观察精子尾部形态。随机观察200个精子计算各种尾部畸形精子所占的比例。 畸形精子百分率,畸形精子数/总精子数×100% (三)非精子有形成分的观察(采用苏木精—伊红染色法) 非精子有形成分多为精子形成过程中的某些退化物、生殖上皮的脱落物和血细胞等。这些成分在精液中出现的比例和类型在一定程度上能反映睾丸和精液排出管道的生理状态。在精液中经常出现的非精子有形物有白细胞、红细胞和鳞状上皮细胞等。 1.染料的配制 苏木精染液:2 g苏木精溶于100 ml无水酒精中,加入100 ml蒸馏水、100 ml甘油、3 g冰醋酸和10 g铝酸钾混合,放置14天后使用,用前需震荡。 伊红染液:l g伊红溶于100 ml 95,酒精,染色时取一定量的该溶液加入等量70,的酒精。 2.染色程序 ?先制备间断式的精液抹片(即当推制抹片时,不要一推到底,而要断续前推,使抹片厚度有一个梯度变化,染色后易于观察不同类型的精子成分),然后风干。 ?浸入无水酒精中固定3~5 min,风干。 ?分别浸入95,的酒精、75,的酒精和蒸馏水中各1 min。 ?浸入苏木精染色液中5 min。 ?浸入伊红染色液中 l min。 ?冲洗1~3 min。 ?通过70,和无水酒精,风干。 ?风干后用二甲苯加盖玻片封存。如不保存可直接观察。 经此方法染色后,细胞核染成蓝色,细胞质呈红色。在高倍镜(油镜)下观察各种非精子有形成分的量,估计它们所占的比例。 四、实验报告 绘出你所观察到的各类畸形精子。 实验七 精子顶体染色观察 一、目的和要求 顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因它能释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的粘合基质,使精子能够通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形,可导致受精率降低或者不受精。精子老化或损伤,会引起顶体帽破坏。精液冷冻解冻也会损伤一些精子,重要的是要准确知道受伤精子百分数。优质奶牛精液冷冻前,约90,精子具有完整的顶体。冷冻后下降至60,,65,。研究表明,顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间的相关性更强。因而,检查精子顶体完整率很重要。 本实验二人一组,要求学生学会精液抹片染色技术及比较正常精子顶体和异常精子顶体形态,计算精子顶体完整率。 二、材料和仪器 (一)材料 精液 (二)器材 酒精棉球,擦镜纸,移液枪,玻璃滴管,小镊子,pH试纸,玻璃棒,烧杯,小搪瓷盘,染色缸,卫生纸,玻璃平皿,切片盒,血球计数器,显微镜,镊子 (三)药品 Na2HPO4?12H2O ,NaH2PO4?2H2O,生理盐水,甲醛,MgCO3 三、内容和步骤 (一)试剂的配制 1(磷酸盐缓冲液 NaHPO?12HO 2.2 g 242 NaHPO?2HO 0.55 g 242 先用少量蒸馏水溶解,再用蒸馏水定容至100 ml。配制后用pH试纸测pH值,应为7.0,7.2。 2(福尔马林磷酸盐固定液 ?NaHPO?12HO 2.25g 242 NaHPO?2HO 0.55g 242 置于100 ml烧杯中,加入0.89,NaCl溶液约30 ml,使之溶解。 ?加入甲醛MgCO3饱和液8ml。 甲醛MgCO3饱和液配制方法:在500 ml福尔马林(40,甲醛)中加入8 g MgCO。此3饱和液必须在一周前配好。 ?用0.89,NaCl溶液少许冲洗装过甲醛的量筒置于容量瓶中,并定容至100 ml。此液配好后,第二天即可用。一般在室温下保存,其pH 为7.0,7.2。 3(Giemsa原液 按1 g Giemsa原料:66 ml甘油:66ml甲醇的比例配制。将Giemsa染料置于研钵中,先加入少量温热(60?)的甘油,充分研磨至无颗粒呈浆糊状。再将剩余甘油全部倒入,置56?恒温箱中保温2小时。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一个月后才能使用。此原液放置时间越长越好,但使用前需经过滤。 4(Giemsa染液(必须在染色前配制) 按Giemsa原液 : 磷酸缓冲液 : 蒸馏水的比例为2 : 3 : 5的比例配制。例如,做40个片子,每个片子需用2 ml染液。因此需配80 ml新鲜染液则分别取Giemsa原液16 ml、磷酸缓冲液24 ml、蒸馏水40 ml混匀即可。 (二)顶体染色步骤 烘先准备洁净的载玻片。用洗涤灵擦洗,清水冲洗,再用蒸馏水漂洗以不挂水珠为净,干或晾干备用。 1(抹片 将需测定的样品摇匀,取1滴中层精液平滴于载玻片的右端,取一块盖玻片,呈35?角自精液滴的左面向右接触样品,样品精液即呈条状分布在载玻片和盖玻片接触的边缘之间。将上面的盖玻片贴着平置的载玻片表面,自右向左移动,带着精液均匀地涂抹在载玻片上。切忌直接将精液滴“推”过去,人为造成精子损伤。在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号。每份精液样品需同时制作两个抹片。 2(风干 自然风干5~20 min。 3(固定 将风干的抹片平置于染色架上,用滴管吸取1 ml固定液滴于抹片上,并使固定液布满于整个抹片表面,静止固定15 min。 4(水洗 用玻片镊夹住抹片一端,将固定液弃去倒入染色缸或平皿内,在装有蒸馏水的烧杯中,上下左右摇晃涮洗,夹住松开镊子几次,取出抹片于磁盘边待干。 5(染色 将固定后的抹片平置于染色架上,用滴管吸取新配制Giemsa染液约2 ml,置于要染的玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上,使染液均匀布满在抹片上,静止染色90 min。 6(水洗 用镊子夹住染片,将染片上的染液弃去倒入平皿内,再换装有自来水的烧杯中冲洗,冲洗方法同上。经数次涮洗,直至水洗液无色为止。洗的过程中,若水已变蓝,则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边待干。 (三)精子顶体观察 将精液染片置于显微镜下,先用低倍镜找到精子,再换1 000倍下进行油镜观察。精子顶体呈紫色,包围精子头前部。 根据精子顶体完整和损伤与否,将精子顶体形态分为4种类型: 1(顶体完整型 精子头部外形正常,着色均匀,顶体完整,边缘整齐,可见微隆起的顶体嵴,赤道带清晰。 2(顶体膨胀型 顶体轻微膨胀,边缘不整齐,顶体嵴肿胀,核前细胞膜不明显或缺损。 3(顶体破损型 顶体破损,精子质膜严重膨胀破损,着色浅且不均匀,头前部边缘不整齐。 4(顶体全脱型 精子顶体全部脱落,精子核裸露。 根据以上4种类型分别统计,观察300个精子,并计算出精子顶体完整率。 精子总数×100, 精子顶体完整率,顶体完整型精子数/ 要求2张抹片精子顶体完整率差异不超过15,,求二者平均值。 一般精子冷冻前顶体完整率较高,如我国绵羊约44,,45,。解冻后1小时为25,。牛精子顶体完整率比羊高,猪比羊低。 四、实验报告 1(分析制片染色的质量。 2(观察并画出各种类型精子顶体形态。 3(计算精子顶体完整率。 实验八 稀释液配制及精液稀释 一、目的和要求 掌握稀释液配制的基本程序和操作方法及稀释精液的方法。 二、材料和器械 (一)材料 鸡蛋、原精液 (二)器材 250ml三角瓶,250ml烧杯,100ml量筒,感量为0.1克的天平,玻璃漏斗,电炉,石棉网,玻璃棒,定性滤纸,消毒纸巾,硫酸纸,灭菌牛皮纸,橡皮筋,10 ml一次性注射器,1 ml注射器,5 ml注射器,75%酒精棉球 (三)药品 葡萄糖,柠檬酸钠,青霉素,链霉素 三、内容和步骤 (一)玻璃用品的清洗与消毒 将所有玻璃用品用洗涤剂洗净,用稀盐酸浸泡并用自来水冲洗干净后,用蒸馏水冲洗4遍,空干水分,用锡纸将瓶口包好,放入120?干燥箱中干燥1 h,放凉备用。 (二)天平的标准 用两张圆形硫酸纸放在天平的左右托盘上,校准天平。 (三)称量药品 按配方需要的量准确称取药品,并放入大烧杯中。 (四)溶液配制 1(用量筒量取双蒸水100 ml,加入烧杯中,用磁力搅拌器或玻璃棒搅拌使其溶解。 2(用一层定性滤纸过滤溶液至三角瓶中。 3(在三角瓶上加牛皮纸盖并橡皮筋固定,放在盖有石棉网的电炉上加热至沸腾,迅速将其取下,放凉,制成基础液。基础液如果不马上使用可放入在2~5?冰箱中备用,保存时间不易超过12 h。 4(新鲜鸡蛋用75%的酒精棉球消毒外壳,待其完全挥发后,将鸡蛋磕开,分离蛋清、蛋黄和系带,将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内,并小心地将蛋黄倒在用4层对折(8层)的消毒纸巾上。小心地使蛋黄在纸巾上滚动,使其表面的稀蛋清被纸巾吸附。先用针头小心将卵黄膜挑一个小口,再用去掉针头的10 ml的一次性注射器,从小口慢慢吸取卵黄,尽量 避免将气泡吸入,同时应避免吸入卵黄膜。吸取10 ml后,再用同样的方法吸取另一个鸡蛋的卵黄。也可将卵黄移至纸巾的边缘,用针头挑一个小口,将卵黄液缓缓倒入量筒中,注意避免将卵黄膜倒入量筒中。 5(卵黄液与基础液的混合 取80 ml放凉的基础液,加入三角瓶中,然后将卵黄液注入或将卵黄液从量筒中倒入三角瓶中,将量取的80 ml基础液反复冲洗量筒中的卵黄,使其全部溶解入基础液中,然后将全部的基础液倒入三角瓶中摇匀。 