侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究

侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究 侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研 究 克隆研究术 —!!旦皇一妻堕E一陆师义艾福彪杨秀琴 (河北大学生物技术中心.保定071002) 摘要pDLI是能够转化细菌和真苗的双功能质粒.将pDLI与糙皮侧耳(Pleurotus0sz瑚. )的DNA片段连接.然后转化玉米黑粉菌(Ustitagomaydis)~原生质体.通过新霉索选择平皿的 筛选,转化率达到800转化子/ggDNA,建立了糙皮侧耳的基因文库随机取l5个转化子进行点溃 法(Dottingblottin曲检验.结果均呈阳性.此结果表明,扰性克隆不是搞l于玉米黑糟菌敏感细胞的 回复突变.萨慎法(Southernblotting)检验显示本研究在玉米黑粉菌细胞中克隆糙皮侧耳纤维二 糖水解酶基因是成功的.基园表达试验表明,玉米悬粉菌克隆株具有糙皮储耳纤维二糖水解酶的活 性. 关键词丝室型墨:兰查墨塑堕;{垡三婪盔蟹芭差里皴. 应用基因工程技术研究食用菌纤维素酶系的基因克隆与表达,首先要建立一套有效的基 因转化系统.玉米黑粉菌和糙皮侧耳都是担子菌.但前者营寄生而缺少纤维素酶系.因此可作 为糙皮佣!J耳纤维素酶基因克隆的受体菌株I-4J在实验室条件下,玉米黑粉菌能在基本培养基 上生长.并分为单倍体和双倍体两个生长期.单倍体的次生孢子在培养基上似酵母状生长.易 于操作.因此.长期以来人们把它作为遗传学研究的一种理想材料s-r]. 在国内外同类研究中,本研究首次成功地在玉米黑粉菌中建立了糙皮侧耳的基闽文库,并 克隆和表达了糙皮侧耳的纤维二糖水解酶基因. 1材料与方法 1.1菌种及主要试剂 基因供体菌:糙皮侧耳,P33;基因受体菌:玉米黑粉菌.从玉米病株上分离.对新霉索敏感; 质粒菌体(E.coliHB101):含双功能质粒pDL1.可在细菌和真菌之间穿梭运载DNA.上述菌 种均由中科院微生物所提供 Holliday完全培养基:用于玉米黑粉菌液体培养和原生质球再生培养. 限制性核酸酶:BeohringerMannheim公司产品;真菌溶壁酶:广东微生物研究所生产I 聚乙二醇-4000:Sigma公司产品;青霉素及新霉素:中国卫生部药物检定研究所 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品;电泳, 层析所用试剂分别购自美国Promega公司Sigma公司;试剂盒:Prime-a.GeneLabelingSy? 收稿日期:l997一O7一o7初稿;l997一O8—22修改稿. 本研究获得瑞典自然科学基金及河北省自然科学基金的资助.特此致谢 达一 表一 与L stem购自美I~lPromega公司;同位素:一PdATP,.cPdCTP均为Sigma公司产品. 探针:李氏木霉(Trichodermareesei,CBHI:5端EcoRI.Hindlll片段34bp.3端 I~ApDL1质粒为载体玉米黑粉菌为受体,克隆糙皮侧耳纤维二糖水解酶CBHI1基因的技 pDi 蔗 vec 体 tor 酶切 膏耳o? _ P- _ as _ g _ ~tusDNALJ一一……一… 酶切…一__-一一一一 ?B’耳lJA #-- 脱礴赴理E”计m.di_ti0”‘ Carryingplammid I 克隆菌株 朗,10n ‘ in — gs … train ………_一 点溃法 Dottingblotting l一…………一萨慎法S outhernblotting I,………,一产醇蜻选 目的l茁株Scxeenlngforenzyme 图1技术路线 Fig.1Technicalroute 2结果与讨论 2.1pDLl质粒载体的性质 pDL1是pUC]2的衍生质粒,含玉米黑粉菌热休克基因(1lsg70)的启动子和终止子.此外, 还有两个选择标记,在细菌中表达抗青霉索基因(amo),在玉米黑粉菌中表达新霉素磷酸转移 酶~(neur)因此.该质粒载体具有在细菌与担子菌之间穿梭表达的特性.本研究成功地将该 质粒用于糙皮侧耳纤维二糖水解酶CBHII~因的克隆.解决了食用菌基因工程研究中难以找 到合适载体的技术难 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .一 2.2转化子数量与特定基因的克隆 在段有新霉素的非选择性再生培养基上,原生质体的再生率为60,舳;而经水低渗处 理的原生质体再生率小于0.O1在含有新霉索的再生培养基上筛选转化子.转化率为 8o0,1000个转化子/gDNA.由此成功地在担子菌中构建了糙皮侧耳的基因文库文库容量 达3×lO?个转化子侧耳的基因组DNA长度约为1×10bp;本研究用内切酶消化后的侧耳 DNA长度平均为1.6×10’bp. 杨国良等:侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究3 左3个对照显示杂交阴性.1~ft:3checkswithnegativereaction. 右.15个转化子显示杂交阳性right:蛸transformantswithpositivereaction 围2玉米嚣粉菌转化子的斑点杂交 Fig.2DotspothybridizationofU.maydistransformants A—1.标准舟子量对恶;i噬茸体DNA经Hindm酶解. StandardmolecA~Hind]II醇解; Standardmolecularweightcontrast:EnzymoB.培ofphageDNAthroughHiudI? B一2.转化子PU_42的DNA经Hind?酶解: Enzymolysisof~rensfotruantPU一42DNAthroughHind?; B--3.Southern转移井与”P标记的李氏木霉CBHII基西搛针杂交. SoutherntransferandcrosswithPCBH?geneprobe0fichoder,,Ireesei. 圄8Southern转移夏转化子放射性自显影 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 结果 Fig.3Southerntransferandradiationautodevelopmentanalysisoftransformanta 4食用苗学报5卷 将以上数据代)~Clarke(1976)统计 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 对所建文库进行 数学 数学高考答题卡模板高考数学答题卡模板三年级数学混合运算测试卷数学作业设计案例新人教版八年级上数学教学计划 分析: N=ln(1--p)/ln(1一x/y) =ln(1-0.99)/ln1—1.6X10’/1X10 =ln0.Ol/lnO.99984 =一4.60517/--1.60o128X1O =2.878X10’ N——99克隆任一基因所要求的重组体数; p——从文库中可能筛选到任一基因的概率; h——自然对数: x——文库中每一克隆所台外骡DNA的平均长度: y——被克隆生物的基因组大小. 根据以上计算得知,以99的概率筛选到糙皮翻耳的任何基因,理论上要求的转化子数为 2.878X10个.本研究所获的文库容量已达3×10’个转化子,说明此基因文库符合统计学要求. 2.3转化子的鉴定 斑点杂交结果显示(图2),被杨国良等:侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究5 Southern杂交结果(图3)显示,两株转化子的杂交带各异(图中A-3与B3不同),说明pDL1 质粒及其所载外源DNA整合人玉米黑粉菌染色体的位置不同.即重组投有同源性.否则.转 化 子均应显示相同的杂交带. 2.4克隆基因的表达 经过初筛和复筛,获得2株产酶性状稳定的菌株P1J-53和PU-42,它们可在CMC酶诱导条 件下分泌纤维二糖水解酶.振荡培养40,60h后,PU-53的酶活水平迭45~g/ml;PU一42达 35g/ml;而玉米黑粉菌对照则基本不具酶括性(图4).此结果说明,糙皮侧耳的纤维二糖酶基 因在受体玉米黑粉菌中得到了克隆并表达. 参考文献 1BanksGR.TransformationofVsti~3gomaydisbyaplasmidcontainingyeast2-misronDNA. Currentgenetics,1983.7:7377. 2BanksG.R.ChromosomalDNAsequencesfromUetil~gomaydi~promoteautonomous replicationofplasmidsin8accharomyesscerevisiae.Currentgenetics.1983.7:79~84. 3KmiecE.B.Homologouspa~ingofDNAmoleculesbyUst/~goRecIproteinispromotedby sequencesofZ—DNA.Ceu.1986.44:545,554. 4SambrookJ.Molecularcloningalaberatorymanua1.ColdSpringHarberPress,U.S.A.,1989. 273,285. 5TuskudaT.Isolationandcharacterizationofanautonomouslyreplicatingsequencefrom Ustilagomayd妇.MolCelIBiol,1988.8(9):3703--3709. 8TurgeonB.G.Developmentofa~ungaltransformationsystembasedonselectionofsequences activity.Mo1.CellBio1.1987.7(9):3297,3305. 7邓大纶.田波,陆师义等.玉米黑糟菌DNA载体的构建和它的原生质球的转化和再生.真菌 学 报,1993.12(2):145--151. StudiesonCloningandExpressionof Cellobi0sehydrolaseGeneofP.ostreatus YangGuoliangLiLinaLuShiyiAiFubiaoYangXiuqing (TheRe~zarchCentreBiotechnology,HebeiUniversityBaoding071002) AbstractpDL1is8kind0fbifunctionalplamnidwhichcantransformbacterlaandfun. AndpDL1transformedtheprotoplastsofUstilagomaydisafterbeingligatedwithDNAfragments ofPleurotesostreatt~s.Throughtheseraeningofneomycinselectiveplates,thetressformation ratioreached800tranaformantspermicrogramofDNA,andthegenelibraryofPleurotusOSfre~fO.8 Wasestablished.15randomlyselectedtrarmformantsexpressedpositivebydottingblottingteBt. Theresultshowedthattheresistantcloneswerenotoriginatedfrombackmutationofsensitive cellofUstilagomaydis.AndSouthernblottingtestrevealedthatstudiesweresuccessfulfor cloningthecelloblosehydrolasegoneofPleurotesosgreat~inthecellofUstilagomaydis.WhiIe thegeneexpressiontestshowedthattheclonedstrainsofUsfi~agomaydisexpressedtheenzyme activityofcellobiosebydrol~eofPleurotu$ostreotN$. KeywordsPleurotu8ostrea$~;Ustik~gomayd~;Cellobiosehydrolase;Genecloning