DNA甲基化在法医学中的应用前景及其检测方法新进展

DNA甲基化在法医学中的应用前景及其检测方法新进展 DNA甲基化在法医学中的应用前景及其检 测方法新进展 ? 290? DNA甲 JournalofForensicMedicine,August2009,Vo1.25,No.4 基化在法医学中的应用前景及其检测方法新进展 赵书民,李成涛 (司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063) 摘要:DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记.新近的一些研究表明,DNA甲基化在二联体亲权鉴定, 同卵双生子法医学个体甄别等案例中可能具有一定的应用前景,可作为STR或SNP等经典遗传标记的有 益补充目前基于甲基化敏感的限制性核酸内切酶,重亚硫酸盐转化以及甲基化CpG结合蛋白等原理已建 立了一系列的DNA甲基化检测方法.甲基化敏感的单核苷酸引物延伸,实时荧光PCR,甲基化特异性 PCR,甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增,光纤微珠芯片等位点特异性DNA甲基化检测方法都 可用于已知CpG位点甲基化状态的检测并可能在法医学实验室具有一定的应用前景;AIMS,HELP, COMPARE—MS等通过对基因组范围内的DNA甲基化扫描 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ,可发现具有潜在法医学应用价值的DNA 甲基化位点. 关键词:法医遗传学;DNA甲基化;综述『文献类型1 中图分类号:DF795.2文献标志码:Adoi:10.3969~.issn.1004—5619.2009.04.016 文章编号:l004—5619(2009)04—0290—06 PerspectiveofDNAMethylationinForensicGeneticsandNewProgressofIts DetectionMethods ZHA0Shu—rain,LICheng-tao (ShanghaiKeyLaboratoryofForerl~icMedicine,InstituteofForensicScience,MinistryofJustice,P.R. Chino,Shanghai200063,China) Abstract:Asanimportantepigeneticmarker,DNAmethylationhasexhibitedavaluableperspectivein thefieldsofforensicgenetics,especiallyincasesofpaternityidentificationinduosanddiscriminationof monozygotictwins,whichmaybeausefulcomplementtotheclassicgeneticsmarkers,suchasshorttan- demrepeats,singlenucleotidepolymorphism.VariousmethodsforDNAmethylationdetectionhavebeen developedandvalidatedbasedonmethylationsensitiverestrictionendonuclease,bisulfitemodificationor methylation—CpGbindingdomainprotein.Methylation— sensitivesinglenucleotideprimerextension,real— timePCR,methylation—specificPCR,methylation-specificmultiplexligation— dependentprobeamplification andtheIlluminaSHumanMethylation27havebeenallapplicableforanalyzingidentifiedCpGlocior shortsequences,andcanbeeffectivelyusedinforensiclaboratory.However,AmplificationofInter— MethylatedSites(AIMS),Hpa1ItinyfragmentEnrichmentbyLigation— mediatedPCR(HELP)orCombina— tionofMethylated—DNAPrecipitationandMethylation— SensitiVeRestrictionEnzymes(COMPARE—MS)are usefulingenomewidemethylationscanningtofindnewCpGlociwhichmaybevaluableinforensic fields. Keywords:forensicgenetics;DNAmethylation;review[publicationtype] 短串联重复序列(shorttandemrepeats,STR),单 核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP) 等经典遗传学标记是进行个体识别和亲权鉴定的重 要工具,但其在同卵双生子的法医学个体甄别,二联 基金项目:中央级科研院所社会公益研究资助项目(GY0604) 作者简介:赵书民(1973一),男,河南开封人.博士,主要从事 遗传学研究E—mail:zhaoshuminxl@hotmail.corn. 体亲权鉴定等案例中往往又有一定的局限性.解决上 述问题的一种途径是寻找新的遗传多态性标记.DNA 甲基化是表观遗传学领域最为关注的一种表观遗传 标记,这种新的遗传标记为解决上述法医学问题提供 了一种新的思路,或者说是对STR,SNP等经典遗传 标记的有效补充.本文就DNA甲基化这一表观遗传 标记在法医学中的应用前景及其检测方法新进展作 一 简要综述. 法医学杂志2009年8月第25卷第4期 1DNA甲基化在法医学中的应用前景 表观遗传学一般是研究在没有DNA序列改变情 况下发生的,可遗传的基因功能变化,其机制包括基 因组DNA的甲基化,组蛋白的甲基化和乙酰化等… 上述这些表观遗传修饰与人印记基因形成,胚胎发育 及肿瘤的发生等关系密切.已有研究发现,采用印记 基因上的甲基化差异区域可为二联体亲权鉴定中确 定亲本来源的等位基因提供有力证据,通过对 SNRPN,H19等印记基因中SNP或可变数目串联重 复序列(variablenumbertandemrepeats.VNTR)亲本 印记等位基因(parentallyimprintedalJe1e.PIA)在二 联体亲权鉴定及一些特殊案例中的探索性应用.显示 了DNA甲基化在这些案例中的实用价值[2-3].同卯双 生子的个体甄别是法医学面临的另一难题,新近的一 些研究已发现,DNA甲基化的差异可能是造成遗传 物质一致的同卵双生子出现表型差异的重要原因之 一 .在同卵双生子问,个别DNA甲基化位点间甲基 化程度的差异甚至超过无关个体的差异.这为开展同 卯双生子法医学个体甄别提供了新的思路.另外. Poon等[61报道,采用DNA甲基化标记可有效识别孕 妇外周血中的胎儿DNA,这也为产前的亲权鉴定提 供了一种非侵人性的检测方法.上述研究成果充分显 示了DNA甲基化这一表观遗传学标记在法医学领域 中的应用前景. 在人类基因组DNA中,DNA甲基化仅发生于 CpG二核苷酸中胞嘧啶5位碳原子上,形成5甲基 胞嘧啶(5一methylcytosine,5mC,mC).据估计,人类基 因组约有2.7X10个CpG位点.CpG在基因启动子区 等一些特定区域常存在富集现象,称为CpG岛.最 近,通过对人类6,20和22号染色体进行甲基化测 序证实,CpG岛中的胞嘧啶可存在甲基化和未甲基 化两种状态,而基因调控区外(包括编码DNA,内含 子,重复序列以及基因问DNA)的CpG通常处于甲 基化状态[71.SNP与临近的CpG,依据后者甲基化状态 可丰富SNP的多态性,即SNP等位基因特异性甲基 ? 291? 化.依据这样的SNP位点进行个体识别则有望减少 所需要的SNP位点数.最近已有学者依据甲基化敏 感性SNP(methylation—sensitiveSNP,MSNP)分析方 法发现了一些这样的SNP位点[8J.5mC中甲基与嘧啶 环之间为共价连接,对体外环境以及常规的甲醛固 定,石蜡包埋及HE染色等组织处理过程均有较强的 耐受性.因此,由甲基化状态所决定的类似SNP的 "二等位基因"(甲基化和未甲基化)就成为一种理想 的法医学多态性标记.2003年人类表观基因组协会 (HumanEpigenomeConsortium,HEC)宣布开始实施 人类表观基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (HumanEpigeneticsProject. HEP),其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化位 点图谱.相信随着这一计划的顺利实施,不但将对遗 传学和临床医学等产生深远影响,也必将为法医学带 来更多机遇 2DNA甲基化检测方法的基本原理 DNA甲基化检测方法的基本原理主要有三种. 第一种是甲基化敏感性限制性核酸内切酶(methyla. tionsensitiverestrictionendonuclease.MSRE)分析方 法.此类方法主要是利用部分MRSE对所识别DNA 序列甲基化的敏感性不同l9-l0】.如a?及其同切酶 Mspl均可识别序列CCGG,但经DNA甲基化形成 C"CGG时,HpalI将不能切割,而MspI仍可切割.利 用MSRE的这一特性,对基因组DNA进行酶切后. 再采用下述一些方法对酶切后基因组DNA进行检 测,即可明确所检测位点的甲基化状态.这一类方法 有着共同的优点,即限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)酶切对模板DNA的影响较小.因 而可用于石蜡包埋组织等类型检材DNA甲基化状 态的检测.但这类方法亦有其缺点.即检测结果会受 到酶切是否完全的影响.并且也只能分析RE识别序 列中的CpG位点.表l列出了部分在真核细胞中不 能切割甲基化DNA序列的RE(源于限制性内切酶数 据库一REBASE). 表l部分不能切割甲基化后DNA序列的限制性核酸内切酶 RE识别序列RE识别序列RE识别序列RE识别序列 AmIIGACGTCBstl107IGTATACG//paIICCGG尸aCICACG1G ACCIICGCGCfr10IRCCGGYHhaIGCGCPsp1406IAACGTT Aor51HIAGCGCTClaIATCGATHnlIGRCGYCPv"ICGATCG AyaICYCGRGCpoICGGWCCGMluIACGCGTSacIICCGCGG AIITGCGCAEco52ICGGCCGNaeIGCCGGCSIGTCCAC B6eIGGCGCCEcoRIGAATrCGNotIGCGGCCGCSmaICCCGGG 日IGCCNGGCFseIGGCCGGCCNruITCGCGASnaBITACGTA BssHIIGCGCGCHneIIRGCGCY 注:粗体表示甲基化的CpG位点 ? 292? 第二种是通过对基因组DNA中的胞嘧啶进行化 学修饰,以区分未甲基化的胞嘧啶和5mC,最常用的 是重亚硫酸盐转化.在DNA单链中.未甲基化的胞嘧 啶在高浓度的重亚硫酸盐作用下经一系列化学反应 后可转化成尿嘧啶(U),而5mC则保持不变.在随后 的PCR过程中,尿嘧啶(U)被转换为胸腺嘧啶(T).如 此就将胞嘧啶的甲基化修饰这种化学修饰信息转化 为序列差异信息.目前,经改良的重亚硫酸盐转化后 末端终止测序分析技术已成为DNA甲基化分析的金 标准…J,焦磷酸盐测序方法同样可用于重亚硫酸盐转 化后DNA序列的测序分析. 第i种是采用甲基CpG结合蛋白质(methyl— CpG—bindingprotein,MeCP),该蛋白家族包括MeCP1 和MeCP2等.以MeCP为填充物开发的MBD柱层析 法常用于基因组范围内的甲基化位点扫描[12-13]. 目前文献报道的各种DNA甲基化分析方法均依 赖于这三种基本原理.最近已有学者在研究更为温和 的5mC化学修饰方法【l4l或5mC光交联试剂[151,如采 用锇酸盐的化学修饰方法l,这可能会成为重亚硫酸 盐法的一种理想替代 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 . 3DNA甲基化检测方法 根据检测目的不同,DNA甲基化检测方法分为 两类:一类是位点特异性的.即针对某个特定CpG位 点检测其甲基化状态:第二类是基因组范围内的 DNA甲基化扫描方法,用于了解基因组范围内的 DNA甲基化状态或发现新的DNA甲基化位点.已有 学者对DNA甲基化检测方法做了比较全面的总结与 介绍.在此,简要介绍一些具有一定法医学应用前 景的DNA甲基化检测方法. 3.1位点特异性的DNA甲基化检测方法 3.1.1甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(methyla. tion—sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS- SNuPE) 单碱基延伸技术在SNP的检测中已得到了广泛 应用.Gonzalgo等于1997年首次将此技术应用于 特定CpG位点甲基化状态的定量检测.该方法的基 本原理是基于重亚硫酸盐对未甲基化的胞嘧啶的化 学修饰.模板DNA经重亚硫酸盐转化后,在特定的 CpG位点将人为形成一个新的"SNP",即[mC/U].针对 该位点 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 PCR引物和一条3端紧邻该位点的单碱 基延伸引物.常规PCR反应结束后.去除PCR引物 及过量的dNTP,加入单碱基延伸引物及放射性同位 素或荧光标记的ddCTP/ddTTP或ddGTP/ddATP.最 终两种碱基放射性同位素或荧光强度的比值即指示 JournalofForensicMedicine,August2009,Vo1.25,No.4 了该位点的甲基化程度.由于该技术在SNP的检测中 已成功开发出了类似SNPStream这样的高通量自动 化检测平台,因而该技术有望在法医学检测中得到广 泛应用另有一些学者采用反相高效液相色谱技术 或基质辅助激光解离质谱分析技术1对MS—SNuPE 产物进行检测,可实现特定CpG位点甲基化程度的 精确定量.由于该方法所需模板DNA量较少,有可能 应用于类似石蜡包埋组织等存在降解可能的基因组 DNA的检测.该方法的不利之处在于,由于经重亚硫 酸盐转化后,PCR引物及单碱基延伸引物的设计相对 复杂,尤其是在对多个位点同时进行检测时. 3.1.2实时荧光PCR(real—timefluorescencePCR)方法 Eads等[2o1于2000年将此方法首先用于特定CpG 位点甲基化状态的检测,称之为MethyLight.如前所 述,经重亚硫酸盐转化后.特定CpG位点依据是否甲 基化形成一个人为的lot/u]多态性位点.针对该位点 分别设计与甲基化和未甲基化重亚硫酸盐转化后序 列结合的两条探针.在常规PCR反应中,Taq酶利用 其5到3的外切酶活性.可将相应的DNA探针降 解,释放荧光集团,产生荧光信号,依据两种荧光探针 的Ct值即可换算出该位点的甲基化程度.事实上,该 方法已经诸多学者的不断改良.实际应用中,为了保 证实时荧光PCR的特异性.在引物的3端和探针结 合区域内可能会包含多个的CpG位点,这实际上是 实时荧光PCR与甲基化特异性PCR两种方法的结 合.Campan等l21]在2009年对MethyLight方法进行了 全面的评价,进一步明确了其探针,引物以及实验方 案的设计原则,并提出了3个有效的质控系统(Qc): QC一1是一个非甲基化依赖的反应系统用以监控样品 DNA的质量和完整性;Qc一2是一个非重亚硫酸盐依 赖性的反应系统,用以监控重亚硫酸盐转化反应的回 复效率;Qc一3采用非重亚硫酸盐转化依赖性的引物 和重亚硫酸盐转化依赖性的探针以监控重亚硫酸盐 的转化效率.整套系统保证了MethyLight方法对CpG 甲基化检测的灵敏,准确和高效,可以在非甲基化等 位基因超出10000倍的情况下精确地检测到甲基化 的等位基因并定量.另外该方法所需模板量少.可用 于石蜡包埋,激光显微切割等检材的检测 3.1.3甲基化特异性PCR(methylation—specificPCR. MSP) 这也是一种基于重亚硫酸盐转化的检测方法,类 似于SNP检测方法中的等位基因特异性PCR.由 Herman等?于1996年创立.与MethyLight方法不同 的是,前者对[mC/U1的检测采用的是特异性探针,而在 MSP中,设计的是针对[-c/u]的特异性引物.每一样品 法医学杂志2009年8月第25卷第4期 进行两个PCR反应,一套引物对应于甲基化DNA经 重亚硫酸盐转化后的序列,另一套引物对应于未甲 基化DNA经重亚硫酸盐转化后的序列.PCR产物经 常规琼脂糖凝胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可 对结果进行判断.也可采用公用探针以提供检测信 号.事实上,为了保证MSP的特异性.MSP的引物设 计要保证在引物结合区域至少包含两个潜在的CpG 位点,且其中一个要位于或接近引物的3端.Wang 等借助于基因表达系列分析技术(serialanalysisof geneexpression,SAGE)的高通量,联合MSP创建了 一 种DNA甲基化的定量分析方法(MSP—SAGE).该 方法在5%,100%甲基化范围内具有良好的线性关 系.Kristensen等对基于MSP的DNA甲基化定量检 测方法进行了改良,将MSP与高分辨溶解曲线分析 联合应用,避免了定量检测过程中对荧光探针的使 用,简化了MSP反应体系设计.该方法被称之为 SMART—MSP.该方法与MethyLight的检测结果具有 很好的一致性.可在0.1%,100%范围内对DNA甲基 化程度进行精确定量,并具有较高通量. 3.1.4甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增 (methylation-specificmuhiplexligation-dependent probeamplification,MS—MLPA) 这是一种基于MSRE的分析方法,由Nygren等 于2005年在MLPA的基础上改良而成.该方法要求 所检测的CpG位点位于某一特定的MSRE识别序列 内,如HhaI所识别的GCGC.针对该位点设计两条 探针.上游探针的3端位于该位点5端1个碱基处, 下游探针5端位于该位点3端1个碱基处.上游探 针的5端和下游探针的3端含有一套公用PCR引物 序列针对不同位点的探针长度可有不同.将探针与 模板DNA杂交后,加入连接酶进行连接反应,并加入 相应的MSRE如HhaI.若该位点甲基化,HhaI不 能切割,则模板保持完整,随后的PCR反应可以进 行,若未甲基化,HhaI将连接反应形成的模板DNA 切割.随后的PCR反应不能进行.该方法已成功地应 用于男性脆性X染色体综合征的诊断.对于法医学 检测而言,该方法最大的好处在于其与目前法医遗传 学实验室广泛应用的遗传分析仪具有较好的兼容性. 该方法由于不能进行定量检测,因此适合于对印记基 因中的特定CpG位点进行检测.该方法的不利之处 在于检测的位点受到MSRE限制,并牵涉到多个酶学 反应. 3.1.5基因芯片 DNA芯片在法医学检测中已有成功应用[261,因而 DNA甲基化检测芯片同样具有一定的法医学应用前 ? 293? 景.这包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化 杂交和用于检测已知特定CpG位点的甲基化特异性 微阵列.最近美国Illumina公司所开发的用于全基因 组DNA甲基化扫描的光纤微珠芯片(Infinium@Hu— manMethylation27)[27]即属于后者,类.此芯片的基 本原理是通过重亚硫酸盐对模板DNA进行转化后. 通过单碱基延伸对特定CpG位点进行甲基化状态检 测.该芯片可同时对人基因组DNA14495个基因上 已知的27578个CpG位点的甲基化状态进行扫描, 并已应用于多项表观遗传学研究,获得了可靠的研究 成果.另外,Illumina公司还可依据GoldenGate~策 略对多达1536个CpG位点进行微珠芯片定制.通过 此工具有望筛选出可用于法医学鉴定的DNA甲基化 位点. 除上述方法外,位点特异性的DNA甲基化分析 还有很多方法,例如甲基化敏感性限制性核酸内切 酶一PCR(methylation—sensitiverestrictionendonuele. ase—PCR.MSRE—PCR),重亚硫酸盐联合限制性核酸 内切酶分析(combinedbisulfiterestrictionanalysis, COBRA),甲基化敏感性解链曲线分析(methylation, specificmeltingcurveanalysis.MS—MCA),甲基化敏 感性单链构象分析(methylation—specificsingle—strand conformationanalysis,MS—SSCA)等,这些方法在一些 甲基化方法综述中已有较为详细的描述rI6J.但这些方 法由于灵敏度有限以及自动化程度不高等原因.笔者 认为其可能不适合在法医遗传学实验室常规开展. 3.2基因组范围内的DNA甲基化状态扫描方法 5mC占基因组胞嘧啶数的百分比可作为一个粗 略评定基因组甲基化状态的指标.将样品DNA通过 酶解或氢氟酸盐等水解为单碱基后,经高效液相色谱 (highperformanceliquidchromatography,HPLC)或 高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelec— trophoresis.HPCE)等方法分离,对胞嘧啶和5mC进 行曲线下面积积分,通过f5mC/(5mC+C)】即可获得 5mC%.但这一指标的法医学应用价值有限.对全基 因组DNA甲基化状态的检测方法多是基于MSRE 或MeCP. 基于MSRE的方法包括限制性标记基因组扫描 (restrictionlandmarkgenomicscanning,RLGS),甲 基化敏感性限制性指纹图谱技术(methylation—sensi. tiverestrictionfingerprintingtechnique,MSRF),内 部甲基化位点扩增技术(amplificationofinter—methy— latedsites,AIMS)等多种.RLGS是采用稀有切点的 MSRENotI酶切后进行二维电泳,可对约50%的基 因组CpG岛进行扫描;MSRF是采用MseI,BstUI ? 294? 等对基因组酶切后采用10碱基的随机PCR引物进 行扩增.这两种方法往往伴随着大量的后续鉴定工 作.操作复杂.AIMS采用的是可识别同一序列但甲基 化敏感性不同的RE(如前文提到的Hpa1I—MspI) 对基因组进行酶切后,加入接头(adaptor)序列进行连 接反应.接头序列包含通用引物序列可进行PCR扩 增.AIMS扩增条带复杂程度较前两种方法显着降低, 可直接进行克隆测序.Khulan等r引基于4pa?一MspI 限制性核酸内切酶对的特性对AIMS进行了改良,称 之为HELP(Hp?IItinyfragmentenrichmentbylig. ation—mediatedPCR).该方法是将/palI和MspI酶 切后接头引物的扩增产物分别采用不同荧光进行标 记,随后进行:片杂交检测.基于/palI的CpG甲基 化检测芯片已成功应用于同卵双生子基因组甲基化 差异的扫描研究l5I.此类方法的显着缺陷是受限于 MSRE识别序列.如采用n1I仅能分析基因组内约 8%的CpG岛.限制性核酸内切酶McrBC的应用是 一 个革命性的进步.McrBC区别于常用RE的一个显 着特征是其所识别的序列(RmI=(N)..嵋R)具有高度 的可变性,该酶约可识别基因组内半数的甲基化 DNA和几乎全部的CpG岛.Lippman等于2004年 首次将McrBC应用于模式生物一拟兰芥基因组 DNA的甲基化扫描.随后,Ordway等[01将其应用于哺 乳动物基因组DNA甲基化扫描.并开发了相应的检 测芯片. 基于MeCP特性的MBD柱层析法在全基因组甲 基化状态扫描也有广泛的应用『12,31.将MBD柱层析 法与MSRE联用建立的C0MPARE—MS(combination ofmethylated-DNAprecipitationandmethylation—— sensitiverestrictionenzymes)方法[,结合了MBD柱 层析法与MSRE的共同优点,避免了单纯柱层析法的 非特异性捕获和因MSRE酶切不完全所导致的假阳 性问题.Luo等【3l1于2009年报道了一种基于MBD的 DNA甲基化检测芯片技术.该方法首先将基因组 DNA进行重亚硫酸盐转化,随后采用PCR对转化后 的基因组DNA目标区域进行扩增,并将PCR产物的 一 条DNA链固定在芯片上,与甲基化序列和未甲基 化序列对应的探针进行杂交,随后采用SssI甲基化 酶对杂交形成的双链DNA进行甲基化修饰,则探针 序列上的胞嘧啶亦形成5mC.随后用经荧光标记的基 因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 MeCP(HMBD)进行结合.荧光强度即指示了 目标DNA区域内的甲基化CpG位点密度 上述这些方法往往是应用于肿瘤,胚胎发育等表 观遗传学研究,但采用类似方法同样有利于发现具有 潜在法医学应用价值的DNA甲基化位点 JournalofForensicMedicine,August2009,Vo1.25,No.4 4展望 DNA甲基化这一表观遗传学标记已在法医遗传 学领域显示出一定的应用前景.是对STR,SNP等经 典遗传标记的有效补充,特定情形下(如对同卵双生 子法医学甄别)甚至可能是唯一有效的多态性标记. 目前对DNA甲基化检测方法的不断研发凸显出这一 多态性标记的检测难度(现有方法可能均存在一定的 缺陷或限制).在现阶段,除对已发现的印记基因甲基 化位点以及存在等位基因特异性甲基化的个别SNP 位点进行法医学应用价值探讨外,采用全基因组 DNA甲基化扫描的方法寻找更多,具有法医学应用 前景的DNA甲基化位点也是法医遗传学研究者面临 的重要任务. 参考文献: [1]薛京伦.表观遗传学一原理,技术与实践[M].上海:上 海科技出版社.2007. [2]SumiH,NaitoE,DewaK,et.Applicabilityof theparentallyimprintedallele(PIA)typingofaVN— TRupstreamtheH19genetoforensicsamplesofdif- ferenttissues[J].LegMed(Tokyo),2005,7(3):179— 182. [3】ZhaoG,YangQ,HuangD,eta1.Studyontheap— plicationofparent—of-originspecificDNAmethylation markerstoforensicgenetics[J[.ForensicSciInt,2005, 154(2—3):122—127. [414FragaMF,BallestarE,PazMF,et.Epigeneticdif- ferencesariseduringthelifetimeofmonozygotictwins[J[. ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(30):10604—10609. 【5】KaminskyZA,TangT,WangSC,eto1.DNAmethyla— tionprofilesinmonozygoticanddizygotictwins[J[.Nat Genet,2009,41(2):240—245. [6]PoonLL,LeungTN,LJauTK,eta1.DifferentialDNA methylationbetweenfetusandmotherasastrategyfor detectingfetalDNAinmaternalplasma[J[.ClinChem, 2002,48(1):35—41. [7】EckhardtF,LewinJ,CorteseR,eta1.DNAmethy— lationprofilingofhumanchromosomes6,20and22[J]. NatGenet,2006,38(12):1378—1385. [8]KerkelK,SpadolaA,YuanE,eta1.Genomicsur. veysbymethylation—sensitiveSNPanalysisidentify sequence—dependentallele—specificDNAmethylation[J]. NatGenet,2008,40(7):904—908. [9]KhulanB,ThompsonRF,YeK,eta1.Comparative isoschizomerprofilingofcytosinemethylation:theHELP assay[J[.GenomeRes,2006,16(8):1046—1055. [10】OrdwayJM,BedellJA,CitekRW,eta1.Comprehen— 法医学杂志2009年8月第25卷第4期 siveDNAmethylationprofilinginahumancancer genomeidentifiesnovelepigenetictargets[J].Carcino genesis,2006,27(12):2409-2423. [11]托尔夫波.表观遗传学实验手册[M】.吴超群,薛京伦,黄 蔚,等,译.上海:上海科学技术出版社,2007:220—233. [12】YegnasubramanianS,LinX,HaffnerMC,et01.Combi— nationofmethylated——DNAprecipitationandmethyla- tion-sensitiverestrictionenzymes(C0MPARE—MS)for therapid,sensitiveandquantitativedetectionof DNAmethylation[J].NucleicAcidsRes,2006,34(3): el9. 【13】ShiraishiM,SekiguchiA,OatesAJ,et01.Methyl— CpGbindingdomaincolumnchromatographyasatool fortheanalysisofgenomicDNAmethylation[J].Ana Biochem,2004,329(1):l一10. [14]OkamotoA.ChemicalapproachtowardefficientDNA methylationanalysis[J[.OrgBiomolChem,2009,7(1): 21—26. 【15】OginoM,TayaY,FujimotoK.Highlyselectivede— tectionof5——methylcytosineusingphotochemicalliga-- tion[J].ChemCommun(Camb),2008,(45):5996-5998. [16】ShamesDS,MinnaJD,GazdarAF.Methodsforde— tectingDNAmethylationintumors:frombenchto bedside[J[.CancerLett,2007,251(2):187—198. 【17]GonzalgoML,JonesPA.Rapidquantitationofmethy— lationdifferencesatspecificsitesusingmethylation—sen— sitivesinglenucleotideprimerextension(Ms—SNuPE)[J]. NucleicAcidsRes,1997,25(12):2529—2531 [18]E1-MaarriO,HerbiniauxU,WalterJ,et01.Arapid, quantitative,non—radioactivebisulfite-SNuPE—IPRP HPLCassayformethylationanalysisatspecificCpG sites[J[.NucleicAcidsRes,2002,30(6):e25. 【19]TostJ,SchatzP,SchusterM,et.Analysisand accuratequantificationofCpGmethylationbyMALDI massspectrometry[J[.NucleicAcidsRes,2003,31(9): e50 【20】EadsCA,DanenbergKD,KawakamiK,et01.Methy— Light:ahigh-throughputassaytomeasureDNAmethy— lation[J[.NucleicAcidsRes,2000,28(8):E32. f2JCampanM,WeisenbergerDJ,TrinhB,etcd.i~lethy— Light[J[.MethodsMolBiol,2009.507:325-337. [22]HermanJG,GraftJR,My6hanenS,eto1.Methyla一 ? 295? tion—specificPCR:anovelPCRassayformethylation statusofCpGislands[J[.ProcNatlAcadSciUSA, 1996,93(18):9821—9826. 【23]WangX,ZhangC,ZhaugL,et01.High—throughput assayofDNAmethylationbasedonmethylation—spe? cificprimerandSAGEfJ].BiochemBiophysRes Commun,2006,341(3):749—754. 【24]KristensenLS,MikeskaT,KrypuyM,et.Sensi? tiveMeltingAnalysisafterRea1.rime—MethylafionSpe- cificPCR(SMART—MSP):highthroughputandprobe- fleequantitativeDNAmethylationdetection[J].Nucle— icAcidsRes,2008,36(7):e42. [25]NygrenAO,AmezianeN,DuarteHM,et.Methy— lation—specificMLPA(MS—MLPA):simultaneousdetec. tionofCpGmethylationandcopynumberchangesofup to40sequences[J[.NucleicAcidsRes,2005,33(14): e128. [26]LjL,LiCT,LiRY,eta1.SNPgenotypingbymul— tiplexamplificationandmicroarraysassayforforensic application[J[.ForensicSciInt,2006,162(1-3):74—79. f27】WeisenbergerDJ,DenBergVanD,PanF,et. ComprehensiveDNAMethylationAnalysisontheIllu— mina@Infinium@AssayPlatform. 2008[EB/OL?