6(加入抗生素 分别用1 ml注射器吸取基础液1 ml,分别注入80万单位和100万单位的青霉素和链霉素瓶中,使其彻底溶解。分别从青霉素瓶中吸取0.1,0.12 ml和链霉素瓶中吸取0. 1ml,将其注入三角瓶中并摇匀。还可称取0.1克的青霉素和0.1克的链霉素加入三角瓶中摇匀。用基础液、卵黄液和抗生素混合制成第一液。 7(第二液的制作 用量筒量取第一液47 ml,加入另一只三角瓶中,用注射器吸取3 ml消毒甘油,注入三角瓶中摇匀,制成羊冷冻精液的第二液。 表1 羊精液稀释液推荐配方 低温(2~5?)保存液 冷冻保存液 葡萄糖(一水) 3.3 g 8.8 g 基础液 柠檬酸钠(二水) 1.4 g ~ 双蒸馏水 100 ml 100 ml 低温保存基础液 80 ml 80 ml 或第一液 卵黄 20 ml 20 ml 第一液 47 ml 第二液 甘油 3 ml 表2 牛精液细管冷冻精液稀释液推荐配方 11%乳糖或12%蔗糖 73 ml 卵黄 20 ml 甘油 7ml 青霉素 10万单位 链霉素 10万单位 四、实验报告 简述基础液、低温保存稀释液、冷冻保存稀释液的制作方法。 实验九 家畜精液的冷冻 一、目的和要求 了解精液冷冻保存技术的操作工艺流程,基本掌握冷冻精液的制作技术和解冻技术。 二、材料和器械 (一)材料 新鲜猪、牛精液,鸡蛋 (二)器具 液氮罐,铝饭盒,保温瓶,温度计,镊子,聚四氟乙烯板或铜纱网,滴管,封口粉烧杯,量筒,三角烧瓶,纱布,棉花,显微镜,载玻片,盖玻片,天平 (三)药品 葡萄糖,蔗糖,柠檬酸钠,甘油,青霉素,链霉素 三、内容和步骤 (一)猪精液的冷冻保存 l(配制葡萄糖、卵黄、甘油稀释液 8,葡萄糖 77 ml 卵黄 20 ml 甘油 3 ml 青霉素 500- 1000 IU/ml 2(配制解冻液 葡萄糖 5 g 蒸馏水 l00 ml 3(稀释与冷冻 取活率在0.7以上的新鲜猪精液,用等温的稀释液以1:2稀释后,包以 10~12层纱布,放在8?条件平衡3.5~6 h,作一次稀释并进行颗粒冷冻。即用一被隔热保温层包裹的金属容器或铝饭盒盛满液氮,用聚四氟乙烯塑料板作为冷冻板,固定在距液氮面1~2 cm处。待降温恒定后,以滴管将经平衡后的精液(其活率不低于6)滴在冷冻板上。每 ml。当冷冻板上的精液颗粒由黄转白而有光泽、轻拨易脱离冷冻板时,即个颗粒体积为0.1 可收集起来,分装后作标记,保存在液氮罐内。 4(解冻、镜检和保存 取1~1.5 ml解冻液,放人小试管内,在40?热水中经2~3 min后,投入颗粒冷冻精液一粒,待溶化1/2时取出精液试管。当精液全部溶化后,检查评定精子活率。凡解冻后活率不低于0.3者为合格,即可将收集于纱布袋内的颗粒冷冻精液,作好标记浸泡在液氮内保存。 (二)牛精液的冷冻保存 1(配制葡萄糖(蔗糖)、卵黄、甘油稀释液 12,蔗糖液 75 ml 卵黄 20 ml 甘油 5 ml 青霉素 1000 IU/ml 链霉素 1000 IU/m1 2(配制解冻液 柠檬酸钠 2.9 g 蒸馏水 100 ml 3(颗粒冷冻 (1)采精 用假阴道采取公牛精液,保存在30?保温瓶中。 (2)镜检 在37?条件下检查原精液,精子活率不低于0.7,密度为8亿,ml以上,畸形率不超过18,者方可冷冻。 (3)稀释 用与精液同温的稀释液作2~5倍稀释。 (4)平衡 将稀释后的精液用纱布包裹放入冰箱冷藏室内,缓慢降温至0~5?,在此温度下平衡2~4 h。 (5)镜检 在37?条件下检查平衡后的精液,活率不低于0.6为宜。 (6)滴冻 用滴管吸收平衡后的精液,滴在用液氮冷却的聚四氟乙烯板(或铜网或铝饭盒,距离液氮2~3cm),制成0.1 ml剂量的颗粒冷冻。滴冻要求快速、均匀,滴冻结束应使精液颗粒停留3~5 min,待颗粒由黄变白,就可收集颗粒。 (7)贮存 将颗粒冷冻精液收集到青霉素瓶或纱布袋内,作好标记,投入液氮罐中保存。 (8)解冻 在l ml 试管内装入2.9,柠檬酸钠解冻液,放入40?温水浴中,随后取1~2粒颗粒冷冻精液投入试管中,立即轻摇动直至颗粒溶化再取出试管,取样检测其活率。解冻后精子活率不低于0.3为合格冻精。 4(细管冷冻 采精至镜检过程同颗粒冷冻。 (1)装管 多用0.25 ml或0.5 ml塑料管,在5?下用精液分装机分装,用封口粉封口,平衡后冻结。 (2)冷冻 同上述颗粒冷冻法,将细管摆放在铜网上,停留5 min左右,即可收集。 (3)贮存 将细管收集到纱布袋里,投入到液氮罐内。 (4)解冻 直接投入35~40?温水中,精液融化到一半时取出备用。 四、实验报告 1(评定冷冻精液解冻后的活力。 2(简述提高精液冷冻保存效果的措施。 实验十 卵母细胞的采集 一、目的和要求 了解卵母细胞的采集方法,掌握超数排卵和屠宰后母畜卵巢上吸取卵细胞的方法和检卵技术。 二、材料和器械 (一)材料 牛、羊卵巢,5~6周龄昆明白系雌性小鼠 (二)器材 培养皿,切割刀片,注射器,实体显微镜,吸管(玻璃管特制),无菌滤纸,纱布,镊子 (三)药品 生理盐水或mPBS,抗生素,70,酒精、矿物油 三、内容和步骤 (一)卵母细胞的采集 卵母细胞的采集方法通常有三种。 l(超数排卵 雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后,从输卵管中冲取成熟卵子。这种 小鼠,大鼠和家兔等实验动物,而对大家畜来说,由于操作程序复杂,成本采卵方式多用于 较高,很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间,一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。 ?取5~6周龄昆明白系雌性小鼠,间隔48 h分别腹腔注射5~10 IU PMSG和hCG。 ?hCG注射后15 h处死、摘取卵巢、输卵管及子宫置于含有mPBS液的表面皿中,在实体显微镜下,小心剔除附着的脂肪和系膜。 ?用mPBS液冲洗3遍后,用眼科小镊子将输卵管膨大部撕破,以回收卵丘卵母细胞复合体。 ?用0.1,透明质酸酶处理,脱去卵丘细胞,得到裸卵。还可将卵巢上的卵泡刺破,获得 未成熟卵母细胞。 ?冲卵液和卵子置于37?恒温台上保存。 2(从活体卵巢中吸取卵母细胞 这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。在家畜中,绵羊和猪等小家畜常用腹腔镜取卵。牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵,其方法是用手从直肠把握卵巢,经阴道壁穿刺插入吸卵针。借助B型超声波图像引导,吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平,一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中,活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义。 3(从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞 这种方法是从屠宰母畜体内摘出卵巢,经洗涤,保温(30~37?)后,快速运回实验室,在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞。也可对卵巢进行切割,收集卵母细胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期),需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。这种方法的最大优点是材料来源丰富,成本低廉,但确定母畜的系谱困难。其具体操作方法如下:卵巢从畜体摘取后需放人含有生理盐水或PBS的保温瓶中,抽吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤,所用溶液都要添加抗生素。然后取卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞,牛3~10 mm卵泡,绵羊3~5 mm,猪3~6 mm。 (1)抽吸法 将擦净的卵巢用鼠齿镊子纵向左右对夹固定,用装有12号针头的l ml注射器吸取少量生理盐水,从卵泡的边缘侧向插入,依次吸收每个一定直径的卵泡的卵泡液,最后将抽吸物注入培养皿内备用。 (2)切割法 将擦净的卵巢用鼠齿镊子固定于倒扣的培养皿(直径为6 cm)上,用切割刀片将其从门部纵切为两半,去除黄体及多余脂肪组织,平铺于培养皿上,以1.5 mm间隔纵横切割,然后用生理盐水或PBS冲洗卵巢,将冲洗液静置,弃去上清液备用。 (二)卵子形态结构观察 将回收的卵子用mPBS洗净后,移入新鲜的覆盖有矿物油的100 μl mPBS液滴中,在4×10倍以上实体显微镜下进行卵子形态结构观察及质量鉴定。 1(卵子的结构 正常卵子呈球形,其结构包括放射冠、透明带、卵黄膜和卵黄等部分。无论用何种方法采集的卵母细胞都要求卵母细胞形态规则,细胞质均匀,卵母细胞不能发黑或透亮,外围有多层卵丘细胞紧密包围。 2(卵子形态和质量鉴定 目前对卵子的质量鉴定基本上采用形态学的方法。 (1)卵丘卵母细胞复合体 卵子周围的卵丘细胞层的致密程度和卵子形态学特征进行质量评价。在家畜体外受精研究中,常把未成熟卵子分成A、B、C、和D四个等级。 ?A级 多层致密的卵丘细胞附着在卵子周围,在显微镜下卵母细胞和卵丘细胞都明亮。 ?B级 要求卵子的细胞质均匀,卵丘细胞层低于三层或部分卵丘细胞脱落。 ?C级 没有卵丘细胞包围的裸露卵子。 ?D级 卵子周围卵丘细胞间呈放射状散开。 (2)卵母细胞 ?正常卵子 呈圆球形,外周有一圈折光性强且发亮的透明带,轮廓清晰,细胞质均匀,色泽和透明度适中。成熟卵母细胞的卵黄周隙中可见第一极体。 ?异常卵子 凡是椭圆形或扁形的、有大型极体的、卵黄内有大空泡的、体积过大或过小的、异常卵裂、透明带破裂或收缩、变形、细胞质颜色发暗卵黄膜边缘粗糙、轮廓不清晰、空透明带等都属于畸形卵子。 四、实验报告 1、卵母细胞采集方法有哪几种?其优缺点是什么? 2、将观察到的卵丘卵母细胞复合体、成熟卵母细胞和未成熟卵母细胞绘图并加以说明。 实验十一 兔的超数排卵、早期胚胎观察及移植 一、目的和要求 通过实验了解促卵泡素,孕马血清促性腺激素,人绒毛膜促性腺激素的作用。了解卵子的正常和异常形态结构,认识受精卵和未受精卵之区别,初步掌握冲卵和检卵技术,为掌握胚胎移植技术奠定基础。 二、材料和器械 (一)动物 4只供体母兔,6 只受体母兔, 2~3只公兔 (二)器具 玻璃注射器,兔用手术台,创巾,止血纱布,药棉,缝合针和线,移卵管,实体显微镜 (三)药品 FSH,PMSG,HCG,75,酒精,0.9, NaCl,碘酒,新洁尔灭液,冲卵液,麻醉药 三、内容和步骤 一)供体兔超数排卵处理 ( 1(FSH处理组 先用碘酒棉球消毒母兔颈部皮肤,每只每次颈部皮下注射FSH 10~15 IU或0.15 mg,连续注射6次,每次相隔10~14 h,总量为0.9 mg/只,最后一次注射FSH后,从耳静脉注射(先用酒精棉球消毒耳朵边缘)hCG 75 IU,随即放入公兔笼内,观察是否配种。一般来说,超排处理后,母兔阴部表现出发情症状,能成功地配种。 2(PMSG处理组 母兔颈部皮肤消毒同上。于皮下一次注射PMSG 150 IU。之后48~72 h,同上述方法注射同量的hCG,随即放入公兔笼内。 3(对照组 颈部皮下注射生理盐水,其他处理同上。 (二)手术冲胚方法 供体注射hCG,并与公兔交配后24 h、36 h或48 h进行冲胚。 1(耳静脉注射10 ml空气处死供体母兔。如做活体手术,则用麻醉药麻醉后再按外科手术要求打开腹腔。 2(将把母兔背朝下放固定于兔手术台上。 3(在母兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛,用沾满肥皂水的纱布清洗局部,再用剃须刀刮毛,先后分别用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒,然后盖上创巾并固定好。 4(用手术刀在腹中线处皮肤切开2~3 cm长的术口,再在腹壁肌白线上切一小口,用中指垫着以手术剪扩大术口。活体冲卵时,要注意止血,随时用温生理盐水保温术口。 5(打开腹腔后,沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。与卵巢下脂肪组织处,以长夹夹注以固定卵巢。仔细观察卵巢的变化,记录排卵点(卵巢排完卵后的小红点)。 6(先在卵巢附近找到输卵管的伞,从伞部插入冲卵管并用手指或夹子固定,另一端接表面皿。另一个人用10 ml注射器配制9号针头吸一管冲卵液(可用生理盐水代替)。从子宫向输卵管方向,与子宫角末端和输卵管交界的无血管处插入针头,使针头伸入输卵管内并用手指固定。然后慢慢地推动注射器,将冲卵液注入输卵管,使冲卵液由伞部收集到表面皿内。一般每次5 ml即可。注意冲卵液不得流失。 (三)早期胚胎观察 将接有冲卵液的表面皿置于实体显微镜下,检查胚胎的数量和发育形态。正常兔的受精卵是卵圆形,直径为140 μm,在透明带外围有一厚层黏蛋白层(兔胚胎特有结构)。卵黄颗 粒很细,分布很均匀,容易看到核的变化。在卵黄周隙内可见2个极体。而未受精的卵母细胞中,粗细不一的卵黄颗粒清楚可见,且分布不均,不能看到细胞核,在卵黄周隙内只有一个极体。一般在交配后24 h,受精卵已发育成2-细胞胚胎,48 h即发育成16-细胞胚胎(早期桑葚胚)。 (四)胚胎移植 1(受体的选择 选择与共同发情时间一致(发情时间相差不易超过一天)的受体(自然发情或超排处理诱发发情)。 (保定、麻醉、开腹手术 参照供体处理方法。 2 3(胚胎分装 先向输卵管内吸进少量PBS,接着吸入一点空气,然后再将胚胎连同少量PBS吸入,接着再吸入一点空气和PBS,在移卵管尖端保留一段空隙,这样就可防止胚胎丢失。 4(移植部位 将胚胎移入排卵侧的生殖道内。凡从供体输卵管内得到的胚胎应移植到受体输卵管内。从输卵管的伞部插入移卵管2~3 cm深,轻轻地注入胚胎,最后慢慢地抽出移卵管。一般一侧输卵管可移植5~10枚胚胎。如从供体子宫收集的胚胎也应移植到受体母兔相应得部位。 5(缝合 按外科手术要求分别缝合肌层和皮肤,并进行消毒。注意手术后供体和受体的护理。 *杜氏PBS冲卵液的配制(100 ml) NaCl 0.8 g KCl 0.02 g MgCl?6HKHPO 0.01 g 2224 KHPO 0.02 g 24 NaHPO?12HO 0.2903 g 42 葡萄糖 0.01 g 丙酮酸钠 0.0036 g CaCl(单独用少量蒸馏水溶解后加入) 0.01 g 2 BSA 0.4 g 四、实验报告 简述实验过程和结果,根据结果进行分析。 实验十二 小鼠超数排卵及早期胚胎质量鉴定 一、目的和要求 hCG)对卵巢机能通过实验了解孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(的作用。掌握超数排卵方法和早期胚胎质量鉴定,充分认识正常与异常胚胎的形态结构及等级划分标准,为家畜超数排卵和胚胎移植打下良好的基础。 二、材料和器械 一)动物 5~6周龄供体昆明白系雌性小鼠,成年公系小鼠与之1:1配比 ( (二)药品 PMSG,hCG,75,酒精,冲胚液mPBS,矿物油 (三)器材 一次性注射器,镊子,剪刀,表面皿,巴氏吸管,直径为35 mm的培养皿,实体显微镜 三、内容和步骤 (一)小鼠超数排卵及胚胎采集 取5~6周龄昆明白系雌性小鼠,间隔48 h分别腹腔注射10 IU PMSG和hCG,hCG注射后与性成熟公鼠合笼,次日检查阴道栓,有栓小鼠在注射hCG后72~84 h处死,摘取子宫,在实体显微镜下,用含有mPBS液的1 ml注射器将子宫置于表面皿中冲洗3遍,以回收桑葚胚及早期囊胚。冲胚液和胚胎放在37?恒温载物台上保存。 (二)胚胎质量鉴定 将回收的胚胎用mPBS液洗净后,移入新鲜的盖有矿物油的100 μl mPBS液滴中,在40倍以上的实体显微镜进行胚胎质量鉴定。 1(胚胎的级别划分 目前对胚胎的质量鉴定基本上采用形态学的方法,将胚胎分为A级、B级、C级和D级4个级别。其中A级和B级胚胎为移植可利用胚。 (1)A级 胚胎发育形态正常,轮廓清晰,卵裂球大小均匀、致密、整齐、清晰,色泽和透明度适中,发育速度与胚胎龄相一致。 (2)B级 轮廓清晰,色泽适中,卵裂球密度和大小良好,但稍有不均,有个别卵裂球游离,发育速度与胚胎龄相一致。 (3)C级 轮廓不清晰,色泽发黑,卵裂球不十分匀称,结构松散,变形,发育较慢。 (4)D级 卵裂球多数变形、异常,发育缓慢。 2(异常胚胎 异常胚胎指胚胎体积过小、过大、呈椭圆形、扁形、带有大型极体,细胞内有大气泡,透明带破裂、收缩,卵裂球色泽发暗、界限不清、个别萎缩、边缘变得粗糙,空透明带,在透明带内无一定结构的变性胚胎等。 3(未受精卵 呈圆球形,外周有一圈折光性强且发亮的透明带,中央为质地均匀色泽较暗的细胞质,透明带和卵黄膜之间的间隙很小甚至看不到。 四、实验报告 将观察到的不同发育阶段的正常胚胎、异常胚胎或未受精卵绘图并加以说明。 实验十三 哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存 一、目的和要求 掌握哺乳动物早期胚胎以常规和玻璃化两种冷冻及解冻的基本操作方法,为今后从事胚胎工程研究方面工作奠定基础。 二、材料和器械 (一)材料 小鼠早期胚胎 (二) 器械 实体显微镜,酒精浴胚胎冷冻仪,液氮罐,培养皿,镊子,0.25ml冷冻细管,开放式拉管,注射器 (三)药品 mPBS,甘油,蔗糖,FCS,TCM l99,解冻液 三、方法和步骤 (一)常规冷冻法 首先将胚胎装入防冻液中平衡一定时间,然后装管,再降温到一定温度后投入液氮中保存。具体步骤如下: l(防冻液中平衡 (1)防冻剂 胚胎冷冻前,必须加入防冻剂,以防冷冻休克和因渗透压剧变而引起胚胎的死亡。常用的防冻剂有甘油、乙二醇、丙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二甲亚砜(DMSO)等。不同种类防冻剂及其浓度不同,对动物胚胎存活效果不一样。 (2)防冻剂添加方法 胚胎冷冻前必须在防冻液中平衡一定时间。由于防冻液为高渗液, 胚胎进入防冻液中后,水分子渗出胚胎的速度比防冻液渗入快,胚胎因失水收缩,随着时间的推移和防冻剂的逐渐进入,最终达到渗透压平衡。本实验采用分两步将胚胎加入到最终浓度的防冻液中去,目的是防止溶液效应对胚胎的损害。选择形态好的囊胚(A、B级)用PBSS液冲洗两遍,然后放人含有1.4 M甘油+0.25 M蔗糖的PBSS液中,平衡10 min,在此期间进行装管。