嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元的影响 .

嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元的影响 . 嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元的影响 2005年9月第40卷第9期ChinJOtorhinola~golHeadNeckSurg:September2005,Vol40,No.9 嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元的影响 羡慕魏永祥韩德民范尔钟刘仲燕苗旭涛张聪张欣 【摘要】目的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元(olfactoryreceptorneurons,ORN) 凋亡情 况的影响,并探讨这一造模方法的可靠件.方法取2月龄C57小鼠33只,随机分组后,实验组小鼠 行嗅神经切断术,通过辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)顺行神经示踪验证造模成功与 否.以脱氧核苷酸转移酶介导的牛物素dUTP缺口末端标记技术(TdTmediateddeoxyuridine triphosphate—biotinnickendlabelling.TUNEI)观察术后8h,2d,3d和5d嗅上皮中ORN的凋亡情况, 同时在蛋白和mRNA水平观察成熟ORN的特异性标记蛋白——嗅标记蛋白(olfactorymarkerprotein, OMP)在嗅上皮巾的表达情况.结果嗅神经切断术后嗅球中无HRP标记.TUNEL和OMP阳性反 应发生于ORN,嗅神经切断术后TUNEI阳性细胞数显着增多,并于术后第2天达到高峰,与此同时 OMPmRNA的表达水平开始着下降,并住术后第5天降至更低,嗅上皮的厚度也相应变薄.结论 本实验所采取的造模方法可以较可靠地切断小鼠的嗅神经,并造成小鼠嗅上皮中ORN的同步凋亡. 【关键词】嗅觉受体神经元;模,动物;脱噬作用 ImpactofolfactorynervetransectionontheapoptosisofmiceolfactoryreceptorneuronsXIA N Mu',WEIYong—xiang,HANDe—min,FANEr—zhong,LIUZhong—yan,MIAOXu— tao,ZHANGCong, ZHANGXirLDepartmentofOtorhinolaryngologyandNeckSurgery.BeijingTongRenHospital AffiliatedtoCapitalUniversityofMedicalSciences,Beijing100730,China Correspondingauthor:WElYong—xiang,Emailweiyongxiang@"sincacom 【Abstract】 ObjectiveToanalyzetheimpactofolfactorynervetransectionontheapoptosisofmice olfactoryreceptorneurons(0RN).anddiscussthereliabilityofthisexperimentalmode1.MethotisAfter olfactorynervetransectionofmice,anterogradehorseradishperoxidase(HRP)tracingwasperformedto confirmthecompletionofnervetransection.On8h,2d,3dand5daftersurgery.TdTmediated deoxyuridinetriphosphate— biotinnickendlabelling(TUNEL)wasusedtoobservetheapoptosisofORN, whilerelativesemi?-quantitativeRT?