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流体剪切力对血管内皮细胞中ampk及sirt1的调节机制研究

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流体剪切力对血管内皮细胞中ampk及sirt1的调节机制研究流体剪切力对血管内皮细胞中ampk及sirt1的调节机制研究 流体剪切力对血管内皮细胞中AMPK及SIRT1的调节机制研究 动脉粥样硬化是一个以脂质在内膜下聚集为特征的过程,具有生物活性的炎性因子及脂质诱导血管内皮细胞反应,吸引单核细胞并使其迁移至内膜下,单核细胞分化为巨噬细胞后摄取修饰后的脂蛋白,巨噬细胞的这种摄取作用可以导致合成多种因子刺激平滑肌细胞的迁移和增生,最终导致泡沫细胞和动脉粥样斑块的形成。病变逐渐进展到足以阻塞动脉腔,抑或者斑块破裂脱落阻塞血管,则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死造成严重的后...

流体剪切力对血管内皮细胞中ampk及sirt1的调节机制研究
流体剪切力对血管内皮细胞中ampk及sirt1的调节机制研究 流体剪切力对血管内皮细胞中AMPK及SIRT1的调节机制研究 动脉粥样硬化是一个以脂质在内膜下聚集为特征的过程,具有生物活性的炎性因子及脂质诱导血管内皮细胞反应,吸引单核细胞并使其迁移至内膜下,单核细胞分化为巨噬细胞后摄取修饰后的脂蛋白,巨噬细胞的这种摄取作用可以导致合成多种因子刺激平滑肌细胞的迁移和增生,最终导致泡沫细胞和动脉粥样斑块的形成。病变逐渐进展到足以阻塞动脉腔,抑或者斑块破裂脱落阻塞血管,则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死造成严重的后果。 血管内皮细胞,作为血管内壁直接与血液接触的单层细胞对维持血管壁内外的平衡起着十分重要的作用。血管内皮细胞在生理条件下发挥着调节组织与血液的物质交换,抗血栓,平衡抗血液凝固纤溶系统,维持血液的流动性;调节血管平滑肌功能,合成和分泌调节血管平滑肌舒张和收缩的相关因子;抑制血管壁细胞的游走和增殖等多种功能。血管内皮细胞通过感应来自于血液的机械性的以及化学性的信号刺激,维持着血管收缩以及舒张的动态平衡。内皮功能紊乱将直接导致正常血液屏障功能的障碍,以及内皮依赖的血管舒张功能障碍,直接促进动脉粥样硬化的发生发展,因此内皮功能紊乱被视为动脉粥样硬化发生的始动环节。 流体剪切力由血液流动产生的、对血管功能具有重要调节作用的、并且可以直接作用于血管内皮细胞参与内皮细胞功能的调节。不同的流体形式对内皮细胞的更能产生不同的影响,层流以及脉动流可以改善内皮细胞功能,具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化的作用,而湍流则具有促炎,增加氧自由基的产生以及促动脉粥样硬化发生的作用。也正是由于不同流体形式的不同行为特征,决定了动脉粥样硬化斑块在血管内不均一但非随机分布的特征。 流体剪切力调节内皮细胞功能主要通过NO而实现。NO作为一种气体信号分子,在调节血管舒张反应上具有十分重要的作用。NO生物学功能的正常发挥取决于NO的产生量以及NO的生物活性。NO的产生量主要由eNOS调控,关于eNOS的调控,目前研究表明,PS可以通过AMPK增加eNOS的磷酸化以及通过SIRT1降低eNOS乙酰化,从而激活eNOS。NO生物学功能的发挥在另一方面取决于NO生物活性的正常,在这个过程中,ROS的作用十分重要,ROS的升高是多种疾病的标志性指标,这其中包括各种心血管疾病,如高血压以及动脉粥样硬化等。升高的ROS与NO发生级联反应从而生成氧化作用更强的过氧化亚硝基产物,造成组织损伤以及减弱NO的生物学作用。AMPK以及SIRT1除了可以调节eNOS的活性而影响NO的产生外,AMPK以及SIRT1对于体内ROS产生也具有重要的调节作用,有报道,PS可以减少ROS的产生,而OS(氧化应激)则增加ROS的产生。由此可见,AMPK以及SIRT1在NO以及ROS的产生调节上具有十分重要的作用,但AMPK以及SIRT1如何受PS的调节,其潜在机制仍不清楚。本课题旨在深入研究流体剪切应力对AMPK以及SIRT1的调节机制,进而阐述其对内皮细胞功能的影响,希望能为内皮紊乱相关疾病的治疗和预防提供新的靶点。 我们首先用western blotting的方法检测发现,PS可以以时间依赖的方式增加磷酸化AMPK以及SIRT1的表达。我们深入探讨PS作用的潜在机制,发现用CaMKKb siRNA阻断其表达或者STO-609抑制CaMKK的酶活性后,PS诱导的磷酸化AMPK以及SIRT1的表达明显降低,提示我们,CaMKK是PS增加AMPK活性以及SIRT1表达必不可少的条件。本研究以及本实验室之前的研究结果均显示PS诱导SIRT1蛋白的表达不伴随SIRT1 mRNA的变化,提示PS对SIRT1的调节在于其转录后水平的调节,本实验用CHX处理细胞,阻断细胞内的蛋白合成,发现PS可以减慢SIRT1的降解速率,而CaMKK是PS维持SIRT1蛋白稳定性必不可少的重要条件。文献报道提示我们SIRT1 Ser27的磷酸化与其蛋白稳定性相关,而在本研究中发现,PS可以增加SIRT1的磷酸化,同时CaMKK在PS诱导的SIRT1磷酸化中发挥着必不可少的作用。CaMKK是已知的AMPK激酶,提示我们,CaMKK与SIRT1之间可能存在直接的磷酸化作用,我们使用激酶分析试验进行验证,结果提示CaMKK不仅为AMPK激酶,同时可以直 接磷酸化SIRT1,因此也是SIRT1激酶。由于AMPK以及SIRT1对于eNOS以及PGC1a的调节以及在NO及ROS功能上的重要作用,我们进一步探讨CaMKK对于eNOS以及PGC1a的调节作用,IP实验显示CaMKK的缺失将导致AMPK以及SIRT1对eNOS以及PGC1的激活障碍,导致炎症以及氧化应激的发生。离体实验中,我们进行了血管舒张功能实验,结果提示CaMKK、AMPK、以及SIRT1的缺失都将导致血管舒张功能的下降,从而进一步验证CaMKK、AMPK、以及SIRT1对于eNOS的调节作用。在体实验显示CaMKK的缺失导致血管壁炎性因子以及动脉粥样硬化相关因子的表达增高。CaMKK的缺失导致动脉粥样硬化的加剧。 综上所述,我们的研究表明,PS在内皮细胞调节AMPK以及SIRT1的表达和活性主要通过CaMKK对于AMPK和SIRT1的磷酸化而实现,磷酸化AMPK直接激活其激酶活性,而磷酸化SIRT1则增加其蛋白稳定性,从而增强其功能。在内皮细胞,CaMKK是PS刺激下AMPK以及SIRT1对 eNOS和PGC1a的协同调节作用必不可少的条件,CaMKK的缺失导致eNOS和PGC1a的功能失调,表现为抗炎症以及抗氧化应激相关基因表达下调,血管舒张功能障碍,血管壁炎症以及动脉粥样硬化相关基因表达增强,加剧动脉粥样硬化的程度。
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