幽门螺杆菌毒素相关蛋白CagA通过microRNA促进胃上皮细胞间质转化

幽门螺杆菌毒素相关蛋白CagA通过microRNA促进胃上皮细胞间质转化 ,,小„, 幽门螺杆菌毒素相关蛋白,,,,通过 ,,;,,,,,促进胃上皮细胞间质转化的研究，乏,, ? 指导教师签名:—二—』单 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 作者签名: 论文评阅人,: 王晓稼主任医师 浙江省肿瘤医院 评阅人,: 评阅人,: 评阅人,: 评阅人,: 答辩委员会主席:杜勤主任医师浙江大学医学院附属第二医院 委员,:吴勤动主任医师浙江大学医学院附属第二医院 委员,:昂健副主任医师浙江大学医学院附属第二医院 委员,:王良静副主任医师浙江大学医学院附属第二医院 委员,:孟丽娜主任医师浙江省中医院 委员,: 答辩日期: ,,,,年,月,,日 ,,煳嘶 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘茎或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作毛,, 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 签字日期: ,，,年箩月?,蝠 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂 有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 导师签名: 五 戥,善。 , 签字日期:,卅、年，月铅角 签字日期:,夕，哞歹月?黾 、 致 谢 值此论文完成之际，谨向辛勤培养我„,》、,工 浙江大学硕士论文 致谢 的导师王彩花和朱永良教授致以最衷心 的感谢～感谢导师在学习、工作、生活中给予的悉心关怀、严格要求和不倦教诲( 王老师和朱老师严谨勤奋的敬业精神，一丝不苟的治学态度，求实的科研作风，, 渊博的知识，独特的临床思维给子我巨大的启迪和帮助，使我受益匪浅。他们勤一 奋的学习态度，忘我的工作作风和良好的医德医风，也深深地影响了我，鞭策我 时刻奋发向上～ 在此特别感谢朱永良老师在课题设计、实验的 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 、安排和实施过程中给予 的中肯建议和无私帮助。他待人真诚、乐于助人，无论我遇到任何困难有求于他 时，总是热心相助。他谦虚谨慎、求真务实的精神给我树立了一个榜样～ 最后感谢我的父母及家人和同事，是他们对我生活上的支持和精神上的鼓励， 使我在任何时候都能充满信心，克服困难，完成学业～ 感谢所有帮助和关心我的老师和朋友, ,,,,年,,月,,日?、，? ,, 浙江大学硕士论文 中文摘要 幽门螺杆菌毒素相关蛋白;,,,通过,,;,,,,,促进胃上皮细 胞间质转化的研究 浙江大学医学院 内科学(消化专业) 硕士研究生 楼晓军 导师 王彩花、朱永良 摘 要 实验目的: 探讨幽门螺杆菌(,,)毒素相关蛋白(,,,,)在胃上皮细胞间质转化 (,,, ,,,, ,,卜,,,,,;,,,,, ,,,,, , , ,,,，,,,)发生发展中的致病机制。 实验方法: 首先建立稳定表达;,,,的,,,细胞系，然后分别对,,,,转化的胃癌,,,细胞和空载体对照组细胞用哺乳动物,,,,,表达谱芯片检测以筛选可能改变的,,;,,,,,(,,,,,);用荧光虫酶报告基因方法和,,,,,,, ,,,,检测相应,,,,,共同作用的重要靶分子;沉默靶分子观察对胃上皮细胞,,,和干细胞比例的影响。结果: 发现,,,—,,,一,,,和一,,,,在;,,,转化细胞中表达出现了上调，先锋转录因子,,,,,是,,,—,,,一,,,和一,,,,共同作用的重要靶分子，沉默,,,,,的, ,,,,细胞,,,,，;,,,,，细胞百分比出现明显减少，而;,,,，细胞百分比明显增加，,,,(,,。,,,,,沉默细胞形态由梭型变为小圆型，,,,,,,, ,,,,检测发现,—;,,,,,,,表达下降，,,,,,, ,,表达增加( ?浙江大学硕士论文 中文摘要结论: ,,,,,,,一,,,和一,,,,通过下调,,,,,促进了细胞的,,,过程和干扰了细胞的发育和分化，通过,,,,,途径是,,,,蛋白新的致病机制。关键词:幽门螺杆菌;,,,,蛋白;,,,,,;,,,,,;上皮间质转化 , 浙江大学硕士论文 英文摘要 ,,, ,,,,,,;, ,, ,,,,;,,,;,,, ,,,,,, ,,,,潞,，,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,，,,，,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,; ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,,,,, ,,,;,,,,,? ,,,,;,, ;,,,,,, ,,,, ,,,,眦,,,,,,埘 ,,,,;,，,,, ,,,,,, ,,,(,,,, ,,,,,,, ,,, ,抽, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,;, ,,,,;,,,鹤 ,, ,,,,,,,?,, ,,,,,,，,,; ,,,;,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,,，,, ,, ,,,,,,,,,,—,,,,,;,,,,,臼咖【,,,,,,,(,,,),，, ,勰,,,;印,,,,,,啪;,,,, ,, ,,, ,,,,;,,,;,,, ,,,,,,(,,),,,,，,,佗,锨粗,,,,,,,, ,,,,( ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ;,,,, ,,,;, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,，,,,, ,,,, ,,加加,】, ,披,, ,,,,,,,,,, ;,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,?, ,,,，，,;础;觚;,, ;,,,, ,,, ,,,,,, ;,耐,, ;,,,, ,, ,;,;,, ,,,,呲,,, ;,肌,,, ,,,;,,砌、『,， ,,,, ,,,,,,,;,,;,缸,;, ,，,,,,舱,,?,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,,, ,,, ;,,,,,,,,,,，,, ,,,,, ;,,,,, ,,,, ,, ,,,,;,,盯,,略,,,，,,,,,,, ,，删,,, ,,,, ,,,,;,,,, ,,？驴,, ,, ,,,,,,, ,,砌,,,; ,,吐圮,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,吐,,,,,, ;,,,, 赳,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ;,,,,( ,楣,，,, ,(, ,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,—,辞,,, ,,, ,,,, 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,的活性在转染,,,,,,,,,调…………………(,, ,后明显增强……………………………((, 图,, 过表达，,,,,,,,,,,可以沉默,,(,; ,的抑制因子(,】,沁)……………,, 图,, 通过,枞沉默,,?可增强,,(,; ,的活性………………………………(,, 图,,在,,,, ,,,,,重组质粒瞬时转染的胃癌,,,,,,,细胞中,,,,,,,,,,活性 有显著上 调……………………………………………………………………(,, 图,, ,(,,,上调,,,,,,,,,………………………………………………………,, 图,,潜在目标筛选策略示意图……………………………………………………(,, 图,, ,,,(,,,,,和(,,,,作用关键靶转录因子筛选……………………………((,, 图,; 共转染,,,(,,,,,,,或,,,,,和重组,,,, ,印,,,,,可抑制,,,,的,,,,,,酶 活性……………………………………………………………………………(,, 图,, 转染,,,,,,,,,,和(,,,,后,,,,,出现了约,,,的下调……………………(,, 图,,沉默,,,,,后,,,分析,,,,，,,,,,，细胞百分比和、?,,,,, ,,,,检测 ,，,, ,……………………………………………………………………………,, 图,, 沉默,,,,,后,,,,,, ,,,,检测,(;,,,,血及,,,,,,,，,………………………。,, ?