纳豆激酶发酵及冻干粉制备

纳豆激酶发酵及冻干粉制备 曾志刚1，王刚2* （1. 中国医药集团四川抗菌素工业研究所，成都610052） （2. 四川省食品发酵工业研究设计院，成都  611130） 摘要: 以纳豆菌为出发菌株，在300立升发酵罐中液体发酵生产纳豆激酶并进行了提取分离，制备了纳豆激酶冻干酶粉，并考察了其热稳定性。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明：根据发酵时间与酶活力的关系，发酵培养时间需要控制在20hr以内，由于泡沫会使得酶失活，应当控制发酵罐中泡沫，通过硫酸铵分级沉淀获得纳豆激酶粗提物，制备的纳豆激酶冻干酶粉活性在有明胶保护的情况下非常稳定，冻干粉在60℃保存6天的条件下，酶活力没有受到显著的影响。 关键词: 纳豆菌，纳豆激酶，热稳定性 Fermentation of nattokinsae and preparation of freezd-dried powder Zeng Zhi-gang1,       Wang Gang2*  (Sichuan Industrial Institute of Antibiotic,China Pharmaceutical Group, Chengdu 610052) （2.Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries,Chengdu 611130） Abstract: The liquid fermentation process for nattokinase by Bacillus natto in 300l fermentor,and separation of nattokinase,and the temperature stability of nattokinase freezd-dried powder were studied. The results showed that, the liquid fermentation process should be stopped in 20hr according the relation of fermentation time and nattokinase activity and should control the foam because the foam made the nattokinase lose the activity. Nattokinase extract was acquired by ammoniun sulfate grade ricipitation, the activity of nattokinase freezd-dried powder was strongly protected by the presence of gelatin,was not significantly affected when the nattokinase freezd-dried powder was stayed 6 day at 60℃. Key words: Bacillus natto;nattokinase; temperature stability 纳豆在日本已有2000多年的食用历史，它是由大豆经过发酵而制成；其中的纳豆激酶(nattokinase，NK)是纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus natto)在发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶，有防治心脑血管血栓形成的作用[1，2]。国内外关于其菌株筛选、发酵优化、纤溶性能、提取分离及制剂等方面的研究方兴未艾，但是多是从实验室摇瓶发酵的角度进行研究分析，本文利用四川抗菌素工业研究所的中试基地良好条件，从中试生产的角度，对纳豆菌的发酵过程，提取分离过程及酶粉原料制备等方面进行了研究，许多研究参数是无法通过实验室摇瓶工艺获得的，该研究更加接近大生产的实际情况，因而该研究的工艺过程及参数更加具有参考性及实用性。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1材料 纳豆菌：重庆西吉瑞有限公司提供；纤维蛋白原购自中国医学科学院输血研究所；尿激酶购于丽珠集团丽宝生物化学制剂有限公司；凝血酶购于杭康生物药业。 1.2 培养基 斜面培养基：大豆蛋白胨 0.5％，牛肉膏 0.5％，NaCl 0.5％，琼脂 1.5％ 种子培养基：大豆蛋白胨 0.5％，葡萄糖 0.5％，NaCl 0.5％，pH 7.2，自来水配置 发酵培养基：大豆蛋白胨 1.5％，葡萄糖 1.5％，甘油 0.8%，NaCl 1.5％， KH2PO4 0.2%，MgSO4 0.05%   pH7.2，自来水配置 1.3 发酵 1.3.1 摇瓶种子制备 将甘油冻存菌种转接至斜面培养基。37℃培养18hr，取一环斜面菌种，接人装有2ml种子培养基的试管，在恒温水浴震荡器中，37℃、20Or／min培养12hr。将该种子液2ml转入装有100ml种子培养基的摇瓶，37℃、20Or／min培养12hr。 1.3.2 罐种子制备 将培养好的摇瓶种子液100ml在火焰保护下倒入10升种子罐中，种子罐装有5l种子培养基，培养条件为转速260r/min，温度37℃，空气流量24l/min，动态监控种子生长状态。 1.3.3 发酵罐培养 将培养好的种子液5升经过管道压入到300升的发酵罐中，发酵罐中装有200升发酵培养基，温度为37℃，转速及空气流量动态调整。 1.4 纳豆激酶粗品分离纯化[3] 放罐后，板框过滤进行固液分离，将发酵清液压入到300l的储罐中，调pH为8.6，逐渐缓慢加入硫酸铵达到20%的饱和度，搅拌4hr后静置过夜后进行板框过滤，将滤液又压入储罐中，再往滤液中继续加入硫酸铵达到约60%的饱和度，搅拌4hr后静置过夜后进行板框过滤，溶解酶蛋白沉淀，超滤脱盐获得纳豆激酶粗品澄清液。 1.5 纳豆激酶酶粉制备、检测及稳定性考察 取纳豆激酶粗品澄清液3份，分别加入甘露醇，冻力220的明胶溶液，使得它们在酶液中的终浓度分别为5%和0.5%（W/V）；将两组分装在安培瓶中，每瓶0.5ml，在真空冻干机中冻干，随后对各组冻干品取样分别放置在4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下保存，每隔一段时间取样重新溶解测定样品的相对酶活力。 1.6纳豆激酶活性测定方法[4 ] 取1.5%琼脂糖液8ml 55℃温育，取1.8ml纤维蛋白原液加入到6.2ml生理盐水中，两者混匀，取0.4ml凝血酶溶液溶解在3.6ml生理盐水中，立即倒入纤维蛋白原和琼脂糖的混合液中，摇匀，倾倒在9cm×9cm平皿中，静置1hr，备用；用生理盐水溶解尿激酶，配置为不同浓度的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液，分别为500IU/ml，250IU/ml，125IU/ml，62.5IU/ml，31.25IU/ml，15.6IU/ml，7.8IU/ml，3.9IU/ml；精密量取尿激酶标准品溶液各10μl,分别点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温箱中反应18小时；取出要用卡尺测量溶圈垂直两直径，以尿激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算标准曲线回归方程，再以该方法测定各样品中的纳豆激酶的活力。 2 结果与讨论 2.1 尿激酶活力标准曲线 纳豆激酶活力的测定是以其相对于尿激酶的单位来表示的，图1的标准曲线有较好的相关性，其它样品可以按照该方法进行酶活性检测，如果活行在线性范围外，可稀释处理再测定。 图1  尿激酶活力标准曲线 2.2发酵及分离纯化 种子罐中的菌株生长较迅速，每两个小时取样，600nm条件下测定其OD值，绘制出种子生长曲线（图1），从曲线可知，菌株的适应期较短，且生长迅速，4~10hr为对数生长期，试验过程中，我们选取10hr左右种龄的种子液接入发酵罐中。 图2  种子生长曲线 在发酵的过程中动态取样进行酶活力的检测，结果见图3，结果表明，在该条件下，菌体产酶的时间较早，6hr左右已经检测到少量酶活力，18hr基本达到峰值。取样发现，发酵液在培养16hr后逐渐变得有粘性，随后粘性明显增加，在20hr左右，发酵液出现较多的泡沫，这主要是由于纳豆菌在发酵的过程中逐渐产生了具有粘性的γ-多聚谷氨酸的缘故，我们通过降低空气流量，转速来控制起泡程度，使其稳定在可控的范围内，但是该阶段的酶活力出现了大幅下降，结果见图3中的曲线1，出现该现象的原因可能是大量的泡沫，有可能使得产生的纳豆激酶附着在泡沫表面，表面张力的变化使酶的分子结构发生变化而不断地失去活性。在随后的一次发酵试验中，我们通过在发酵后期根据罐内泡沫情况使用流加泡敌的方式来控制泡沫生成，其酶活力曲线见图3中的曲线2，从曲线2可知，酶活力没有明显的下降，这一结果也提示在发酵罐中培养纳豆菌的过程中要注意控制泡沫的大量生成，以免纳豆激酶大量失活。另外，从能耗及产酶量方面来比较，可以考虑将培养时间控制在20hr以内。 纳豆激酶在硫酸铵饱和度为20％时，沉淀中酶活单位很少，因而分离纯化纳豆激酶时，首先采用20％饱和度硫酸铵沉淀除去杂蛋白，再用60％饱和度硫酸铵沉淀沉淀大部分纳豆激酶。 1 后期未补加消泡剂  2 后期流加消泡剂 图3 发酵罐酶活力曲线 2.3纳豆激酶冻干酶粉热稳定性 安培瓶中冻干的样品的酶活力计为100%，测定出各个试验组样品的相对酶活力，试验结果见表1，数据表明，甘露醇组受到温度的影响比较大，活性下降程度与温度高低，时间长短成正比，尤其是在50℃以上的温度下酶活力大幅下降，甚至降到0.而明胶组则几乎没有受到试验温度的影响，在60℃保存6天的条件下，酶活力几乎没有降低。因此，冻力220的明胶比甘露醇更加有利于提高纳豆激酶的热稳定性，应该选择冻力220的明胶作为纳豆激酶的保护剂，这非常有利于以后酶粉及胶囊剂的保存和销售，同时有利于口服制剂的生产。 表1 纳豆激酶冻干品的热稳定性相对酶活力   甘露醇组(%) 明胶组(%)   0d 2d 4d 6d 0d 2d 4d 6d 4℃ 100 101 99 100 100 99 101 100 20℃ 100 99 102 99 100 99 102 101 30℃ 100 99 99 100 100 100 101 99 40℃ 100 98 80 60 100 101 101 100 50℃ 100 50 35 20 100 101 100 99 60℃ 100 5 0 0 100 100 100 99                   3 结论 纳豆菌为在发酵罐中进行液体发酵生产纳豆激酶时由于逐渐产生具有粘性的γ-多聚谷氨酸而产生大量且较持久的泡沫，这给大规模工业生产带来较大的麻烦，因为消泡剂的大量加入会影响后续的提取过程，所以需要选择消泡能力强的消泡剂从而减少用量，或者筛选γ-多聚谷氨酸产量低的纳豆菌，这需要进行进一步研究。 总而言之，本研究从中试生产的角度，获取了相关的中试数据，为下一步更大规模的纳豆激酶发酵和纳豆激酶冻干粉的制备提供了参考数据。 参考文献 [1]谢秋玲，郭勇．一种潜在的溶血栓药物——纳豆激酶，药物生物技术，2001，8(1)；51~53 [2]陈志文，徐尔尼，肖美燕．纳豆激酶的研究进展，食品科学，2002，23(10)；130~134．