-PCRandimmunohistochemistrywereusedtoreflecttheexpressionof olfactorymarkerprotein(OMP,specialmarkerofmatureORN)inolfactoryepithelium.ResultsNoHRP labelwasobservedinolfactorybulbafterolfactorynervetransaction.BothTUNEL— possitiveandOMP— positivecellswereORN.Afterthesurgery,TUNEL— possitivecellsincreasedremarkablyandpeakedon2d afterthesurgery.MeanwhileOMPmRNAinolfactoryepitheliumbegantodecreasemarkedlytill5dafterthe surgery,andtheolfactoryepitheliumgotthinneraccordingly.ConclusionsThisexperimentalmodelCanbe usedreliablytosevermiceolfactorynerveandmanipulatesimultaneousapoptosisofmiceORN. 【Key word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 s】Olfactoryreceptorneurons;Modelsanimal;Apoptosis 健康哺乳动物嗅感觉神经元(olfactoryreceptor neurons,ORN)的平均寿命为30d.衰老或受损 的ORN发生凋亡,同时位于嗅上皮底层的前体细 胞——基底细胞增殖分化,不断产生新的ORN,使 基金项目:国家自然科学基金资助资助项目(30171004);北京 市自然科学基金资助项目(7042012) 作者单位:100730首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头 颈外科(羡慕,魏永祥,韩德民,苗旭涛,张聪,张欣),北京市耳鼻咽 喉科研究所(范尔钟,刘仲燕) 通信作者:魏永祥.Email:weiyongxiang@vip.sina.corn ? 67l? . 实验研究 嗅上皮的ORN数保持动态平衡J.临床上嗅上皮 最常见的病理改变为ORN减少'4J.而造成ORN 减少的原因是ORN的凋亡和再生之间的平衡受到 破坏,即凋亡速度超过了其再生能力J.正常情况 下只有少数ORN表现为脱氧核苷酸转移酶介导的 生物素dUTP缺口末端标记(TdTmediated deoxyuridinetriphosphate—biotinnickendlabelling, TUNEL)反应阳性,即凋亡状态.为了模仿病理 状态下的ORN减少,便于研究此时嗅上皮内发生的 各种变化,为人为干预ORN凋亡提供实验平台,采 取实验手段使嗅上皮中的ORN发生同步凋亡.嗅 2005年9月第40卷第9期ChinJOtorhin 神经切断术是一种较为常用的造模方法,但较多应 用于大鼠等体型较大动物,目前尚缺乏小鼠嗅神经 切断术的经验.本实验采取一种相对简单的手术方 法切断小鼠的嗅神经,并通过辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase,HRP)顺行神经示踪的方法 证实嗅神经确实被完全切断,使用TUNEL法观察术 后8h,2d,3d和5d嗅上皮中ORN的凋亡情况,并 对小鼠的嗅上皮进行分子生物学,组织病理学和免 疫组化研究,从而观察嗅神经被切断后嗅上皮内发 生的一系列变化. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 一 ,动物分组及手术 1.动物分组:实验动物选用2月龄C57小鼠 (由中国医学科学院实验动物研究所提供,17, 20g),雌雄不限.将实验小鼠采用数字表法随机分 为对照组(5只)和实验组(28只),对照组小鼠在术 后2d处死.实验组小鼠分别随机在术后8h,2d,3 d和5d处死.分组方法详见表1. 表1动物分组及检测项目(只) 注:RT-PCR:反转录聚合酶链反应 2.嗅神经切断术:手术方法参照文献[6],实验 组小鼠以3%水合氯醛(5ml/kg)腹部皮下注射麻 醉.