浙江大学硕士论文 缩略词表 缩略词表 ,, ,,,,;,,,;,,, ,,,嘶 幽门螺杆菌 ,?,( ,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,，,,,,,,, 细胞间质转化 ,讧蝌, ,,;,,,,, 小,,, 细胞毒素相关基因, 、:? ,,,, ,,,,,,,,，,弱,,;,,,,, ,,,, , ,,, ,哪,，, ,舔,,, ; ,,,,,;,,;,,,,, ,,,?圮,,,, 人胃腺癌上皮细胞 , ,,以, ,, ,～虹圮,,仃孤,,,,,,,,,, ,,;,,, ,, 叉头转录因子,, ,，， 目 录 致 谢………………………………………………………………………， 中文摘要…………………………………………………………………? 英文摘要…………………………………………………………………? 插图和附表清单……………………………………………………………? 缩略词 表…………………………………………………………………? 正文, 引言…………………………………………………………………, 材料与方法…………………………………………………………, 结 果…………………………………………………………………, 讨 论…………………………………………………………………, , 结论…………………………………………………………………,, 参考文 综献……………………………………………………………,, 述…………………………………………………………………,, 作者简介及发表文章……………………………………………………,,? ? 浙江犬学硕上论文 引言 幽门螺杆菌毒素相关蛋白,,,,通过,, ;,,,,,促进胃上皮细胞闻 质转化的研究 浙江大学医学院 内科学(消化专业) 硕士研究生 楼晓军 导师 王彩花，朱永良,引言 幽门螺杆菌(,,)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要诱因之一，且,,感染与胃癌、胃粘膜相关性淋巴瘤(,,，,)的发生发展关系密切。国际抗癌联盟已将,,列为，类致癌物,。?。中国是,,感染率和胃癌发病率最高的国家之一，并以,,毒素相关蛋白(,,,,)阳性的，型,,菌株为多见,,。,,,,蛋白可被其，,型分泌系统注入粘附的宿主细胞，在,,与肿瘤相关性的研究中发现;,,,在参与胃癌前期病变、胃癌和,,，,淋巴瘤的发生发展中起重要作用，已证明,,,,是个细菌源性的肿瘤相关蛋白,。,,。因而，阐明;,,,蛋白致病机制对有效干预阻断胃癌前期病变，预防和降低胃癌、,,，,的发病率具有重要意义。 ,,,,蛋白具有多种致病机制。;,,,蛋白可以非磷酸化依存方式破坏,,;,细胞的顶端紧密连接复合体，使细胞间屏障受损，造成胃粘膜上皮间的“屋顶漏”现象伸,。,,,,蛋白被，,型分泌系统注入宿主细胞后，定位于细胞膜，胞浆中的;(,,;和,激酶将其,,，,,重复序列中的酪氨酸磷酸化，磷酸化,,,,蛋白与一个真正的肿瘤蛋白,肿(,结合并激活,耶(,的酶活性，导致,,,,,,通路活化，引起细胞有丝分裂活跃，细胞增殖加快，诱导细胞分泌因子和炎症趋化因子，活化,,—, ,，,,(,，诱导细胞;(,,,，;(,,,，;(，,,,等基因表达增加;,,,;,,应激纤维高度极化而使细胞骨架重构出现细胞离散，出现“蜂鸟”样改变一？?。在先前的研究中我们还发现;,,,可转化条件永生化的,，,上皮细胞，对转化的,?细胞分析发现,,,,蛋白以一种独立于,,,瓜,,厄,,,,,的方式直接激活,,,,,,酶活性，激活的,,,,,,途径直接导致了浙江大学硕士论文 引言,正细胞的转化，抑制,,,,,,活性后，转化细胞的增殖活性被显著抑制, ,,。对永生化的,淋巴细胞研究发现;,,,激活的,,,,,,通过促进,,, ,,,,,,磷酸化而抑制羟基脲诱导的凋亡, ,,。,,,,,,, ,等发 现人源化,,,,具有强的,耶(,结合活性，,,,,转基因小鼠在第,,周可发生胃癌和,,,,淋巴瘤,,,;,,,,, ,等发现;,,,通过,皿(,激活微管相关蛋白激酶(,,,,)而致细胞有丝分裂时染色质分裂的异常,卯。,,,,蛋白除了上述致病机制外，是否还存在另外新的致病机制呢,目前尚无文献报道。 ,,;,,,,,,(,,,,,,)是一类分布广泛的由约,,个核苷酸组成的非编码单链,,,,，在哺乳动物细胞,,,,,,多通过不完全的碱基配对和,,,,,的,?非翻译区(,,,,)结合在转录后水平上抑制基因翻译而反向调控靶基因的表达,,,。现有研究表明,,,,,功能与细胞生长、发育、分化和应激等密切相关，它们调节了多种生物学信息通路。