方法是在细管中依次吸取冷冻液—气泡—含胚冷冻液—气泡—冷冻液,然后封口。 2(胚胎的降温,植冰和冷冻 装管后将细管投入,7?的酒精浴胚胎冷冻仪中,停留5 min后植冰。植冰是从水相向冰相转变的过程。即用预先在液氮内冷却的眼科镊子尖部,夹住细管的棉栓部,瞬间使抗冷冻液产生冰晶(见细管上出现霜),就立即移开镊子,完成人工植冰过程。 胚胎的抗冷冻液中—旦冰晶形成后,就要缓慢给胚胎降温,以保证它们等渗式地细胞内液高浓度,即使降温至液氮相同的温度,胞质内也不会有冰晶形成。然后以0.3?/min降温至,30?~,35?时,不直接投入液氮中,而在液氮气中熏蒸数分钟,使其缓慢通过玻璃化转相温度,然后再投入液氮中冷冻效果较好。 3(胚胎的解冻 用缓慢方法冷冻的胚胎(缓慢降温至,60?)需缓慢解冻,在较高温度(,30?~,40?)投入液氮的胚胎需迅速解冻才能获得最高的存活率。因为,从,30?~,40?投入液氮的胚胎仍含有残留水分,缓慢升温解冻时,可能使其玻璃化或再结晶,引起细胞内严重损害,只有迅速解冻才能避免再结晶的发生。所以,从液氮中取出冷冻细管,在空气中停留10 S(研究发现,在空气中解冻或暴露于空气中6 S再在水中解冻,对胚胎透明带的损害最小),然后投入,30?~,35?水浴中,待冰晶全部融化为止。 4(防冻液的去除 将含防冻剂的胚胎直接移植给受体,妊娠率极低。必须将防冻剂以浓度递减的方法脱除以后才能移植。将细管一端剪断,含有胚胎的冷冻液置于培养皿中,迅速将胚胎移人含有0.25 M蔗糖的PBSS中,在室温下保持5 min以去除防冻液,然后移人PBSS液中保持5~10 min,再观察胚胎恢复情况。 (二)玻璃化冷冻方法 玻璃化冷冻是指高浓度溶液在降温过程中形成一种类似玻璃的固体化过程。这个过程需高浓度的防冻剂和快速降温,以便细胞内外的成分同时玻璃化而不形成冰晶,从而达到不损伤胚胎的目的。下面介绍开放式拉管冷冻法(OPS,Openpulled Stram)。 1(冷冻 将待冷冻胚胎用添加20,FCS的TCMl99液洗2遍后放入玻璃化冷冻液(I7.5,乙二醇+7.5,DMSO+20,FCS+TCM l99)中平衡3 min,然后用加样器吸取1~2 μl冷冻液I,同时吸入胚胎,放入20 μl的玻璃化冷冻液?中,用加样器迅速混匀,再吸取胚胎连同 2 μl冷冻液?放入另一培养皿中,做成含有胚胎的2 μl 冷冻液?小滴,用事先拉好的冷冻细管通过毛细管自身吸力将2 μl冷冻液?及胚胎一起吸入。胚胎从进入冷冻液?到装管完成的时间控制在25 S以内,若装管提前完成,待胚胎在冷冻液?中停留至25 S后再投入液氮内。上述操作在39?条件下完成。 2(解冻 (1)从液氮中取出细管在空气中停留3~4 S。 (2)冷冻管的细端插入解冻液I(0.3M蔗糖十TCM l99十20,FCS)中,用右手手指堵住粗的一端,利用手指温度驱使胚胎进入到解冻液 I中。 (3)停留60 S后移入解冻液?(0.15 M蔗糖十TCM l99十20,FCS)中平衡5 min。 (4)然后再移入保持液(TCM l99十20,FCS)中平衡5min,就可以装管移植或培养了。上述解冻过程均在37~38?的条件下进行。 四、实验报告 1(评定解冻后胚胎质量。 2(试述提高冷冻保存胚胎效果的措施 第二部分 教学实习指导 实习一 公牛和公羊生殖器官的检查 一、目的和要求 掌握公畜生殖器官的活体检查的内容和步骤,练习检查的具体方法。 二、材料和器械 (一)材料 公牛或公羊(为了安全起见一般选用公羊) (二)器械 测量阴囊周围径用的卷尺,保定架,保定绳 (三)药品 润滑剂 三、方法和步骤 一)睾丸形状和阴囊皮肤的检查 ( 对睾丸外形观察时,观察者应站在公畜的后方。正常的应下垂于阴囊,左右对称,有明显的颈部(精索部分)附睾尾突出。阴囊皮肤相对其他部位薄而柔软,被毛短而稀疏。检查时阴囊是否有损伤、皮炎症、阴囊疥廯(公羊常见)等。发现阴囊有结痂时,要进一步检查损伤的范围和深度。 (二)睾丸大小的测量 对公畜采取站立保定,测量者蹲于后部。一只手轻握精索部位,使两只睾丸垂入阴囊,并使其不能上下移动。另一只手将一环形钢卷尺套在阴囊的最粗部位,垃紧卷尺使之紧贴于阴囊的表面,然后读出阴囊的最大周径。公畜的阴囊最大周径与精子的产量有很高的关系,周径越大,生精的能力则越强。 (三)睾丸质地的检查 睾丸的硬度和弹性是睾丸实质部曲精细管发育情况和充实度的客观反映。与睾丸的生精机能和精液的品质有密切的关系。在检查时,可将睾丸的硬度分为很硬、硬、软、很软和弹性分为弹性强、弹性适中、弹性差、无弹性。操作时,一只手将睾丸轻轻固定,另一只手的拇指和食指按压睾丸实质部位。比较和判断硬度和弹性的强弱。同时,也要注意到睾丸各部位是否有硬块、缺损、水肿、萎缩等异常现象。 (四)附睾尾的检查 附睾尾是睾丸所产生精子的贮库,在一定程度上反映睾丸的生精机能。检查时,注意其大小、触摸其充实程度,同时也要注意到附睾尾在某些情况下的易位、缺损等情况。 (五)对睾丸其他部位的检查 附睾头和附睾体是不易感觉的地方,但也应仔细触摸,检查其有否肿块、硬块、精液滞留或破损的情况。 (六)阴茎和包皮的检查 最好在假阴道采精时,当阴茎勃起从包皮内伸出时,对阴茎进行观察。对公牛还可以有一名助手通过直肠对精囊和壶腹进行按摩。这种刺激可使阴茎部分勃起并伸出包皮之外,检查者可顺势用一块消毒纱布裹住阴茎头,稍稍用力将阴茎拉出,以便观察。在观察时要注意 阴茎和包皮之间是否有粘连、破裂或损伤的现象,阴茎是否光滑、有无结节、赘生物、血肿、囊肿,阴茎有无弯折和偏离的现象。 (七)副性腺的检查 一般只对公牛做这项检查。通过直肠对精囊腺和输精管壶腹进行按摩。精囊腺起始于骨盆尿道肌的前缘,是成对分叶状腺体。形状不很规则,一般长8~15 cm,宽4~6 cm,厚1.5~2 cm,可见有一侧缺损、发育不全或不对称等异常情况,有时会出现明显的炎症反应。 公牛的输精管壶腹位于精囊腺的两个分叶之间,一般长15 cm,直径0.5 cm左右,个别公牛可能出现一侧缺损或不对称等异常情况。 在检查时,对公牛鼠蹊管内环也应给与应有的注意,沿输精管壶腹可以摸到这一管口,一般以深入二指为宜,过大易引起鼠蹊合尔尼亚。 四、实习报告 记录检查结果,分析该公畜生殖器官的生精机能。 五、实习提示 先由教师示范并作讲解,随后分组练习,要特别注意人畜安全。 实习二 母畜的发情鉴定 一、目的和要求 1(掌握母畜发情鉴定的各种方法,判断输精或配种时间。 2(掌握牛直肠检查的基本操作方法。 3(熟悉母牛生殖器官各部分的自然位置、形状、质地及相互关系,为通过直肠检查鉴定母畜发情状态、妊娠及生殖器官疾病诊断奠定基础。 4(主要掌握直肠检查要领、触摸卵巢的方法及卵巢的形态、大小等感觉,掌握子宫的触摸方法。 二、材料和器械 (一)材料 母畜(牛、羊、马、猪)、试情公畜 (二)用具 六柱栏或保定架,开腔器,手电筒,脸盆,毛巾,肥皂,长臂手套 (三)药品 凡士林,70,酒精,消毒液 三、方法和步骤 一)外部观察法 观察母牛、母羊、母猪、母马、母驴的外部表现,凡有下列行为表( 现者,即可判定发情。 l(发情母牛表现不安,哞叫,接受其他母牛嗅闻阴门和爬跨,并拱腰站立不动,食欲减退,乳量减少,尾巴不时摇摆和高举。放牧时,不安,到处走动,阴道流出蛋清样黏液。 2(发情母猪食欲剧减甚至废绝,在圈内不停走动,碰撞、骚扰,爬墙,拱地,啃嚼门闩,企图外出,既爬跨其他母猪,也接受其他母猪爬跨,按压臀部时出现静立反射。 ’3(发情母马常嘶叫不安,竖耳,扬头,注意附近母马尤其是公马,以臀部在墙壁、柱于 或槽边摩擦,频频排尿,从阴道流出蛋清样黏液。 4(发情母驴除有母马表现外,头颈伸直,两耳后伏,嘴大张、不断开闭,发出“叭嗒”声,有时流出涎水,用手指掐腰和薯甲时,“叭嗒”嘴、张口更为强烈。 5(发情母羊表现不安,不停摇尾,食欲减退,反刍停止,高声呜叫,用手按压臀部,摇尾,放牧时常离群。这些发情表现,在山羊比绵羊更为强烈。 (二)试情法 l(母马的试情 群牧马采用试情法时,可把结扎输精管或施行阴茎转向术的公马放人群内。未发情的母马对公马有踢咬、躲闪等防御表现。发情的母马会主动接近公马,后腿叉开,举尾,频频排尿,接受公马爬跨。 2(母猪的试情 母猪的发情鉴定以外部观察法为主。用试情公猪试情时,发情母猪表现两耳竖起,痴呆静立,凝视公猪。因发情母猪对公猪的爬跨敏感,故也可采用压背法鉴定发情。用手按压母猪背部,如母猪表现静立不动,向人身靠拢,尾巴翘起,即所谓的“静立反射”,说明母猪已到发情盛期。母猪发情时,对公猪的气味和叫声反应敏锐,故可将公猪尿液或包皮冲洗液向母猪舍喷雾,也可在母猪群播放公猪求偶的录音,通过观察母猪的反应来鉴定其是否发情。 3(母羊的试情 羊的发情鉴定主要采用试情法。试情时,将戴有试情兜布或结扎输精管的试情公羊按公、母l:40的比例,每天1次或2次放入母羊群中试情。凡接受公羊爬跨者即为发情母羊。在大群母羊试情时,为了更好地鉴定发情羊,可在试情公羊的胸腹部涂抹颜色,当母羊发情接受公羊爬跨时,母羊尻部便印有颜色,便于识别。 (三)阴道检查法 1(检查前的准备 (1)母畜保定 根据现场条件和习惯,利用绳索、三角绊或六柱栏保定母畜,并将尾毛理齐,拉向一侧前方。 (2)外阴部洗涤和消毒 先用清水、肥皂水或2,~3,苏打水等洗净外阴部,再用l,新洁尔灭溶液消毒,最后用消毒纱布或酒精棉球擦干。在洗净或消毒时,应先由阴门裂开始,逐渐向外扩大。 (3)开膣器消毒 用75,酒精棉球消毒开膣器内外面,或用火焰烧灼消毒,亦可用消毒液浸泡消毒,然后用40?温开水冲去药液,趁其湿润时使用。 2(检查步骤 (1)用左手拇指和食指或中指开张阴门,以右手持开膣器把柄,使开膣器闭合,与阴门相适应,向前斜上方插入阴门,当开膣器的前1/3进入阴门后,即改成水平方向插入阴道,再旋转开膣器,使其把柄向下。 (2)轻捏把柄,撑开阴道,用手电筒或反光镜照明阴道,迅速观察。 (3)观察阴道黏膜的色泽及湿润程度,子宫颈部的颜色及形状,黏液的量、黏度和气味,以及子宫颈管开张程度。判断发情的依据有阴唇肿大,开膣器容易插入,阴道黏膜充血,光泽滑润,子宫颈口松软而开张,有黏液流出,可判定为母畜发情;阴门紧缩,有皱纹,插入开膣器时感觉干涩,阴道黏膜苍白,黏液呈浆糊状或很少,子宫颈口紧缩,可判定为母畜未发情。 (四)直肠检查法 l(检查前的准备 (1)将被检母畜在六柱栏内保定,亦可用绳索保定。用绳索保定的作法是将绳索一端圈套系于被检母畜的颈部,然后使绳索通过后肢后飞节之上,另一端打活结拴系于颈部绳环上。 (2)将被检母畜的尾巴推向一侧。对于马,应收拢尾根的长毛,搂向一侧。 (3)检查者指甲剪短、锉光、磨圆,将衣袖挽至肩关节处,手臂或带长臂手套,涂以滑润剂。 2(检查方法 (1)检查者站在被检母马、母驴的后肢外侧,站在母牛的正后方,给母畜的肛门周围涂以滑润剂,检查者将五指并拢呈楔状,缓缓旋转插入肛门。 (2)手伸入肛门后,愚直肠内有蓄粪时,可用手指扩张肛门,使空气进入直肠,促使蓄 粪排出(空气排粪法),否则要以手指掏出。掏出粪便时,手掌须展平,少量而多次地取出,切勿抓粪一把向外硬拉。最好设法促使母畜自动排粪,其方法是将手掌在直肠内向前轻推,以阻止粪便排出,待粪便蓄积较多时,逐渐撤出手臂,即可促使排尽宿粪 (3)掏取蓄粪后,应再次向手臂涂以滑润剂,伸入直肠,除拇指外,将四指并拢探入结肠内,探索欲检查之器官。 (4)检查母牛时,手腕进入母牛肛门后先寻找子宫颈。其方法是手指向下轻压肠壁,摸到一坚实、纵向似棒状物即为子宫颈,可试探用拇指、中指及无名指握住子宫颈。再沿子宫角的大弯向外侧下行,在子宫角尖端的外侧下方即可感触到椭圆、柔软、有弹性的卵巢,然后测定其形状和质地。在触摸过程中,如失去子宫角不易摸到卵巢时,应再从子宫颈开始,沿着子宫角触摸卵巢。 (5)检查母马、母驴时,手指伸人到髂骨中缝前缘,先尽可能将手向前推进,然后将套着肠管的手向稍后方移动触摸卵巢。为了寻找卵巢,可将手掌展平,手心靠腹侧壁,上下左右触摸。亦可微弯手掌,用指尖紧贴于髋结节前腹壁后移,沿着卵巢韧带向下移动即可握住卵巢。还可在手臂伸入直肠后,将骨盆腔内的肠道前推,然后展平手掌,手指下弯后移,即可感觉子宫角分叉处。手指沿子宫角上移,在子宫角尖端外侧上方即可摸到卵巢,测定其形状、质地。 3(直检过程中几种情况的处理 (1)母畜强烈努责,欲将手臂排挤向外,此时切忌手臂用力硬推,可采用手指掐捏母畜腰部,或喂给饲料,以使努责减弱或停止。 (2)肠壁持续收缩,紧套检查者手臂,致使手臂探摸无法自如,此时也可采用上法,促使肠壁停止收缩。 (3)肠壁紧张向体壁方向扩张呈坛状,此时可将手缓缓前推,以刺激肠壁蠕动如果无效,只能耐心待其自行舒展后,再行触摸。 4(直肠检查时应注意事项 (1)严冬及早春季节操作时,注意防寒保暖。手臂如有伤口,应带上长臂手套后再行直检。 (2)保定架后两柱间,不可架横木,以免母畜下卧,招致手臂骨折或关节脱臼。检查过程中,全神贯注,谨防母畜踢人。母牛后腿的外展肌发达,因此,操作者不宜站在母牛的外侧,而应站在母牛的正后方。 (3)检查者不得用于涩手臂硬向母畜肛门内插入。在直肠内探摸时,只许使用指肚感觉,切不可用指甲乱抠。直肠壁上如有马虻幼虫吸附,不可揪掉,以免直肠出血。 (4)检查母马、母驴的左卵巢需用右手,检查右卵巢则需用左手。 (5)在直肠内经久触摸不到时,应间隔一定时间查看手臂有无血迹,以便尽早发现肠壁破损,及时医治处理。一旦发现肠壁有轻度破损时,应停止直检,并灌注3,明矾水500~1 000 ml 。 四、实习报告 1(根据观察和检查结果,分析发情症状,确定输精或配种时间。 2(母羊、母猪常用的发情鉴定方法及其判断依据是什么? 3(叙述牛直肠检查触摸卵巢的要领。 4(绘图说明受检查母牛卵巢的形状和子宫的特点。 五、实习提示 1(事先准备实习母畜若干头,教师先检查,了解每头母畜的生理状况,是否发情。 2(直肠检查和阴道检查之前,教师讲重点的同时要做示范操作。在实习过程中应防止事故发生。 实习三 同期发情 一、目的和要求 同期发情技术在畜牧业生产中具有便于组织生产和管理,提高母畜发情率和繁殖率作用。尤其在人工授精和胚胎移植技术的推广应用中,使用同期发情技术,操作起来就比较方便。学生要掌握同期发情方法及操作要领。 二、材料和器械 (一)受体 选择健康、繁殖性能良好、体型中等的母畜 (二)器具 注射器(5 ml和20 ml),套管针,无刺激性塑料细管,大头针,酒精灯,手术刀片,脸盆,肥皂,毛巾,纱布,搪瓷盘,工作服,胶靴,保定架 (三)药品 18-甲基炔诺酮,氯前列烯醇,PGF2a,消炎粉,苯甲酸雌二醇,色拉油,PMSG(孕马血清促性腺激素),hCG(人绒毛膜促性腺激素),70%酒精,碘酒,消毒药 三、方法和步骤 一)牛的同期发情 ( 孕激素和前列腺素是诱导母牛同期发情最常用的激素,前者通常用皮下埋植法或阴道栓法给药,后者一般以肌肉注射方式给药。 1(孕激素埋植法 (1)埋植管的制备 取外径3 mm,内径2 mm,长约15~8 mm无刺激性塑料管,将管壁用大头针烫刺16~20个孔,并把管的一端在酒精灯上烧软,稍加挤压,使其缩成小孔。再把小管浸于70,酒精中约20 min,然后将其放在消毒干纱布上,吸去酒精。然后将18-甲基炔诺酮粉和消炎粉按1:l混合研细,装入小管内,使每支小管约含混合粉40~60 mg。 (2)混悬剂的制备 3~5 mg l8-甲基炔诺酮研细与2~4 mg苯甲酸雌二醇及事先煮沸消毒的色拉油制成混悬剂,使每ml含1.5,2.5 mg l8-甲基炔诺酮及l~2 mg苯甲酸雌二醇,用时先混匀后肌注。 (3)药管埋植 取与埋植药管相应直径的套管针,在被选母牛耳背侧中部无明显血管区,先剪毛,并用70,酒精消毒,顺着耳方向,在皮下及耳软骨之间刺人约20 mm,然后将药管装入套管针管内,使其开口端向上,再用套管刺针将药管推下皮下。注意切勿埋植过深或推人肌肉层,否则不易取出。埋植同时,给每头牛注射上述混悬剂2 ml。 (4)药管取出 经10~12天后,用小号尖刀,在靠近埋植管开口端,将皮切开一小口,挤出埋植药管。取管时注意不要用力过猛,以免将药管内剩余18-甲基炔诺酮压出管外,残留皮下,导致发情时间推迟。为使排卵更为同期化,可在取管时注射孕马血清促性腺激素400~500 IU,还可在第一次输精时注射促排2号60~100 μg或人绒毛膜促性腺激素1 000 IU。 2(前列腺素法 用国产氯前列烯醇0.4 mg进行肌肉注射,可诱导大多数牛在处理后3~5 排卵后5天内)没有作用,因此一次注射前列腺素天发情排卵。由于前列腺素对新生黄体( 往往一些牛不发情。为了提高同期发情效果,可间隔9~12天分两次注射前列腺素。前列腺素也可用输精管进行子宫内灌注,虽然操作麻烦,但可减少激素用量一半。其余项目同埋植法。 (二)绵羊的同期发情 上述处理牛的方法也可用于诱导绵羊同期发情,只是药物用量较少,处理时间较短而已。通常,18-甲基炔诺酮30~40 mg,前列腺素一般牛的1/3,1/4。 山羊同期发情处理与绵羊相似。 (三)猪的同期发情 猪用孕激素处理易引起卵巢囊肿,而且发情率和受胎率均不高。用前列腺素处理的同期发情率也较牛和羊低,因为前列腺素只对14日龄黄体产生作用。因此,用孕激素和前列腺素均不适合诱导猪同期发情。诱导猪同期发情最常用的方法是同期断奶法。如果在断奶同时,注射孕马血清促性腺激素750~1 000 IU,效果更佳。 (四)马的同期发情 诱导马同期发情以用前列腺素类似物ICl81008的效果较好。由于马的发情持续时间较长,排卵后5天内的黄体对前列腺素不敏感,因此一次处理后的同期发情率较低。采用间隔12,16天使用2次前列腺素的效果虽然提高,但使用成本增加。 四、实习报告 评述母畜同期发情操作程序及观察结果。 五、实习提示 l(应事先作好实习准备,选择供实习用的母畜。 2(全部实习操作,应在教师指导下由学生独立完成。 实习四 采 精 一、目的和要求 学习家畜的采精操作方法和技术要领,初步掌握采精方法。 二、材料和器械 (一)材料 调教好的种公畜(牛、马、羊、猪),活台畜,假台畜 (二)器具 各种公畜假阴道,集精瓶,贮精瓶,长柄钳,温度计,玻璃棒,搪瓷盘,酒精棉球,乳胶手套,公羊电采精棒,无菌纱布, (三)药剂 凡士林,热水 三、方法和步骤 (一)假阴道的准备 1(消毒 将安装好的假阴道用75,酒精棉球消毒,待酒精气味完全挥发后,再以生理 盐水或稀释液冲洗,然后套上经消毒过的集精杯(瓶)。牛用集精管需用乳胶漏斗加以连接。 2(灌水 由假阴道外壳的注水孔灌入45~55?左右的热水,注入的水量为外壳与内胎夹层容量的1/2~1/3。 3(测温 调整热水和冷水的比例,使假阴道内腔的温度在采精时控制在38~40?为宜。 4(涂抹润滑剂 用经消毒的玻棒蘸取润滑剂(医用凡士林),由假阴道入口处向内腔壁均匀地涂抹,深度以假阴道的1/2,1/3段为宜。 5(调压 经注水孔安装的调节钮注入适量空气,使假阴道内腔具有一定的压力,其大小应根据畜种和个体要求而定。 (二)台畜的准备 选择发情盛期、体格适中、健康的母畜作采精用的台畜。最好调教公畜使用假台畜采精,既安全又方便。台畜的后躯须保持干净并经消毒,做好保定,将尾巴系于一侧等候采精。 (三)采精操作 1(公牛的采精 (1)假阴道法 ?将台牛固定于配种架内,缠尾并系于一侧,有时也可用公牛或不发情母牛做。 ?清洗台牛的外阴部及臀部。 ?检查假阴道内腔的温度一般应为40?左右,压力适中,并在假阴道的入口盖上消毒纱布。 ?采精员右手持假阴道,立于台牛臀部右侧,准备采精。 ?采精前可让公牛观察其他公牛的采精或在采精时不使其立即爬跨,而作适当控制或空怕几次,以加强采精前的性欲刺激。当公牛阴茎充分勃起并有少量分泌物排出时,再令其爬跨,可收到好的效果。 ?当公牛临近台牛时,应取下遮盖假阴道的纱布。公牛阴茎充分勃起爬跨时,以左手准确地托住包皮(切勿触及阴茎),迅速将阴茎导入假阴道入口(假阴道与阴茎的方向和角度一致)。当公牛阴茎导入假阴道并伴随后躯向前强烈地耸跳时,即完成射精。 ?射精后,将假阴道集精杯端向下倾斜,同时随公牛跳下的动作顺势取下假阴道,并盖上纱布,以防灰尘污染。 ?打开活塞放气,使精液完全流入集精杯。 ?将假阴道送回室内取下集精杯,检查精液品质。 (2)按摩法 由于公牛因各种原因不能爬跨或无法使用假阴道采精的公牛所使用的一种采精方法。 ?先令公牛观察其他公牛的交配或爬跨行为,增加公牛按摩采精的性刺激。 ?保定好公牛,清洗包皮及包皮口,剪短包皮口处的长毛。 ?一人手臂涂上润滑剂或戴上长臂塑料手套,伸入公牛直肠,隔着直肠壁摸到精囊腺和输精管壶腹。先用拇指和其余四指轻轻按摩精囊腺和输精管壶腹,随后掌心向下,以四指按摩从壶腹到尿道部分。如此反复按摩,其强度和频率不断增加,但用力不宜过猛。 ?另一人,手持一个置于的水浴或恒温箱中平衡过的离心管,其上面加一个塑料漏斗接取精液。 ?若经按摩一段时间后仍不射精者,应休息5~10 min,再进行按摩。 2(公马的采精 ?将台马固定于配种架内或用脚绊固定或直接使用假台畜。注意对台马后肢的保定,以防蹴踢。用绷带缠尾并系于一侧。 ?公马在采精前,用温肥皂水清洗包皮和阴茎,并用消毒纱布擦干。 ?调节好假阴道的温度(40?左右)、压力及润滑剂的量。 ?当公马阴茎充分勃起爬跨时,采精员左手握住龟头颈部,将阴茎导入假阴道。此时采精员应以右臂部抵住假阴道的集精杯端,并用双手固定假阴道与台马的臂部,尤其公马的阴茎在假阴道内抽动时,应尽量使假阴道保持稳定。公马射精时,应将集精杯渐向下倾,并逐渐放气减小压力。当公牛阴茎导入假阴道并伴随后躯向前强烈地耸跳时,即完成射精。射精结束假阴道应同阴茎一起下降,随后轻轻取下,盖好纱布。 ?在室内取下集精杯,测定射精量并做精液品质检查。 ?公马射精前,后肢经常移动,此时采精员应注意被踩伤。 3(公羊的采精 (1)假阴道法 基本方法与牛相同,但公羊射精较牛快,所以动作更要迅速、敏捷。 ?做好采精场地、台羊和假阴道的准备。 ?将台羊放入配种架,做外阴部的清洗、消毒。 ?擦洗公羊包皮及尿道口。 ?采精员蹲于台羊右侧,右手持假阴道,当公羊阴茎勃起并爬跨时,左手迅速轻托包皮将阴茎导入假阴道,公羊向前耸身时即为射精,将假阴道集精杯向下并取下假阴道 ?以下操作同公牛采精。 (2)电刺激法 ?将公羊采取侧卧或侧卧式固定在特定的保定架内,也可以站立保定。 ?洗净包皮口,用两手配合从阴鞘内将阴茎导出,然后用一块消毒纱布裹住阴茎前端,防止其缩回阴鞘内。 ?将尿道突导入收集精液的带刻度离心管中。 ?将采精棒电极一端涂上润滑剂,插入肛门,调整好适当的位置。 ?按动电开关通电1~2 s,间隔2 s再进行第二次通电刺激。一般2~3次即可射精。注意通电时间不易过长,电流强度不易过强,以防引起排尿污染精液。当多次刺激还不射精时,应让公羊适当休息,并调整电极的位置,做下一次尝试。 4(公猪的采精 目前多采取手握采精法,不用台猪而使用假台猪或采精台。 ?用温肥皂水清洗公猪的包皮和周围皮肤,并用纱布擦干。 ?采精员一手应戴乳胶手套,另一手持集精瓶。 ?当公猪爬跨采精台时,采精员应蹲在采精台的右侧。戴乳胶手套的手待公猪阴茎伸出时,握住阴茎,并使其伸入空拳中。 ?待公猪阴茎伸入空拳后,此时手要由松到紧有弹性、有节奏地握住螺旋状的龟头,使之不能转动。 ?待阴茎勃起前伸时,顺势牵引向前,同时手指要继续有节奏地施以压力,即可引起射精。 ?公猪俯伏不动时表示开始射精,但开始一段射出的水状液体,很稀薄不收集,当浓份精液射出时再行收集。最后一段射出的精液含有较多的胶状物,也不收集。 四、实习报告 1(各种公畜采精时应注意哪些问题? 2(各种公畜性行为序列的特点。 3(假阴道具备哪些条件?各种公畜有什么特点,如何满足? 五、实习提示 采精操作前,教师必须熟悉公畜的习性,并向学生讲解公畜的射精特点、采精方法、操 作要领和应注意事项。 实习五 输 精 一、目的和要求 了解各种家畜的输精过程,掌握家畜的输精操作方法。 二、材料和器械 (一)材料 发情的母牛、母羊、母猪、母马(驴),精液 (二)用具 保定架,灭菌的输精器(金属或玻璃),卡苏枪,输精胶管(猪、马),注射器,尾绳5条(每条3 m左右),脸盆,肥皂,阴道开张张器,长臂手套 (三)药品 75,酒精棉球 三、方法和步骤 (一)输精前的准备 1(输精器械的清洗消毒 (1)金属开张器,先以火焰消毒,再以75%的酒精棉球消毒。 (2)塑料或有机玻璃的可直接用75%的酒精消毒。 (3)输精器用蒸煮消毒或75%的酒精消毒,再以生理盐水冲洗2~3次。 2(发情鉴定 做好母畜的发情鉴定,检查有无生殖器官疾病。 3(检查精液品质 鲜精活率必须在0.6~0.7,冻精解冻后其活率必须在0.3以上才能用于输精。 (二)各种家畜的输精 1(母牛的输精 母牛输精有阴道开张法和直肠把握法两种。后法虽然须一定技术,但受胎率高,因而是目前普及应用的方法。 (1)阴道开张器输精法 输精时,阴道开张器保持25~30?,涂抹少量润滑剂,一手持开张器,打开阴道,找到子宫颈外口。另一手将事先吸有精液的输精器尖端插入子宫颈口内1~2 cm深处,徐徐将精液注入,输精量一般为1~2 ml。输精完毕,小心取出输精器和开张器,捏其背部,以防母牛弓背使精液倒流。 (2)直肠把握子宫颈输精法 左手戴长臂手套伸入直肠排出宿粪,握住子宫颈管,然后右手将吸有精液的输精管从阴门斜上方插入阴道,而后水平插入直抵子宫颈外口,两手协同 动作把输精器插入子宫颈5~10 cm深处,接近子宫体,然后徐徐注入精液。 2(母马的输精 首先将母马保定,并用绷带缠裹尾部并拉向一侧固定。清洗母马外阴部,输精员清洗消毒手臂,涂抹润滑剂的手握住橡胶输精管前端伸入阴道,用食指找到子宫颈外口,然后将输精管前端插入子宫颈内10~15 cm深处,另一只手举高输精管另一端的精液瓶,使精液徐徐注入子宫,输精完毕,缓缓取出输精管,可用拇指和食指按摩子宫颈外口。母马的输精量为10~30 ml。 3(母羊的输精 (1)阴道开张器输精法 首先将母羊保定,保定员把母羊尾部向上拉起,输精员用开张器打开阴道,找到子宫颈外口,而后把吸有精液的输精管沿开张器插入子宫颈口0.5~1.0 cm深处,缓缓注入精液。母羊输精量一般为0.05,0.1 ml,不超过0.2 ml。输精完毕,小心取出输精器和开张器,拍一拍母羊的腰背部,以防精液倒流。 (2)输精阴道插入法 对于阴道狭小,使用阴道开张器插入阴道困难的母羊,采用输精阴道插入法输精,效果较好。具体操作方法是将母羊两后腿提起倒立,用两腿夹住母羊的前躯进行保定,输精员用手拨开阴门,沿母羊背部方向把输精管插入到阴道底部输精,输精量一般为0. 5 ml。输精完毕,小心取出输精管,拍一拍母羊的腰背部,以防精液倒流。 (3)腹腔内窥镜子宫角输精法 对于冷冻精液使用子宫颈输精法受胎率较低,目前有条件的地区,使用腹腔内窥镜进行子宫角输精,可大大提高受胎率。但腹腔内窥镜价格较高,操作方法也较为复杂,在生产中推广应用还有一定距离。 4(母猪的输精 发情母猪输精可在卷内自由站立,用橡胶输精管轻轻从阴门插入阴道,左右螺旋前后移动直至子宫颈深部,这是将装有精液的注射器接上橡胶输精管,将精液徐徐注入子宫内,母猪输精量一般为25,40 ml,轻轻抽出输精管,用力压一压母猪背部,以减少精液倒流。 四、实习报告 写出直肠把握子宫颈给母牛输精的体会。 五、实习提示 1(输精时要求由技术员或教师示范,而后学生操作。 2(促使母畜发情,子宫颈外口松弛,外表也能出现发情症状,进行输精实习。 3(实习时,应在教师示范和指导下操作。教师预先讲解输精操作要领及应注意事项。 实习六 母畜的妊娠诊断 一、目的和要求 掌握母畜妊娠诊断的常用方法及其操作要领。 二、材料和器械 (一)母畜 妊娠后期的母马、母牛,妊娠二个半月以上的母羊、母猪,未孕母羊、母猪,未孕母马、母牛 (二)器械 保定架,听诊器,绳索,鼻捻捧,尾绷带,开膣器,额灯或手电筒,热水,脸盆,肥皂,石蜡油,酒精棉球,细竹捧(长约40 cm)消毒棉花,滴管,显微镜,载玻片,毛巾,多普勒妊娠诊断仪 (三)药品 95,酒精,姬姆萨染液 三、方法和步骤 (一)外部检查法 外诊包括视诊、触诊和听诊三种方法。 1(视诊 怀孕家畜,可以看到腹围增大,臁部凹陷(乳房增大(山现胎动。但不到怀孕末期,通常难以得到确诊。 (1)马 由后侧观看时,已妊娠母马的左侧腹壁较右侧腹壁膨大,臁窝亦较充满,在妊娠末期其左下腹壁较右侧下垂。 (2)牛 由于母牛左后腹腔为瘤胃所占据,所以,站于妊娠母牛后侧观察时,以发现右腹壁突出。 (3)羊 同牛,在妊娠后半期右壁表现下垂而突出。 (4)猪 妊娠后半期,腹部显著增大下垂(在胎儿很少时,则不明显),乳房皮肤发红,逐渐增大,乳头也增大。 2(触诊 在怀孕后期,可以从外部触知胎儿。 (1)马 在乳房稍前方的腹壁上,用手掌多次抵压来进行触摸。能触到胎儿的时间在瘦马是七个月以后,肥马在八个月以后。 (2)牛 早晨饲喂之前,用手掌在右膝襞之前方,臁部之下方,压触以诱发胎儿运动,亦可用拳头在臁部往返抵动。以触知胎儿,但此方法不可过于猛烈,以免引起流产。能触知的时间一般须在怀孕六个月以后。如果从右侧触诊不到可在左侧试验。 (3)羊 检查者在羊体右侧并列而立,或两腿夹于羊之颈部,以左手从左侧围住腹部,而右手从右侧抱之,如此用两手在腰椎下方压缩腹壁,然后用力压左侧腹壁,即可将子宫转向右腹壁而右手则施以微弱压力进行触摸,胎儿是硬的,好象漂浮于腹腔中, 营养较差被毛校少的母羊有时可以摸到子宫,甚至可以摸到胎盘。 (4)猪 触诊时,使母猪向左侧卧下,然后细心地触摸腹壁,在妊娠三个月时,在乳腺的上方与最后两乳头平行处触摸可发现胎儿,有坚硬的质地,但仅是瘦的母猪在后期才能摸到。 3(听诊 听取胎儿的心音。 (1) 方法 ?马 可在乳房与脐之间或后腹部下方听取,能听到的时间在怀孕第八个月以后,但往往由于受肠蠕动音的影响而不易听到。 ?牛 在怀孕第六个月以后,可在安静场所由右臁腹下方或膝襞内侧听取。 (2) 心音数 无论马和牛,胎儿心音均比母畜多达二倍以上。 (3) 价值 诊断价值和触诊相同,不同之处是可以断定胎儿的生死,但在应用上比触诊困难。 (二)阴道检查法 1. 准备工作 (1)保定 母畜保定在保定架内,用绷带缠尾后扎于一侧。如无保定架也可用三角绊。母畜阴唇及肛门附近先用温水洗净,最后用酒精棉花涂擦。如须将手伸入阴道进行检查时,消毒手的方法与手术前手的准备相同,但最后必须用温开水或蒸馏水将残留于手上的消毒液冲净。 2)消毒 金属用具先用清水洗净后,再以火焰消毒或用消毒液浸泡消毒。但其后必须( 再用开水或蒸馏水,将消毒液冲净。 2. 检查阴道的变化 (1)检查方法 ?给巳消毒过的开膣器前端约五公分处向后涂以滑润剂(石腊油等),在检查之前用消毒纱布复盖,以免灰尘沾污。 ?检查者站于母畜左右侧,右手持开膣器,左手姆食二指将阴唇分开,将开膣合拢呈侧向,并使其前端略微向上缓缓送入,待完全进入后,轻轻转动开膣器,使其两片成扁平状态, 最后压紧两柄使其完全张开,进行观察。 ?检查完毕,将开膣器恢复如送入时状态,然后再缓慢抽出,抽出时切忌将开膣器闭合,否则易于损伤阴道粘膜。 ?检查完毕将开膣器进行消毒。 (2)阴道黏膜及子宫颈变化 ?妊娠时阴道粘膜变为苍白、干燥、无光泽(妊娠末期除外)至妊娠后半期,感觉阴道肥厚。 ?子宫颈的位置改变,向前移(随时间不同而异),而且往往偏于一侧,子宫颈口紧闭,外有浓稠沾液,在妊娠后半期粘液量逐渐增加,非常粘稠(牛在妊娠末期则变为滑润)。 ?附着于开膣器上之粘液成条纹状或块状,灰白色,在马妊娠后半期稍带红色,以石蕊试纸检查呈酸性反应。 阴道检查时注意事项:对于妊娠母畜开张阴道是一种不良刺激,因此,阴道检查动作要轻缓,以免造成妊娠中断。 (三)直肠检查法 1.准备工作 检查前的准备工作与发情鉴定的直肠检查准备相同。 2. 检查步骤和方法 牛 (1)手臂伸人直肠。 (2)一般当手腕伸入肛门,手向下轻压直肠肠壁,即可触摸到棒状坚实纵向子宫颈。 (3)将食指、中指、无名指分开沿着子宫向前摸索,在子宫体前,中指可摸到一纵行子宫角间沟,再向前探摸,食指和无名指可摸到类似圆柱状两侧子宫角。 (4)沿子宫角的大弯向外侧下行,即可触到呈扁卵圆形、柔软、有弹性的卵巢。 (5)触摸过程中如摸不到子宫角和卵巢时,应再从子宫颈开始向前逐渐触摸。 (6)母牛妊娠诊断时须触摸 ?子宫角的大小、形状、对称程度、质地、位置及角间沟是否消失。 ?在子宫体、子宫角可否摸到胚泡并判断其大小,子宫颈粗细、位置及牵拉感觉。 ?有无漂浮的胎儿及胎儿活动状况。 ?子宫内液体性状。 ?子宫动脉粗细及妊娠脉搏的有无,子叶大小。 马(驴) (1)检查者站立于母畜后躯旋转插入肛门,伸人直肠。侧,以涂有滑润剂的手抚摸肛门,然后五指并拢呈楔状,缓缓 (2)按操作要求掏完直肠内蓄粪。 (3)手指伸人髂骨中部前缘内下方,寻找卵巢和子宫。 (4)母马(驴)妊娠诊断时须触摸 ?子宫角的质地、形状、大小、位置和子宫底的形状及两产宫角对称状态。 ?胚泡的大小和位置,两侧卵巢位置、形态。 ?有无漂浮胎儿及胎儿活动情况。 ?子宫内液体性状。 ?子宫动脉粗细及妊娠脉搏的有无。 (四)超声波检查 1.猪 (1)不需保定待查母猪,令其安静侧卧、爬卧或站立均可。 (2)先清洗刷净欲探测部位,涂抹石蜡油,由母猪下腹部左右胁部前的乳房两侧探查。从最后一对乳房后上方开始,随着妊娠日龄的增长逐渐前移,直抵胸骨后端进行探查,亦可沿两侧乳房中间腹白线探查。使多普勒妊娠诊断仪的探头紧贴腹壁,对妊娠初期母猪应将探头朝向耻骨前缘方向或呈45度角斜向对侧上方,要上下前后移动探头,并不断变换探测方法,以便探测胎动、胎心搏动等。 (3)判定标准 母体动脉的血流音是呈现有节律的“拍嗒”声或蝉鸣声,其频率与母体心音一致。胎儿心音为有节律的“咚、咚”声或“扑咚”声,其频率约200次,min,胎儿心音一般比母体心音快1倍多。胎儿的动脉血流音和脐带脉管血流音似高调蝉鸣声,其频率与胎儿心音相同。胎动音好似无规律的犬吠声,妊娠中期母猪的胎动音最为明显。 2.羊 (1)待查母羊自然站立或侧卧。 (2)探查部位在左右乳房基部外侧的无毛区。 (3)探查时,使多普勒妊娠诊断仪的探头紧贴母羊腹壁,方法和探查母猪相同 (4)判定标准 探查母羊妊娠时有加快的“扑咚”声,其心率见下表l。 表l 不同孕期胎儿心率和母羊心率 孕期(d) 21~25 26~35 36~45 46~60 61~75 76~0 90~105 106~120 121~135 131~145 胎儿心 率 186 200 216 216 199 190 180 175 164 154 (次/min) 母羊心 率 126 98 102 102 98 109 122 129 133 127 (次/min) 四、实习报告 1.将检查结果写出实习报告,指出该母畜是否妊娠及妊娠时间。 2.比较四种妊娠检查方法的实用时间,准确性和优缺点。 五、实习提示 1.认识母畜妊娠后阴道内所发生的变化,从而帮助直肠检查法,作出准确的妊娠诊断。 2.掌握大家畜((牛、马、)怀孕各月份生殖器官各部分的变化,从而确定其是否怀孕及怀孕时间的长短。 实习七 母畜的分娩和助产 一、目的和要求 观察分娩予兆及分娩过程,了解助产的一般方法及要领。 二、材料和器械 (一)材料 临产母畜 (二)用具 毛巾,剪刀,产科绳,肥皂,缠尾绷带 (三)药品 酒精,碘酒,来苏儿,石蜡油 三、方法和步骤 (一)分娩预兆的观察 主要注意以下几点: 1.乳房胀大,乳头肿胀变粗,可挤出初乳,某些经产母牛和母马产前常有漏奶现象。 2.荐坐韧带松驰,触诊尾根两旁即可感觉到荐坐韧带的后缘极为松软。牛、羊表现较明显,荐骨后端的活动性增大。 3.阴唇肿胀,前庭粘膜潮红、滑润,阴道检查可发现子宫颈口开张、松弛。 4.母牛产前几小时体温下降0.4~1.2?。 5.临产母畜表现不安、常起卧、徘徊、前肢刨地、回顾腹部、拱腰举尾、频频排便。母马常出汗,母猪常用衔草做窝的表现。 (二)产前的准备工作 l.对母马和母牛应用缠尾绷带缠尾系于一侧。 2.用温洗衣粉水彻底清洗母畜的外阴部及肛门周围,最后用来苏儿溶液消毒并擦干。 3.助产者要将手臂清洗并以酒精消毒。 (三)分娩过程的观察及助产 l.当母畜开始分娩时,要密切注意其努责的频率、强度、时间及母畜的姿态。其次,要检查母畜的脉搏,注意记录分娩开始的时间。 2.母马和母牛的胎囊露出阴门或排出胎水后,可将手臂消毒后仲入产道,检查胎向、胎位和胎势是否正常,对不正常者应根据情况采取适当的矫正措施,防止难产的发生。当发现倒生时,应及早撕破胎膜拉出胎儿。 3.马的尿囊先露出阴门,破水后流出棕黄色的尿囊液。随后出现的是羊膜囊,胎儿的先露部位随之排出,羊膜囊破后流出白色浓稠的羊水。牛和羊在分娩时,一般先露出羊膜囊,也有时先露出尿囊。 4.当胎儿的嘴露出阴门后,要注意胎儿头部和前肢的关系。若发现前肢仍未伸出或屈曲应及时矫正。 5.胎儿通过阴门时,应注意阴门的紧张度。如过度紧张,应以两手顶住阴门的上角及两侧加以保护,防上撕裂。发现胎头较大难以通过阴门时,应将胎膜撕破,用产科绳系住胎儿的两前肢球节,由术者按住下颁,一两名助手牵引产科绳,配合母畜的努责,顺势拉出胎儿。牵引方向应与母畜骨盆轴的方向一致,用力不可过猛,以防止子宫外翻。 6.当牛、羊胎儿腹部通过阴门时,要注意保护脐带的根部,防止脐血管断于脐孔内,引起炎症。 7.胎儿排出后,应将胎膜除掉。个别情况下,马的尿膜羊膜与胎儿完整排出,应立即撕破,取出胎儿,并防止胎儿吸入羊水造成窒息或感染。当胎儿排出,但脐带未断时,可将脐带I内的血液尽量捋向胎儿,待脐动脉搏动停止后,用碘酒消毒,结扎后断脐,对自动断脐的幼畜脐带也应用碘酒消毒。 猪的胎儿排出常用母猪强烈努责数次之后,但应注意排出胎儿的间隔时间。羊产双羔或三羔时也应注意其间隔的时间,以便采取相应的助产措施。 (四)新生仔畜的护理 l.擦去仔畜鼻口中的粘液,并注意有无呼吸。若无呼吸可有节律地轻按腹部,进行人工呼吸。对新生仔猪和羔羊还可将其倒提起来轻抖,以促进其恢复呼吸。 2.用干布擦去(马、猪)或令母畜舔干(牛、羊)仔畜身上的羊水。 