取俯卧位固定小鼠,头顶备皮,碘酒,酒精消毒 皮肤.于解剖显微镜下行矢状切口切开头顶正中皮 肤,切口长约0.5,1.0cm.钝性分离颅顶肌肉及 骨膜.于矢状静脉窦,鼻额缝与眼眶上内侧缘之间, 以直径1mm的金刚钻头耳科钻左右各钻一孔,孔 径约1mm,深度至暴露嗅球,同时不损伤嗅球.使 用显微解剖镊提起嗅球前端的硬脑膜,以细针沿颅 前窝颅内侧骨面锐性切断嗅神经,尽量避免伤及嗅 球,明胶海绵压迫止血.伤口处点青链霉素,缝合伤 口.对照组其他操作均与实验组相同,仅于颅顶钻 孔后即缝合皮肤,不伤及嗅球及嗅神经. 二,HRP顺行神经示踪 麻醉方法同前,小鼠取仰卧位,20%HRP (RZ3.1SigmaIV,美国)使用微量注射器注入小鼠 双侧鼻腔,每侧10IxL;注射后24h按Mesulam等的 方法经心灌注,固定,连同部分大脑额叶取出嗅 球,保存,连续冰冻横切,片厚20m.取横截面最 宽的切片行四甲基联苯胺(tetramethy1benzidine, TMB)成色反应,封片后观察HRP标记. 三,嗅黏膜标本的制备及病理形态学观察指标 断髓处死小鼠,断头;剪断鼻前庭部,锐性分离 外鼻皮肤;掀起鼻顶,取出鼻中隔;分离嗅区,鼻中隔 及鼻甲表面黏膜.10%甲醛固定,常规石蜡包埋, 4m连续切片,进行HE染色,TUNEL反应及嗅标 记蛋白(olfactorymarkerprotein,OMP)免疫组化染 色.观察指标:嗅上皮的厚度,ORN,支持细胞与基 底细胞等结构. 四,TUNEL 使用原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山公 司),并按照说明书的操作步骤标记凋亡细胞核. 结果判定:当细胞核出现棕黄色颗粒时判为TUNEL 反应阳性细胞. 五,OMP免疫组化染色 采用SP—ABC法,一抗为1:800山羊抗人嗅标 记蛋白多克隆抗体(由Dr.FrankMargolis惠赠). SP试剂盒,DAB试剂盒均购于北京中山公司.阴性 对照以PBS缓冲液代替一抗.结果判定:当细胞质 内出现棕黄色颗粒时判为OMP阳性细胞. 六,相对半定量反转录聚合酶链反应(revers transcriptionpolymerasechainreaction,RT—PCR) 使用TRIzol(Invitrogen)提取组织总RNA,紫外 分光光度法确定RNA的纯度和浓度.行两步法 RT—PCR:取2IxgRNA在M—MLV反转录酶 (Promega)催化下合成cDNA.取2.5IxLcDNA在 Taq酶(Promega)催化下行PCR反应.以B一肌动蛋 白(p—actin)为内参分管扩增.参照文献[8],p一肌 动蛋白引物序列为:F:5一GACAGGATGCAGA AGGAGAT一3.R:5一ITGCTGATCCACATCTGCTG一 3,扩增产物长度315bp,退火温度为59?,扩增30 个循环.OMP引物序列为:F:5.GACATrCTI" CTAGCTGCTCC一3.R:5一CAGCTITGGCCAGCAGG 扩增 G--3,扩增产物长度354bp,退火温度为63?,35个循环.阴性对照以去离子水取代Taq酶.取 10扩增产物行2%琼脂糖电泳.凝胶成像系统 (ViberLourmat)扫描成像,BIO2D分析软件测量并 量化特异性条带灰度,通过同一标本的B.肌动蛋白 小I唯【型萱莹【-型—?—一.r2…(RI5673 对OMP的条带灰度进行怕准化.眩比虮代表OMP mRNA的表达情况 L统学处理 采用SISS110缝I?软件包刊结界进行One- WayANOVA单l索7J蓐分析,【I…表示嗅神纬 切断术不同叫问点OMPmRNA的表进情况.1( 005为筹开打统计学意义 结果 ,嗅神经坷断术后嚷球IIIII.怀 刘』{}{i小融嗅球晌麻部位可人H『il]标 记(图1],而在嚎神经}JJ断术后8l?,2d,3d和5d, 在嗅球的神经和小球则均术见艟色颗粒状的 IIRP标t2) 二,ORN的栅 TUNEI眨应mtl=细胞的细胞核栋黄色在 对照组小鼠的嗅卜皮.仪_仃少数细胞核为FUNEL反 应阳胜(【习3).嗅神经切断水后8h,即可观察到阳 性细胞数增多.2d州TUNEI.法标【『【勺揣亡细胞核 数达到高峰(图4),井且这细胞帕细胞核大多仳 于嗅I皮的-?