如,,,(,,,控制哺乳动物血细胞分化为,细胞,,,;,,,(,,,调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌,引;,浓(,,,在脂肪细胞分化起作用;,诹(,,,参与了哺乳动物四肢形成,引;,依(,基因与心脏发育有关,们。在肿瘤的发生发展过程中,,,,,表达也出现了显著改变，,,,,,可起到肿瘤抑制基因或癌基因的作用。乳腺癌干细胞通过下调,,,一,,,;而维持其干细胞状态,?;,,,(,,和,捩(,,,,(,通过调节盯,,和,,,,参与了细胞的癌变过程九;白血病和淋巴瘤中,,,一,,,和,,,一,,—,缺失或下调，导致了,;, ,表达的升高口,,。近年研究发现,,感染可以改变一些,,,,,的表达旺,?,卯，,,感染是否通过,,,,蛋白影响,浓,,的表达,目前仍无报道。 本研究中我们通过建立稳定表达,,,,的,,,细胞系，用哺乳动物,,,,,表达谱 ?芯片检测在,,,,转化细胞中表达出现上调的,,,,,;并在转录因子水平检测上调的,,,,,作用的重要靶分子;进一步沉默该靶分子，以观察其对细胞的,,,过程的影响。现报告如下: , 浙江大学硕卜论文 材料与方法 ,材料与方法 ,(,(细胞培养 胃癌,,,和,,,,,,,细胞均来源于上海中科院细胞库，均培养于含,,, ,,，,,,青 霉素，,,,?‖,,链霉素和,,,胎牛血清的,,,， ,,,,培养液，每,,,天传代,次;大 肠癌,,,,,细胞培养于含,,, ,,,,,青霉素，,,,“‖,,链霉素和,,,胎牛血清的,,,乒 培养液，每,(,天传代,次。, ,(,(细胞转染 建立稳定表达,,,,的,,,细胞系采用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的磷酸钙沉淀方法。严格按操作说 明进行。即,,衄培养皿培养的,,,细胞在转染前, ,换新鲜培养液。取,“,的;,,, ,,,,,(;,质粒和,,(, , ,的, , ,,,,,，加水至,,, , ,，混匀;并缓慢加至,,, , ,的 ,×,,,液中，室温放置,, ,,,，混匀后加至转染细胞表面，,,?，,,,,,培养,, ,，冲洗细胞表面，换新鲜培养液，转染,, ,后细胞,:,传代，次日加入,,, , ,,,, 的,,,,进行药物压力筛选，持续筛选,—,,天。待细胞克隆长大后，用,;,和,,, 测序进行验证。同时建立稳定表达空载体,,,,,(;,的,,,对照细胞系。 瞬时转染细胞系方法采用,,,,,,;,,,, ,,,,脂质体或,,,,,,蛐,转染方法。严格 按操作说明进行。即取, , ,的质粒加,,,，—,,,培养液到,,, , ,，混匀，分别加入 ,,,,,,;,锄,，,, ,,,,脂质体或,,,,,,皿,“,，混匀，室温放置,, ,,,后加至,, ,, 平皿的细胞中，混匀，,,?，,,,,,培养,, ,，收集细胞。 ,(,(,,;,,,,,筛选 用,,,,,，试剂提取稳定表达;,,,或空载体的,,,细 胞,,,，送北京博奥生物科 技有限公司进行哺乳动物,垠,,表达谱芯片检测。检测结果与对照组比较，凡,, 倍或,,倍者为有显著改变。 ,(,(,,？,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,成熟体检测采用,,，公司的,,？,,, ,,,,,,,, ,,,方法，严格按操作说明 进行。即首先用,,,,,,试剂提取,,,细胞,,,，,,,定量，取,, ,,的,,,分别加入浙江大学硕士论文 材料与方法,,,(,,,,,,,和(,,,,成熟体特异性引物后进行逆转录，,,?,, ,,,，,,?,,,,,，,,?, ,,,灭活。分别取逆转录后产物和,,？,,，, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,, ，，进行,,,,,,,, ,;,，反应条件为,,?,, ,,后，,,?,,,，,,?,,,进行,,个反应循环。,(,(,,,—,,,一,,,和一,,,,表达载体构建 分别化学合成,,,(,,,,,,,和一,,,,成熟体序列，,,,(,,,,,:,,,:,?一;,,舒,,,,;,,殍;,酉,,;,,,,;,;,,,,;;,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,?，,,,,,,:,?,,,;,,,;;,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,;;,,,,,,;,,一,?;,,,,,,,,,,:,,,:,??;,,戥,,,,,,磬;;,,,,,,;,,,,,,;;,,,,,,,,昏,,;;,,,,,一,?，,,,,,,:,?,,,;,,,,,,,,;;,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,;;,;,,,一,?，在,,?,,,，,进行复性后，取,,洲的,, ,,,,, ,,,与,,‖, ,线性化的,;,,,,(,(,,,,,,,,,—,,,质粒,“,在,,连接酶的作用下，室温连接, ,，转化,,,,,细胞，在,, ,‖,,,,,;,,,,,,;,,筛选转化菌落，扩大培养，抽提质粒，,,,测序鉴定。,(,(,,,, ,,,,,,,,荧光素酶活性检测 分别化学合成,,,,, ,?一非翻译区,,,—,,,(,,,和(,,,,可能作用的,,,片段，,,,—,,,,,,,:,,,:,?一;,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,;,,,,,,,;,;;;,,,,一,?，,,,,,,:,?,,,;,,,,,,,,;舒,,,,,,,;,,,,舒,,,;,,,;,;;,,,,,,,,,,;,,,,(,?，,,,,,,,,,,: ,,,:,?一;,,舒;,,,,;昏;,,;,,;,,,,,,,,,,;;;,,;,,;,批,,,,,,,;,,,,,,;,?,?，,,,,,,:,?,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,或,鲋,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,一,?。在,,?复性,,,，,，,,?,, ,,,,，,,连接酶的作用下，将,, ,,,,,插入线性化的,,瓜,,,,,,,,,;,,,，?,,,质粒,,,的,,, ，,,,,, ，?位点(,:,)，室温连接, ,，转化,(;,,, ,,, ,【细胞，,,,“舭氨苄青霉素筛选转化菌落，扩大培养，抽提质粒，,,,测序鉴亡,，，匕,,(,( ,,, ,,,, ,,,, 收集,×,,,细胞，用,,,离心洗涤,次后，用含,,,,(,,，,(,,,去氧胆酸钠，,,, ,,,和,×,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ;,;,,,,,的,口,,缓冲液,,, , ,冰上裂解, ,,，,,,,,叩,×,, ,,,离心取上清，加入等量上样缓冲液，进行,,,,,,(,,,,电泳 后 ,浙江大学硕士论文 材料与方法转移至硝酸纤维膜，,,脱脂牛奶封闭室温,, ,,,，洗膜,次，加入稀释的一抗室温, ,或,?过夜，洗膜,次，再加入,:,,,,稀释的辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体室温温育, ,，洗膜,次，用,,,曝光显色。,(,(重组慢病毒感染 接种, ,,,个大肠癌,,,,,细胞到,,(,,,,板，,,?，,,,,,培养过夜，次日换含,,舭,,,,,姗,的新鲜培养液，同时加入,,“,重组慢病毒液，,,?，,,;,,感染,, ,，换新鲜培养液，至细胞铺满,,,表面时，消化细胞并以,:,传代，次日，加入, ,咖,的嘌呤霉素进行药物压力筛选，持续筛选,—,,天。待细胞克隆长大后，用,,,,,, ,,,,进行验证。同时设立空载体对照。,(,(,,,检测 经重组慢病毒感染的大肠癌,,,,,细胞用,(,,,胰酶消化，,,,,印,×, ,,离心收集细胞，用含,,,,,的,,,缓冲液离心洗涤,次，用缓冲液冰上封闭,, ,,,，,,,,叩,×, ,,，,，用缓冲液以,×, ,,,, ,,肛,悬浮，加标记抗体,, , , ,,,(,,,,，,,?, ,，, ,,(,,,,,，,?避光孵育,, ,,,，离心，去,(,,,,，,,“, 上清用缓冲液洗,次，用,,,“，缓冲液悬浮细胞，用,,,,触,,分选仪分析。同时设空白和同型对照。,(,,(细胞迁移实验 消化收集普通大肠癌,,,,,细胞，,;,,,,,,细胞和,,,,, ,,,;,,,,,的,,,,,细胞，细胞计数，以,×,,,细胞接种,,衄培养皿，次日用,,,头划痕，冲洗,次，换新鲜培养液，,,?，,,,,,培养，观察划痕愈合状况。浙江大学硕上论文 结果,结果,(,(,,,,蛋白上调,,,,,,,一,,,和一,,,,表达 非编码的,,;,,,,,(,,,,,)在调节细胞生长.