3.注意仔畜保温。 4.尽早给仔畜吃到初乳。对仔猪和羔羊要防止走失和被母畜压死。 (五)母畜的护理 1.擦净外阴部、臀部和后腿上粘附的血液、胎水及粘液。 2.更换褥草。 3.及时饮水并给予疏松易消化的饲料。 4.注意胎衣排出的时间和排出的台衣是否完整,如发现胎衣不下或部分胎衣滞留的情况,应及早剥离或请兽医处理。 四、实习报告 记录你所观察到的分娩预兆和分娩过程。 五、实习提示 1.实习前联系好临产母畜。 2.根据分娩母畜的种类和数量,将学生分为小给,由教师带领边讲解、边观察、边操作。 实习八 一般繁殖障碍的检查与处理 一、目的和要求 初步掌握一般繁殖障碍的识别,并能协助兽医处理。 二、材料和器械 (一)材料 屡配不孕母牛,卵巢、生殖道病理标本 (二)用具 1.阴道及直肠检查用具 开膣器,手电筒(长臂手套,绷带,脸盆,毛巾导管,围裙,胶靴 2.阴道及子宫清洗用具 吊桶,胶管,子宫清洗器,子宫导管,子宫膣部钳,纱布,脱脂棉,加温设备,围裙,胶靴 (三)药品 生理盐水,酒精,新洁尔灭液,高锰酸钾,消炎软膏,醋酸洗必泰 三、方法和步骤 (一)繁殖障碍检查 l.收集病史 向饲养员、配种员及使役人员询问病史,包括患畜数目,来源,系谱,适配年龄,患畜的饲养、管理和利用情况,患畜过去的繁殖情况,患畜有无努责,是否患有生殖器官疾病,患病时间长短、症状,患畜有无内、外科病症,特别是有关的传染病和寄生虫病,患畜群体中的种公畜数量、饲养管理、健康、年龄、配种能力、精液品质检查情况、配种定额和过去的配种成绩等。 2.临床检查 (1)外部检查 包括对患畜外表形态及行为,外阴部及其分泌物,乳房和乳头大小的检查。 (2)阴道检查 黏膜的颜色,有无肿胀、小泡、溃疡及损伤。观察子宫颈的位置、大小、形状、颜色、颈口开张程度,有无分泌物及瘢痕。 (3)直肠检查 子宫的粗细及软硬,子宫的位置、大小、形状、质地、内容物,子宫对触诊的收缩反应。卵巢的位置、大小、形状和质地。 3.精液品质检查 包括射精量、气味、颜色、精子密度和活率,必要时检查精子畸形率及精液pH等。 4.实验室检查 会同兽医人员进行如下检查: (1)子宫内膜炎、子宫积脓快速诊断。 (2)子宫颈、阴道黏液检查。 (3)子宫内膜活体检查。 (4)子宫颈口内炎性分泌物细菌分离和鉴定。 (二)繁殖障碍治疗 1.阴道洗涤及投药 保定好母畜,以绷带缠尾并系于一侧后对外阴部进行常规消毒。用吊桶装满洗液,将吊桶的导管插入阴道进行冲洗。冲洗时,使洗液自行排出,排不尽时,可借开膣器扩张阴道使其排出。 当前庭、阴道粘膜或子宫颈发炎时,也可将软膏或药液直接涂于患处。即先用开膣器打开阴道,再用子宫膣部钳夹取纱布块蘸取药液或软膏于患处涂抹。也可制成拳头大的棉球,外面包以纱布,棉球上浸以药液或撒上粉剂。最好在纱布外边系一条线,使线段留以阴部之外,以便取出。一般将此棉球送入阴道,保持3~5 h。 2.子宫冲洗及注药 对有炎症的母畜子宫,在发情期内或配种前可采用冲洗子宫的方法清除子宫内含物和注药治疗。子宫冲洗液种类很多,可根据子宫炎症的具体情况,进行配制和使用。 可用一导管插入子宫,另一端与装有洗液的吊桶相接,使洗液自动流入子宫。大家畜一次注入洗液1 000 ml ~2 000 ml,洗前对外阴部应按常规消毒。 注入洗液后根据冲洗液种类和炎症的情况,让洗液自行排出或直肠按摩子宫,促其蠕动加速残留洗液的排出。对某些子宫下垂,洗液难于自行排出者,可用子宫导管插入子宫将洗液导出。当子宫内冲洗液排净后,可注入适量的抗菌素或其他消炎药物。 (三)繁殖障碍处理 1.对于异性孪生母犊及生殖道畸形者改为役用或淘汰。 2.对于生殖器官发育不全或者无繁殖机能者,可与公畜一同放牧或淘汰。 3.对于由饲养管理不当引起的繁殖障碍,应改善其饲养管理。处理无效时,改为役用。 4.对于由气候水土不服引起的繁殖障碍,应减轻或暂停使役或者改换使役,同时实行放牧并供给富于营养的饲料。 5.对于由繁殖技术和方法不当引起的繁殖障碍,应提高繁殖技术水平,制定并严格遵守发 情鉴定、人工授精或自然交配、妊娠诊断 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 和操作规程。 6.对于衰老性繁殖障碍应予以淘汰。 7.对于由卵巢机能减退引起的发情周期不完全、不出现发情现象、发情不排卵或排卵延迟,以及安静发情,应在改善饲养管理的同时,根据条件,会同产科兽医施用促卵泡素、促黄体素、人绒毛膜促性腺激素、促性腺激素释放激素、孕马血清促性腺激素及雌激素等激素疗法。 8.对于由持久黄体引起的繁殖障碍,应在消除其病因(饲养管理不当、子宫疾病),促使黄体自行消退的同时,可施用前列腺素制剂处理。 9.对于由卵泡萎缩及交替发育引起的繁殖障碍,可在改善饲养管理,增加放牧和规定足够的运劝,适当减少使役的同时,施用促卵泡素、人绒毛膜促性腺激素及孕马血清促性腺激素疗法。 l0.对于由子宫内膜炎、子宫积液或子宫积脓等引起的繁殖障碍,可用冲洗子宫子宫注药相结合的方法治疗。 四、实习报告 评述患畜的临床检查、治疗过程及观察结果。 五、实习报告 1.在实习前准备好器械和药品。 2.事先在配种站或兽医院预约好病例掌握检查和治疗的方法。如果没有病畜,也可用实习家畜进行,使学生能掌握检查和治疗的方法。 3.根据病例检查结果,提出治疗方案,培养学生独立工作和分析问题的能力。 实习九 配种站和种公牛站的参观 一、目的和要求 了解家畜配种站和公牛站各环节的实际操作,冷冻精液站的工业化生产流水线。 二、参观内容 (一)家畜配种站的参观 1.精液稀释液的配方、配制方法、稀释比例和受胎效果。 2.采精器械、容器的消毒和使用方法。 3.假阴道的准备、发情母畜或假台畜的准备,公畜的准备等。 4.采精的方法、特点及操作要领。 5.精液的检查和处理方法。( 6.母畜的发情鉴定方法,依据,发情鉴定的记录方法。 7.输精前发情母畜的准备、输精量和输精方法。 (二)公牛站的参观 1.观察用假阴道对牛采精的方法。 2.冷冻精液稀释液的配方及配制方法。 3.精液品质的检查项目和方法。 4.精液稀释倍数的确定和稀释程序。 5.平衡的方法和平衡时间。 6.冷冻前精液的分装、剂量和冷冻方式。 7.初冻温度的确定,降温速度和投入液氮的时间。 8.解冻方法和解冻后活力的检查,冷冻效果及冷冻精液品质的评定。 9.冷冻精液的标记、包装、保存和运输方法。 10.液氮的制取,使用液氮的安全措施。 三、实习报告 根据参观内容和要点,写出配种站和公牛站对生产环节的要求和生产流程。 四、实习提示 参观前先由教师介绍参观的内容和要点。到站后应请有关的技术人员,对该站的主要生 产情况和技术要求做一个总的介绍。然后分组进行有关部分的参观,并结合实际操作和生产 流程,请有关人员进行重点讲解。 实习十 鸡的采精和输精 一、目的和要求 通过实习,初步掌握公鸡的按摩采精和母鸡的输精操作技术。 二、材料和器械 (一)材料 公鸡、产蛋母鸡各8只 (二)用具 剪毛剪,集精杯,输精器,显微镜,纱布,保温瓶 (三)药品 稀释液 三、方法和步骤 (一)公鸡的按摩采精 1.一般由两人操作,保定员用双手各保定住公鸡的一条腿,使其自然分开,拇指扣住翅膀,使公鸡尾部朝向采精员,呈自然交配姿势。 2.采精员左手拇指为一方,其他四指为另一方,从鸡翼根部沿体躯两侧滑动,推至尾脂区,如此反复按摩数次,则引起公鸡性欲。 3.采精员的右手中指与无名指之间夹着集精杯,杯口朝内或朝外。 4.按摩数次后,立即以左手掌将尾羽拨向背部,同时右手掌紧贴公鸡腹部柔软处,拇指与食指分开,于耻骨下缘抖动触摩若干次,当泄殖腔外翻露出退化交配器时,左手拇指与食指立刻捏住泄殖腔上缘,轻轻压挤,公鸡立刻射精,右手迅速用集精杯接取精液。 .采集到的精液置于水温25~30?的保温瓶内以备品质检查或输精。 5 (二)精液品质检查 鸡精液的品质检查与家畜的基本相同,只是密度检查时有一种简单计数公式: C= n/100×l0亿 公式中C为精子密度,n为5个中方格的精子总数 正常公鸡的精液中畸形精子约占总精子数的5% ~10%。 (三)稀释、保存(参考家畜的) (四)输精 l.输精方法 (1)助手左手握住双翅,提起母鸡,令鸡头朝上,肛门朝下。右手掌置于母鸡耻骨下,在腹部柔软处施以一定的压力使泄殖腔开张,输卵管口翻出。此时,母鸡如有粪便即排出,然后将母鸡泄殖腔向输精员。母鸡输卵管开口位于泄殖腔内侧上方。 (2)输精员将输精器插人输卵管1 cm左右处,注入精液后,输精器稍向后拉,同时解除对母鸡腹部施加的压力。 2.输精剂量和有效精子数 使用新鲜原精液输精,通常用量为0.025~0.05 ml。每次输入呈直线前进运动的有效精子数至少5 000~7 000万,最好为1亿。 3.输精次数与时间 产蛋盛期的母鸡,每周输精一次,通常4~5 d输一次。在输精后48 h即可收集种蛋。输精时间,于大部分母鸡产蛋后,即在下午3点左右开始输精为宜。实践证明,母鸡子宫有硬壳蛋或母鸡于输精后2 h产出的蛋受精率最低。 四、实习报告 简述鸡的采精和输精技术操作要领。 五、实习提示 1.实习之前,教师带领部分学生对实习用种公鸡进行调教训练,按摩采精。 2.实习时,先教师讲解重点,示范采精、输精操作后学生由两个人一组轮换实习采精和输精。
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分类:高中语文
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