去第5天时叉比旃2凡I珂显减少 二,免疫组化和柑埘牛定Itr—IfIR测量嗅黏 膜中的OMI 主要分布于细胞质 OMIjH性反应棕掉也, 与ILI法邻切片的OMI'免疫封1化染色旺实. NEI.反膻性细胞OI{N嗅神始四断木后5d 内.?舆上应的高度逐渐F降,OMP阳性细胞数电相 麻逐渐啦少.但无巾性粒细l地浸润,充血等急性炎症 丧现(1刳5)|刊6示B-肌动蚩白和OMP的RT-PCR 反应物条带位置,与期待』物长度相符B-肌动 蛋向晌表达量在嗅神纬切断术后:时点基本恒 定.B一?L动蛋白条带灰度标准化的OMP条惜灰 度存对照纰以技术后8h2d,3d和5d分别为: I499?030,1320?l2270?l_03264?096 和【54?083.经(h?|1wANOVA因素差分析. 从杞昏筲;2天起均较对照组有叫显碱少(P<n05) 一 1IRP崩J'评价造模成功与 1IRP慨行神经示踪的原理为将HRP射于神 经儿胞体所在部位.1IRP随即设神经元胞体通过非 特异性整体胞饮(hulken—s)的方式摄^.沿 神经轴突运输至神经束梢,然后用组织化学法显 HRP标若神经轴突被完全断.则许抻经未 梢(本实验中为嗅球的小球层币?冲经层)不会观察 到HRI'怀记因此,这是一种客观评价嗅神经足否 被完全岍断的实验手段.Yl等通过Hlu顺行 神经乐踪.发现丁=人鼠嗅神经?断术后第10天方 直m熟ORN胞(胞质棕&1数IILmJ;々J窿均J,降I)Mpm癌i化x4fm 674?生lE竖口l壁塑!盟篮.!(】f)I!Jj里c挂羔!塑 6OO 黜 3,30 2Cm 600 500 400 3cl0 嗔标记蛋白 f34) — a:un 015b曲 】:标记物.2:对照尊1.3:求鬲8h鲥.4:t!一I玳.5:术3 组.6:水再5d 图6I晦标蚩IIB肌站拦f_『一琼情持电泳 观察到嗅球与嗅神经间突触联系的恢复本实验术 后5d内均未在嗅球内l观察到IIRP标记,醣明这一 实验模具有相当的彻底性相驱复性. 二,嗅神经断建奇r)RN耐亡动物模型 Magrassi等1995年通过rUNE1.法,电镜 和光镜观察证实在J嚣成年夫鼠的嗅I:皮存在细胞 凋止常情况F有少数ORN发生凋f:能 加速细胞凋r:的实验慎型位{-螟球除术和嗅神经 切断术,梆是通过传人神经阻淞和剥夺来自靶纲胞 的营养千,选择性地造成嗅上发内的成熟ORNI司 步凋亡,嗅上皮内的其他卸{胞包括轴突未长人嗅球 的未成熟ORN在内,皆不受到直接旧损害…在本 实验中,TUNE[法l正实嗅神经断术可以造成嗅1 皮内的凋亡ORN数rI箸增多.井】二术后第2天达 到高峰,与以北的类似研究绱粜一敛"'. 嗅神经切断术对嗅皮的影响 , 嗅黏膜分为上应层年1_『肇底层嗅上皮足似复层 柱状『皮,主要r}1支持圳旭,基腻细胞和ORN构成 如果仅凭借HE染色进i分,唣【.皮与呼吸f皮 的区别丰要在r=?ii~;-i嫂上皮有凡量的杯状细胞. 而嗅J-皮内没有或极少虬;?魄鼎憷的基腋层含有 Bowman腺和嗅神经束'.;?:OlIN的存在. 嗅I皮尤其是啮齿类动物的喂上皮细胞核的层数远 多lr呼吸[皮根据以上标准gq嗅上皮后,观察 发现嚷种经断术后5[{内,嗅I.皮的厚度逐渐 下降 OMP是成熟ORN的特异性标记蛋白"= L?--llJ!【! TUNEI法相邻切片的OMP免疫组化染色征实,嗅 上皮中发生凋亡的细胞为成熟ORN相对半定量 RT.PCR法删量嗅黏膜中的OMP111RNA,反映了嗅 神经断术后.成熟ORN的降趋势闭此,手术 引发ORN州I'的直接结果就挫成熟ORN减少,嗅 『皮变薄 由于细胞揭亡是造成临床上常见的嗅觉障碍, ORN减少的主要原因.成功建直ORN凋亡的实 验模型,是在悼研究ORN凋亡和再生及嗅觉障碍 的基础,存此平台上n1.以进行一系列研究,包括参与 调节ORN搁亡和再的细胞凶产,影响ORN凋t: 与再生动态平衡的因素,ORN前体细胞的增殖和分 化,嗅神经与嗅球突触联系的霞新建立,人为=F预嗅 感觉神经兀捌亡和冉生的效果等等 近年来.关j二嗅觉系统神经再生能力的研究逐 渐成为热点.本实验采取一种相对简单的手术.证实 这一造模方法的有效'比和可重复性,为今后进行进 一 步研究奠定了基础; 参考文献 _霍?引啊?m_三i 0暑j,m ??勘?… , K"2j.. . (L{ :=呻,_量 ,篓誉薹一67890,: